TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ BỘ MÔN SINH HỌC THỰC NGHIỆM ĐỀ TÀI: ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG VIỆC XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM RAU XANH SAU THU HOẠCH TẠI PHƯỜNG KHÁNH XUÂN, THÀNH PHỐ BUÔN MA THUỘT Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trinh Lớp: Cử nhân sinh K11 Chuyên ngành: Vi sinh – Sinh hóa Đắk Lắk, ngày 09 tháng 10 năm 2014 MỤC LỤC Contents MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam nước phát triển với tảng nước nơng nghiệp Từ nước có hàng ngàn người chết nạn đói năm 1968 Đến nay, Việt Nam nước có số lượng nơng sản xuất đứng đầu giới Đắk Lắk nói chung phường khánh xuân nói riêng, trung tâm sản xuất nông nghiệp vùng tây nguyên Từ nhiều năm nay, khu vực sản xuất rau an toàn tổ dân phố 12 thuộc hợp tác xã Nơng nghiệp Thuận Hịa (Phường Khánh Xuân, TP Buôn Ma Thuột) trở thành nơi tin cậy nhiều người tiêu dung, nhà nghiên cứu khoa học nhà quản lý sản xuất nơng nghiệp Tổ sản xuất rau an tồn thuộc HTX Nơng nghiệp Thuận Hịa thành lập tháng năm 2008 với số hội viên ban đầu 28 hộ nơng dân có tổng diện tích đất sản xuất 5,6 ha, đến nay, số hội viên HTX tăng lên 44 hộ với tổng diện tích 6,6 [1][6] Số diện tích đất sản xuất rau tăng lên đồng nghĩa với lượng phế phụ phẩm sản xuất nông nghiệp tăng lên Lượng phế phụ phẩm nông nghiệp sau thu hoạch người nông dân sử dụng dung dung để đun nấu phần nhỏ dung để sản xuất phân xanh Tuy nhiên, hầu hết hộ dân chuyển sang dung loại nguyên liệu khác như: than, gas, điện… Đặc biệt, vào mua mưa lúc gặp dịch bệnh, lượng phế phụ phẩm tăng lên nhiều Lượng phế phụ phẩm nhiều, người dân không kịp xử lý chúng tự phân hủy gây mùi thối khó chịu làm ô nhiễm môi trường tọa điều kiện cho vi sinh vật gây bệnh cho hoa màu phát triển, gây ảnh hưởng đến hiệu vụ canh tác Để góp phần vào việc giúp đỡ người nông dân xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp sau thu hoạch, thực đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng vi khuẩn Bacillus Subtilis việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch phường Khánh Xuân, Thành phố Buôn Ma Thuột” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus subtilis tuyển chọn chế phẩm sinh học xử lý nước thải Nhật Bản đánh giá khả xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch vi khuẩn Bacillus subtilis Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học Đánh giá khả xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch (gốc rau rau bị hỏng) vi khuẩn Bacillus subtilis chế phẩm sinh học xử lý mơi trường Nhật Bản, từ bổ sung thêm nhóm vi khuẩn có giá trị vào việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh phường Khánh Xuân, TP Buôn Ma Thuột 3.3.Ý nghĩa thực tiễn Việc nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả xử lý phế phẩm rau xanh góp phần quan trọng việc giảm ô nhiễm môi trường hạn chế mầm bệnh phát triển khu sản xuất rau an tồn phường khánh xn, từ bảo vệ mơi trường cải thiện tình hình sản xuất nông nghiệp Giới hạn đề tài Trong trình thực hiện, lý kinh phí có hạn nên đề tài khơng thể thực lặp lại thí nghiệm nhiều lần Địa điểm tiến hành thí nghiệm khu sản xuất rau an tồn thuộc HTX Thuận Hòa, tổ dân phố 12, phường Khánh Xuân, TP Buôn Ma Thuột PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát phường Khánh Xuân 1.1.1 Điều kiện tự nhiên  Vị trí địa lý: Diện tích: tổng diện tích tự nhiên 21,88 km Phường Khánh Xuân thành lập ngày 21, tháng 1, năm 1995 Tọa độ: 12o38’34”B 107o59’17”Đ Phía Đơng tiếp giáp phường Ea Tam, thành phố Bn Ma Thuột Phía Tây tiếp giáp xã Hịa Xn, thành phố Bn Ma Thuột Phía Nam giáp xã Hịa Khánh, thành phố Bn Ma Thuột Phía Bắc giáp Phường Tân Thành, thành phố Bn Ma Thuột  Địa hình, địa chất Phường Khánh Xn có địa hình tương đối gồ ghề có hướng nghiêng dần từ • • - Đơng sang Tây Đất nâu vàng đá Bazan thích hợp với nhiều loại công nghiệp hàng năm lâu năm Đất đỏ vàng đá phiến sét Đất đen sản phẩm đá Bazan  Khí hậu, thủy văn: Phường Khánh Xuân nằm vùng khí hậu cận nhiệt đới, khí hậu gió mùa, năm có hai mùa rõ rệt, mùa mưa tháng đến tháng 10 mùa nắng tháng 11 đến tháng năm sau Các thơng số điều kiện khí hậu phường Khánh Xuân trung tâm dự báo khí tượng thủy văn tỉnh Đắk Lắk ( trạm Bn Ma Thuột), ghi nhận từ năm 2004 – 2006 sau: + Nhiệt độ, độ ẩm: Nhiệt độ bình quân khoảng 23,6 oC Độ ẩm bình quân 84%, thấp 71% Về mùa khơ khơng khí thường khơ hạn + Lượng mưa: Lượng mưa bình quân hàng năm khoảng 1.900-2.000 mm tập trung vào mùa mưa (90%) Lượng mưa phân bố không đều, ảnh hưởng đến sản xuất sản xuất nông nghiệp sinh hoạt nhân dân + Hệ thống sơng suối: có suối Ea Knia suối Ea Tam + Hệ thống Hồ, Đập: có hồ Thống Nhất, hồ Đồi Thơng đập Giò Gà 1.1.2 Điều kiện kinh tế xã hội  Dân số: Năm 1999 phường Khánh Xuân có khoảng 21583 người Hiện nay, dân số phường có khoảng 23.444 người với mật độ 986 người/km2 ‘ Trên địa bàn phường có 16 thơn, bn có dân tộc anh em chung sống, dân tộc Kinh Ê Đê Người dân chủ yếu sống nghề nông (lúa, cà phê, hoa màu)  Đất đai: Tổng diện tích đất tự nhiên: 2.184 Trong phân ra: - Đất nơng nghiệp: 1.216,00 • Đất trồng năm: 653,02 • Đất trồng lâu năm: 562,98 - Đất lâm nghiệp: 64 • Rừng tự nhiên: • Rừng trồng: 38,8  Nơng nghiệp: Tổng diện tích đất gieo trồng năm 1.673 Trong trồng loại sau: Bảng 1: Các loại trồng sản lượng hàng năm phường Khánh Xuân TT TÊN CÁC LOẠI CÂY TRỒNG SỐ LƯỢNG/ SẢN LƯỢNG HÀNG NĂM Cà phê 990 Tiêu 84 Điều 112,8 Lúa 2.628 Rau loại 3.300 Hoa màu 45 ha/270 Chăn nuôi: Bảng 2: Các loại vật nuôi sản lượng năm phường Khánh Xuân TÊN CÁC LOẠI VẬT NUÔI TT SỐ LƯỢNG/ SẢN LƯỢNG HÀNG NĂM Heo 700.000 kg Gà 180.000 kg Bò 375.000 kg Ong 1.075 thùng Cá 90.000 kg Bảng 3: Các đại lý, hàng cung cấp thức ăn chăn ni, thuốc thú y, thủy sản, phân bón T T TÊN ĐỊA CHỈ ĐIỆN THOẠI HTX NN Thuận Hòa TDP 0500.3868631 HTX NN Thống Nhất TDP 05003827402 1.2 Phế phụ phẩm nông nghiệp 1.2.1 Khái niệm  Khái niệm: Phế phụ phẩm nông nghiệp bao gồm tàn dư thực vật để lại sau thu hoạch sản phẩm trồng trọt phế thải sau q trình chế biến nơng sản bao gồm hợp chất hydratcacbon, protein, photpho khó tan số hợp chất hữu khác Sản phẩm sau q trình phân hủy ngồi tác dụng cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho trồng cịn có khả làm cho đất tơi xốp, cải thiện đặc tính đất, khả giữ nước 1.2.2 Các phương pháp xử lý: Phế phụ phẩm sản xuất nông nghiệp bao gồm phế phụ phẩm sau thu hoạch phế phụ phẩm sau chế biến Lượng phế phụ phẩm thải ngày nhiều Ở nhiều nơi đồng sông cửu long, lượng phé phụ phẩm thải nhiều mà người dân khơng có biện pháp xử lý gây tượng nhiễm nghiêm trọng Có nhiều biện pháp để xử lý loại phế phụ phẩm nông nghiệp tùy thuộc vào loại phế phụ phẩm thải Tuy nhiên, biện pháp mang tính khu vực, phụ thuộc vào tập quán sản xuất người dân  Dùng Làm thức ăn cho gia súc: Các loại phế phụ phẩm rơm rạ, thân bắp, mì… thường người dân sử dụng để làm thức ăn cho loại trâu bò  Dùng làm nguyên liệu để đun nấu: Ở số vùng quê nghèo, người dân thường dùng rơm rạ hay vỏ trấu để đun nấu phục vụ cho sống ngày  Dùng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ: Các loại phế phẩm rơm rạ, vỏ cà phê, thân bắp… sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu khu vực nhỏ Tuy nhiên, số lượng lớn phế phẩm không sử dụng, đặc biệt phế phụ phẩm rau xanh Chúng thường người dân đem đổ bỏ sau thu hoạch, phân hủy chúng tạo mùi thối khó chịu gây nhiễm mơi trường 1.3 Vi sinh vật dùng xử lý 1.3.1 Các nhóm vi sinh vật  Các vi khuẩn hiếu khí: Chủ yếu vi sinh vật thuộc chi Arzotobacter, Achromobacter, Pseudomonas, Cellumonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus, Cytophaga, Angiococcus, Polyangium…  Các vi khuẩn kị khí: Điển hình vi khuẩn có dày động vật nhai lại vi khuẩn thuộc chi Ruminococcus flavefeciens, R albus, R parvum, Bacteroides succinpgenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium cellobioparum, Cillobacterium cellulosolvens…  Các xạ khuẩn hiếu khí: Là vi khuẩn thuộc chi Micromonospora, Proactinomyces, Actinomyces, Streptomyces…  Các nhóm vi nấm: Nẩm nhóm có khả phân giải mạnh tiết mơi trường lượng lớn enzymes có đầy đủ thành phần Ví dụ Nấm mốc ( thuộc chi: Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium…), Nấm đốm (ví dụ lồi: Ceratocystis sp, Cladosporium sp, Aureobasidium sp, …), Nấm mục (là loại nấm thuộc chi: Chaetomium, Humocola Phialophora).[2] 1.3.2 Vi sinh vật phân giải cenlulose Cenlulose thành phần chủ yếu tế bào thực vật Cenlulose hợp chất bền vững, loại polysaccharide cao phân tử Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật sinh men xúc tác cho trình phân giải cenlulose Chúng có ý nghĩa lớn việc thực vịng tuần hồn Cacbon tự nhiên, góp phần quan trọng việc nâng cao độ phì nhiêu đất Cenlulose bị phân giải vi sinh vật hiếu khí điều kiện thống khí Ngồi ra, cịn có số vi khuẩn kỵ khí có khả tham gia vào q trình phân giải cenlulose Ví dụ loài vi khuẩn: Cytophaga, Cellulomonas, giống Bacillus, giống Clostridium, Aspergillus, Penicillium…  Cơ chế phân giải cenlulose:[3] Chất hữu thành phần quan trọng trình hình thành làm thay đổi độ phì đất Sự chuyển hóa chất hữu đất chủ yếu theo hai hướng vô hóa chất hữu mùn hóa vật chất hữu Cenlulose bị VSV phân hủy thành thành phần có phân tử lượng nhỏ Chính thành phần nhỏ kết hợp với thành phần khác đất tạo mùn Khi mùn tạo thành, VSV lại tiếp tục phân hủy mùn trình amon hóa, chuyển háo giúp đất tích lũy NH 3, trình tạo thành NH3 đất xảy chậm chạm, điều có lợi cho trồng q trình giải phóng từ từ NH cho hấp thụ: Chất mùn + O2 + Vi sinh vật  CO2 + H2O + NH3 1.4 Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.4.1 Lịch sử phát Bacillus subtilis phát lần vào năm 1835 Christion Erenberg ông dặt tên cho loài vi khuẩn “Vibrio subtilis” Hơn 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn “Bacteridium” Đến năm 1872, Ferdimand Cohn quan sát lồi vi khuẩn có đầu hình vuông đặt tên Bacillus subtilis Năm 1941, tổ chức y học Nazi Đức phát vi khuẩn Bacillus subtilis phân ngựa Lúc đầu chủ yếu dùng phòng bệnh lỵ cho binh sĩ Đức chiến đấu Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến năm 1949-1957, Henry cộng tách chủng vi khuẩn Bacillus subtilis khiết Từ đó, “thuốc subtilis” hay cịn gọi “subtilis therapy” đời sản xuất hàng loạt dùng diều trị chứng viêm đại tràng, viêm ruột, chống tiêu chảy rối loạn tiêu hóa Ngày nay, vi khuẩn trở nên phổ biến, sử dụng rộngrãi y học, thực phẩm, chăn nuôi.[4] 1.4.2 Đặc điểm phân loại, phân bố đặc điểm sinh thái học vi khuẩn Bacillus subtilis  Đặc điểm phân loại: Theo phân loại Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc: 10 1.4.6 1.4.6.1 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Cấu tạo bào tử Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,8 – 1,8µm Phía ngồi bào tử lớp màng, lớp màng vỏ Vỏ bào tử có nhiều lớp Đây lớp có tác dụng ngăn cản thẩm thấu nước chất hòa tan nước Bên lớp vỏ lớp màng bào tử khối tế bào chất đồng Trong bào tử tự không xảy trao đổi chất, giử trạng thái tiềm sinh nhiều năm Bào tử khác tế bào dinh dưỡng cấu trúc, thành phần hóa học tính chất sinh lý [4] 1.4.6.2 Khả tạo bào tử Một đặc điểm quan trọng Bacillus subtilis khả tạo bào tử điều kiện định Bacillus subtilis có khả hình thành bào tử theo chu kì phát triển tự nhiên vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi ( dinh dưỡng môi trường sống bị kiệt quệ) Bào tử phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm khơng tâm Chúng phát tán rộng rãi, tạo vào cuối thời kì sinh sản vi khuẩn Quá trình hình thành bào tử bao gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng vi khuẩn Bacillus subtilis cần khoảng để hoàn tất trình hình thành bào tử Ban đầu khối nguyên sinh chất tế bào sử dụng Tế bào chất nhân tập trung vị trí định tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại tạo thành tiền bào tử (Prospore) Tiền bào tử bắt đầu bao bọc dần lớp màng Tiền bào tử phát triển trở thành bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải bào tử giải phóng khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử hút nước bị trương Sau đó, vỏ chúng bị phá hủy bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào Mỗi tế bào dinh dưỡng tạo bào tử nên hình thức sinh sản vi khuẩn mà hình thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua điều kiện sống bất lợi[4] 1.4.7 Hệ enzymes vi khuẩn Bacillus subtilis 13 Trong tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis, vi sinh khác có enzymes xúc tác cho phản ứng sinh hóa Các enzyme sinh tổng hợp nằm sinh khối tế bào Các enzyme thường khơng có kkhar di chuyển qua màng tế bào, chúng dược gọi enzyme nội bào Các enzyme nội bào vi khuẩn Bacillus subtilis bao gồm: enzyme thủy phân protease nội bào, penicillin amidase, catalase, amylase nội bào…; Các enzyme tổng hợp aspagagin-syntetase; Các enzyme tham gia vào q trình oxy hóa – khử Dehydrogenase, Oxydase, Cytochrom, Peroxydase enzyme tham gia chuyển hóa vật chatas có tế bào Ngồi ra, Bacillus subtilis cịn sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho trình sống để thích nghi với điều kiện mơi trường gọi enzyme ngoại bào Chúng bao gồm enzyme như: amylase (α-amylase), β-glucanase, xylanase, protease…[5] Bảng 6: Các enzymes vi khuẩn Bacillus subtilis Enzyme Nhiệt độ tối pH tối ưu ưu (oC) α-amylase 35-55 6,0 – 7,0 Xylanase 25 5,0 Protease 40 Thủy phân liên kết α-1,4-glucoside tinh bột polysaccharide khác, tạo dextrin oligosaccharide Thủy phân lien kết β-1,6-glucoside βglucan tạo chất có phân tử lượng thấp Thủy phân lien kết xylan – thành phần hemicellulose Thủy phân lien kết peptide, protein polypeptide, tạo peptide có phân tử lượng thấp amino axit 5,6 – 6,2 β-glucanase 1.4.8 70-80 Phản ứng thủy phân 6,2 – 7,4 Bộ gen vi khuẩn Bacillus subtilis Trình tự gen vi khuẩn Bacillus subtilis nghiên cứu giải mã thành công công bố lần năm 1997 Bộ gen vi khuẩn chứa 4,2Mb, xấp xỉ 4.110 gen Trong đó, có 192 gen khơng thể thiếu được, có 79 gen dự đoán thiêt yếu Phần lớn gen thiết yếu có liên quan tới q trình trao đổi chất tế bào.[4] 1.5 Tình hình nghiên cứu 1.5.1 Tình hình nghiên cứu nước 14 Việc xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp quan tâm, có nhiều nghiên cứu để xử lý tái sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp Năm 2010 Nguyễn Duy Khang chủ nhiệm đề tài nghiên cứu sản xuất giá thể trồng hoa lan từ phế phụ phẩm nông nghiệp Lâm Đồng Các nhà sinh học viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt hồn thiện quy trình [6] Nhóm nghiên cứu sử dụng loại phế phẩm bã mía, lõi ngơ, vỏ đậu phộng, vỏ cà phê… tận dụng sản xuất phân hữu nhờ chủng vi sinh vật ưa nhiệt, có khả phân giải phế phụ phẩm thành giá thể trồng hoa, không hoa địa lan mà cịn trồng nhiều loại hoa loại cảnh khác thay cho giá thể truyền thống Hiện đề tài tiếp tục phát triển theo hướng dự án thử nghiệm sản xuất diện rộng để đáp ứng nhu cầu bà nông dân Tại Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ diễn Đại học Đà Nẵng năm 2010 sinh viên trường Đại học Bách Khoa báo cáo đề tài nghiên cứu sử dụng phế phẩm nông nghiệp để chế tạo Panel cách nhiệt sử dụng dân dụng công nghiệp[7] Các panel sản xuất thủ cơng chất lượng thẩm mỹ sử dụng đượctrong cơng nghiệp đời sống sử dụng vào nhiều mục đích khác la phơng, trang trí trần… đề tài ý nghĩa thực tiễn cao Năm 2013 Trần Thị Tâm, Lương Hữu Thành, Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản, Phạm Bích Hiên nghiên cứu sử dụng vi sinh vật làm tác nhân sinh học xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp[8] Kết nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis, Streptomyces hygroscopicus, Bacillus polyfermenticus Bacillus velezensis lựa chọn từ microbial di truyền nguồn lực viện thổ nhưỡng Nơng hóa cá thể phá vỡ hợp chất hữu cellulose, tinh bột, lexetin protein, cân nặng phế thải nông nghiệp giảm 60-70% sau 60 ngày xử lý vi sinh vật 15 PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng địa điểm tiến hành nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu: + Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ chế phẩm xử lý nước thải Nhật Bản + Phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch thu tổ sản xuất rau an toàn thuộc HTX Thuận Hòa, tổ dân phố 12, phường Khán Xuân, thành phố Buôn Ma Thuột  Địa điểm tiến hành nghiên cứu: + Phịng thí nghiệm Vi sinh thuộc môn Sinh học thực nghiệm, khoa KHTN & CN, trường Đại học Tây Nguyên 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus subtilis có khả xử lý phế thải nơng nghiệp chế phẩm sinh học -Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus subtilis -Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis + Môi trường nuôi cấy + Nhiệt độ + Độ pH + Tốc độ lắc -Nghiên cứu số yếu tố ảnh đến khả xử lý phế phụ phẩm rau xanh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tuyển chọn + Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn xử lý + Ảnh hưởng thời gian xử lý 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp thu mẫu Mẫu phế phụ phẩm rau xanh thu gom vườn rau số hộ dân thuộc khu sản xuất rau an toàn thuộc HTX Thuận Hòa Sau thu gom, ta trộn thứ thu chia thành đống nhỏ để tiến hành nghiên cứu Phương pháp phân lập vi khuẩn từ chế phẩm sinh học xử lý nước thải Lấy 1g mẫu chế phẩm sinh học pha loãng nước muối sinh lý; Cấy trải 2.3.2 môi trường dinh dưỡng MPB, ủ 37 oC Sau 24 giờ, thu khuẩn lạc đơn, cấy ria khuẩn lạc môi trường thạch nghiêng Làm khiết khuẩn lạc sau nhiều lần cấy ria 16 đĩa thạch Đánh dấu kí tự chủng vi khuẩn Quan sát, mơ tả hình thí khuẩn lạc dịng vi khuẩn phân lập 2.3.3 Phương pháp đánh giá khả sử dụng oxy vi khuẩn phân lập Nguyên tắc: dựa nhu cầu khác vi khuẩn oxy Căn vào quan hệ oxy, vi khuẩn chia thành nhóm lớn sau: Hiếu khí bắt buộc: vi khuẩn sinh trưởng bề mặt lớp ống môi trường Vi hiếu khí: vi khuẩn sinh trưởng cách bề mặt mơi trường Kỵ khí khơng bắt buộc: vi khuẩn phát triển dọc theo chiều dài ống môi trường Kỵ khí bắt buộc: vi khuẩn phát triển đáy ống mơi trường Dựa vào vị trí phân bố ống môi trường để xác định nhu cầu oxy vi khuẩn phân lập[11] Cách tiến hành: - Chuẩn bị ống giống vi khuẩn Bacillus subtilis môi trường MPB lỏng (cao thịt 3g, - pepton 10g, NaCl 5g, nước cất 1000ml; khử trùng áp suất 1atm 30 phút) Tạo ống chứa khoảng ½ môi trường MPB đặc để xác định nhu cầu oxy vi khuẩn Bacillus subtilis Sau khử trùng, không tạo thạch nghiêng, để ống nghiệm thẳng - đứng Dùng que cấy đầu nhọn nhúng vào dung dịch giống cấy giống vào đến đáy ống thạch đứng Chú ý: cấy giống vào môi trường thạch chưa đông cứng Tất thao tác thực box cấy vơ trùng Thí nghiệm lặp lại ba lần Sau 20 ngày, quan sát chụp hình kết cách diện chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ống thạch đứng để đánh giá nhu cầu oxy 2.3.4 Phương pháp định danh vi khuẩn tuyển chọn 2.3.4.1 Phương pháp xác định hình thái, tính gram Phương pháp xác định hình thái kích thước khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn tuyển chọn phương pháp vi sinh truyền thống Phương pháp đo kích thước tế bào: dùng thước đo thị kính thước đo vật kính quan sát kính hiển vi quang học Thước đo thị kính miếng thủy tinh trịn, có thước nhỏ mm chia thành 100 phần đánh số 17 từ − 100 Thước đo vật kính thuỷ tinh, có thước nhỏ 1mm chia thành 100 khoảng nhau, khoảng chia 0,01mm hay 10 µm Xác định giá trị khoảng thước đo thị kính Tiến hành đo kích thước theo trình tự sau: - Đặt tiêu có vi sinh vật cần đo lên bàn kính Điều chỉnh bàn kính cho thấy rõ tế bào vi sinh vật thước đo thị kính - Điều chỉnh bàn kính cho tế bào vi sinh vật nằm gọn dọc theo thước đo thị kính - Đếm số khoảng mà tế bào vi sinh vật choán chỗ, nhân với giá trị khoảng Phương pháp xác định tính gram chủng vi khuẩn tuyển chọn Làm tiêu mẫu cần nhuộm Cố định mẫu lửa đèn cồn Dùng phương pháp nhuộm gram để xác định - Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu tẩy phức chất màu Crystal violet iốt (trong dung dịch Lugol) Kết bắt màu tím - Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung môi tẩy màu thuốc nhuộm đầu, bắt màu thuốc nhuộm bổ xung (đỏ vàng với safranin, đỏ tía với Fuchsin) 2.3.4.2 Phương pháp định danh sinh học phân tử Mẫu gửi đến Công ty Nam Khoa, Tại địa 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, quận 7, thành phố Hồ Chí Minh 2.3.5 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng vi khuẩn Lấy 0,1ml chủng vi khuẩn tuyển chọn nuôi 10ml môi trường MPB lỏng đánh giá sinh trưởng vi khuẩn qua phương pháp đo độ đục [9] (OD 610nm) dung dịch nuôi cấy vào thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 Dựa nồng độ OD thời gian nuôi cấy chủng lập đồ thị đường cong sinh trưởng cho chủng tuyển chọn Mỗi thời điểm khảo sát lặp lại lần 2.3.6 Phương pháp xây dựng đường cong tuyến tính nồng độ vi khuẩn số OD 610nm Nhân nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis môi trường MPB Xác định độ đục dung dịch vi khuẩn độ pha loãng khác Tại độ pha lỗng dung dịch có OD cấy trãi môi trường thạch đĩa Đếm số khuẩn lạc đĩa môi 18 trường độ pha loãng Mỗi độ pha loãng lặp lại đĩa peptri Kết tính sau: Trong đó: - A : Số tế bào vi khuẩn mẫu ban đầu N : Tổng số khuẩn lạc đếm n : Số đĩa có khuẩn lạc đếm nồng độ pha lỗng ( đĩa có số khuẩn lạc 25 – 250) - v : Dung tích mẫu cấy vào đĩa - fi : Độ pha loãng có số khuẩn lạc chọn đĩa đếm Dựa vào phương trình tương quan để xác định nồng độ tế bào vi khuẩn dung dịch thông qua số OD 610nm 2.3.7 Phương pháp nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển vi khuẩn tuyển chọn 2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng nuôi cấy Nghiên cứu môi trường nuôi cấy sau: + Môi trường MPB (Cao thịt –Pepton) : NaCl 5g, pepton 10g, cao thịt 3g, nước cất 1000ml + Môi trường nước mắm – Pepton : nước mắm 20ml, pepton 10g, nước cất 980ml + Môi trường YEM : cao nấm men 1g, mannitol 10g, K2HPO4 0,5g, MgSO4.7H2O 0,2g, NaCl 0,1g, nước cất 1000ml Khử trùng môi trường 1210C, 20 phút Lấy 1ml giống chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tuyển chọn vào bình có chứa 50 ml mơi trường, loại môi trường lặp lại lần Đánh giá thích hợp vi khuẩn với mơi trường ni cấy qua đo độ đục (OD 610 nm) môi trường sau thời gian nuôi cấy ngày Lưu ý thí nghiệm thực box cấy vơ trùng OD cao chứng tỏ mơi trường thuận lợi chủng vi khuẩn tuyển chọn Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ Lấy 0,1ml dung dịch vi khuẩn Bacillus subtilis lựa chọn cho vào 10ml môi 2.3.7.2 trường với nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 40 0C Sau ngày nuôi cấy, thông qua đo độ đục (đo OD 610nm) để đánh giá khả thích ứng vi khuẩn OD cao 19 nhiệt độ thuận lợi cho phát triển vi khuẩn lựa chọn Thí nghiệm lặp lại lần 2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng độ pH Lấy 0,1ml dung dịch vi khuẩn lựa chọn cho vào ống nghiệm có chứa 10ml mơi trường dinh đưỡng có độ pH khác nhau: 5, 6, 7, mẫu đối chứng Đánh giá khả thích ứng vi khuẩn qua số OD (610nm) sau ngày nuôi cấy OD cao độ pH thuận lợi cho phát triển vi khuẩn lựa chọn Thí nghiệm lặp lại lần 2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ lắc Lấy 0,1 ml dung dịch vi khuẩn Bacillus subtilis lựa chọn cho vào 50ml môi trường dinh dưỡng phù hợp với tốc độ lắc khác nhau: 100, 150, 200 vịng/phút Sau ngày ni cấy, thơng qua đo độ đục (đo OD 610nm) đánh giá khả thích ứng vi khuẩn OD cao tốc độ lắc thuận lợi cho phát triển vi khuẩn lựa chọn.Thí nghiệm lặp lại lần 2.3.8 Phương pháp nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng vi khuẩn đến gốc rau 2.3.8.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả xử lý Lấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tuyển chọn, sau nhân giống, đem pha lỗng với mơi trường nhân giống MPB nồng độ khác nhau, độ pha loãng đem đo OD, dựa phương trình tương quan mật độ tế bào với OD từ suy mật độ tế bào độ pha loãng khác Tiến hành lấy 20ml giống pha loãng nồng độ khác nhau, bỏ vào đống gốc rau, đống có cân nặng khoảng 15kg trộn Lơ đối chứng gồm lô, lô không cho vi khuẩn vào lô cho chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đề tài sinh viên Nguyễn Thị Duyên Anh, lớp Cử nhân Sinh học K10 Sau ngày xử lý, thu mẫu, xác định khối lượng gốc rau lại sau xử lý Thí nghiệm lặp lại lần 2.3.8.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thời gian xử lý đến khả xử lý vi khuẩn Chủng vi khuẩn theo dõi lơ thí nghiệm sau: Lô 1: Thời gian xử lý ngày Lô 2: Thời gian xử lý 10 ngày Lô 3: Thời gian xử lý 15 ngày Lô 4: Đối chứng (không sử dụng vi khuẩn) 20 Lấy 20ml dung dịch vi khuẩn Bacillus subtilis tuyển chọn, cho vào đống gốc rau, đống khoảng 15kg Thí nghiệm lặp lại lần Dung dịch vi khuẩn cho vào đống lô phải đồng Vào thời điểm nghiên cứu lô, thu mẫu xác định khối lượng lại sau xử lý 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu xử lý phần mềm thống kê SPSS 16.0 Đồ thị tương quan phương trình tương quan mật độ tế bào số OD xử lý phần mềm Excel 2010 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO http://baodaklak.vn/channel/3483/201301/rau-an-toan-huong-di-ben-vung-cho-nong-dan2214713/ http://text.123doc.vn/document/1074208-phan-huy-phe-phu-pham-nong-nghiep-thanhphan-huu-co-vi-sinh.htm http://text.123doc.vn/document/572417-dac-diem-cua-cac-qua-trinh-phan-giai-o-vi-sinhvat-doc.htm http://luanvan.co/luan-van/phan-lap-khao-sat-dac-diem-cua-vi-khuan-bacillus-subtilis-vatim-hieu-kha-nang-sinh-enzyme-protease-amylase-cua-vi-khuan-2428/ http://www.zbook.vn/ebook/tong-quan-ve-enzyme-ngoai-bao-bacillus-subtilis-39169/ http://tailieu.vn/doc/nghien-cuu-su-dung-cac-phe-pham-nong-nghiep-de-che-tao-tampanel-cach-nhiet-su-dung-trong-dan-dung-v-462978.html http://tailieu.vn/doc/bao-cao-nghien-cuu-su-dung-vi-sinh-vat-lam-tac-nhan-sinh-hoc-xuly-phe-phu-pham-nong-nghiep-1537965.html 10 http://www.thongtinkhcndaklak.vn/Trangch%E1%BB%A7/T%E1%BB %95ngquan/tabid/338/language/vi-VN/Default.aspx Tài liệu nước ngoài: 11 Harry P Rappaport, “A Bacillus Subtilis Proteinase”, The Journal of Biological Chemistry, (1965), Vol 240, No 22 ... lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch phường Khánh Xuân, Thành phố Buôn Ma Thu? ??t” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus subtilis tuyển chọn chế phẩm sinh học xử lý. .. giá khả xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch vi khuẩn Bacillus subtilis Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học Đánh giá khả xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch (gốc rau rau bị... hỏng) vi khuẩn Bacillus subtilis chế phẩm sinh học xử lý môi trường Nhật Bản, từ bổ sung thêm nhóm vi khuẩn có giá trị vào vi? ??c xử lý phế phụ phẩm rau xanh phường Khánh Xuân, TP Buôn Ma Thu? ??t