Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VĂN NAM TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VĂN NAM TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS. NGÔ ĐÌNH BÍNH THÁI NGUYÊN - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong công trình nghiên cứu khác. Thái Nguyên, ngày 18 tháng 10 năm 2012 Tác giả Nguyễn Văn Nam Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó. Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Ngô Đình Bính, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN. Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán bộ phòng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Vũ Thanh Thanh, các giảng viên cùng các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường và hoàn thành tốt luận văn của mình. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua! Thái Nguyên, ngày 18 tháng 10 năm 2012 Học viên Nguyễn Văn Nam Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Đại cương về Bacillus thuringiensis 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu Bacillus thuringiensis 3 1.1.2. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis 4 1.1.3. Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus 6 1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7 1.1.5. Protein tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7 1.1.6. Đặc điểm phân loại của Bacillus thuringiensis 8 1.1.7. Đặc điểm phân loại loài phụ Bti 8 1.1.8. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 8 1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bti 15 1.2.1. Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis var. israelensis 16 1.2.2. Cấu trúc phân tử nhân độc tố của Bti 17 1.2.3. Hoạt tính diệt côn trùng của Bti 18 1.2.4. Tác động của Bti đến các sinh vật khác 19 1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng trong nước và trên thế giới 19 1.3.1. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng trên thế giới 19 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 20 1.4. Tổng quan về côn trùng thử nghiệm 21 1.4.1. Phân loại khoa học của muỗi 21 1.4.2. Vòng đời của muỗi 23 1.4.3. Khả năng gây bệnh của muỗi 24 1.4.4. Sơ lược về côn trùng thử nghiệm: 24 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 29 2.1. Vật liệu 29 2.1.1. Sinh phẩm 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii 2.1.2. Hoá chất và môi trường 29 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 31 2.2. Phương pháp nghiên cứu 32 2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 32 2.2.2. Phương pháp xác định nồng độ bào tử 33 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 34 2.2.4. Kỹ thuật định typ huyết thanh 35 2.2.5. Khuyếch đại gen mã hóa độc tố bằng phản ứng PCR 35 2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 37 2.2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose 38 2.2.8. Phương pháp thôi gel 39 2.2.9. Phương pháp tách dòng gen cry4A, cry4B 40 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu lá 43 3.2. Sự đa dạng tinh thể của các chủng phân lập 44 3.3. Phân loại dưới loài của các chủng Bacillus thuringiensis 45 3.4. Thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của các chủng Bacillus thuringiensis 46 3.4.1. Xác định nồng độ bào tử 46 3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính 46 3.5. Phát hiện gen mã hóa protein diệt ấu trùng muỗi của chủng Bacillus thuringiensis phân lập 49 3.6. Tách dòng, đọc trình tự gen cry4A và cry4B 52 3.6.1. Tách dòng gen cry4A và gen cry4B 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chƣ̃ viết tắt Chƣ̃ viết đầy đủ 1 Bp Base pair – Cặp Base 2 Bt Bacillus thuringiensis 3 dH 2 O Deion water – Nước khử ion 4 DNA Deoxyribonucleotide acid – Axit Nucleic 5 ĐC Đối chứng 6 E. coli Escherichia coli 7 h Giờ 8 kDa Kilo Dalton 9 OD Optical density – mật độ quang học 10 PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp 11 SDS Sodium dodecyl sulphate 12 Sol Solution – Dung dịch tách triết DNA plasmid 13 TE Tris EDTA 14 X-gal 5-Bromo-4 Cloro-3 indolyl β-D galactoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus 6 Bảng 1.2: Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng 11 Bảng 1.2. Đặc điểm của một số protein độc tố Cry 13 Bảng 3.1. Thống kê số lượng chủng Bt phân lập được và hình dạng tinh thể của chủng phân lập. 44 Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của các chủng phân lập sau các khoảng thời gian khác nhau, ở các nồng độ khác nhau. 46 Bảng 3.3. Kết quả khuếch đại gen độc tố thuộc nhóm cry4 của các chủng phân lập 50 Bảng 3.5. So sánh trình tự ĐNT5.4-4B1 với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Blast 60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis 5 Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis 7 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc chung của một protein độc tố Cry 9 Hình 1.4. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng 12 Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển của muỗi 23 Hình 1.6. Muỗi Anopheles trưởng thành(A) và vòng đời của muỗi Anopheles(B) 25 Hình 1.7. Ấu trùng(A) và muỗi Aedes trưởng thành (B) 26 Hình 1.8. Muỗi Culex trưởng thành 27 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của chủng Bacillus thuringiensis phát triển trên môi trường MPA sau 72 giờ nuôi cấy. 43 Hình 3.2. Hình thái bào tử và tinh thể của chủng ĐNT8.1 chụp dưới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần. 44 Hình 3.3. Phản ứng ngưng kết của Bacillus thuringiensis var. israelensis với kháng huyết thanh. 45 Hình 3.4. Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của các chủng phân lập 49 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho gen Cry4A trên gel agarose1%. 51 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho gen cry4B trên gel agarose1%. 51 Hình 3.7. Hình ảnh khuẩn lạc xanh – trắng trên môi trường LBA 53 Hình 3.8. Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid các dòng khuẩn lạc biến nạp gen cry4A trên gel agarose 0,8 % 54 Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid trên gel agarose 0,8 % 55 Hình 3.10. Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen cry4A v cry4B từ các dòng plasmid tái tổ hợp: 56 Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự gen cry4A 59 Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự gen cry4B 62 1 MỞ ĐẦU Muỗ i là loài côn trùng truyền nhiều bệnh rất nguy hiểm . Các bệnh sốt rét, số t xuấ t huyế t , viêm nã o Nhậ t Bả n , sùi chân voi , giun chỉ do muỗ i truyề n thự c sự đã và đang đe dọ a sinh mạ ng của hàng triệu người. Hằng năm có khoảng 270 triệ u ngườ i mắ c bệ nh số t ré t , làm chết hàng triệu người. Hàng triệ u mắ c bệ nh sốt xuấ t huyế t và cá c bệ nh khác.  Việt Nam, theo số liệu của Tổ ng cụ c Thố ng kê, 9 tháng đầu năm 2012 cả nước có 51,3 nghìn trường hợp mắ c bệ nh số t xuấ t huyế t , trong đó 42 ca tử vong , 16 nghìn trường hợ p mắ c bệ nh số t ré t , 554 trườ ng hợ p mắ c bệ nh viêm nã o Nhậ t Bả n , trong đó 15 trườ ng hợ p tử vong (64). Có rất nhiều biện pháp hoá học và sinh học được áp dụng để khắc phục tình trạng trên. Tuy nhiên các biện pháp hoá học lại thường gây ra tính kháng thuốc trên côn trùng, cứ sau một khoảng gian rất ngắn thì thuốc hoá học lại không còn tác dụng đồng thời thuốc hoá học còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng và góp phần làm mất cân bằng sinh thái. Vì vậy, các biện pháp sinh học được khuyến khích sử dụng. Một trong các vi sinh vật được quan tâm và sử dụng nhiều nhất là vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Sở dĩ như vậy là do đặc tính sinh protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng gây hại như: Côn trùng bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh cứng Vi khuẩn Bacillus thuringiensis được ứng dụng để diệt côn trùng gây hại theo phương pháp: thuốc diệt trừ sinh học Bt. Việc nghiên cứu các hoạt tính diệt côn trùng của các chủng Bt phân lập ở Việt Nam đặc biệt là hoạt tính diệt muỗi, ruồi là hết sức cần thiết nhằm tìm ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ cho việc diệt ruồi, muỗi. Protein tinh thể độc Cry4A, Cry4B là hai trong nhiều protein có hoạt tính chống lại côn trùng bộ hai cánh. Xuất phát từ mục đích này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hoá [...]...2 protein diệt côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thuộc thành phố Nha Trang Mục tiêu của đề tài - Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh - Tách dòng gen cry4A, cry4B của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh - Đọc trình tự gen, so sánh với trình tự gen trên... ngân hàng gen quốc tế Nhiệm vụ của đề tài: - Phân lập các chủng Bccillus thuringiensis từ các mẫu đất thuộc thành phố Nha Trang - Sàng lọc các chủng Bt có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh - Phát hiện gen cry4A, cry4B bằng phương pháp PCR - Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng bộ hai cánh - Đọc trình tự gen cry4A, cry4B và so sánh với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế... Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại của các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu (ICP -Insecticidal Crystal Protein) ở các loài phụ Bt khác nhau Các phương pháp xử lý plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã chứng minh rằng các gen mã hoá protein diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid lớn có hệ số copy... được hơn 607 gen cry khác nhau thuộc về 70 nhóm ( từ cry1 - cry70) Mỗi nhóm gen lại có những đặc điểm và đặc tính khác nhau [10] 11 Bảng 1.2: Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng Hình dạng Trọng lượng phân Hoạt tính diệt tinh thể tử protein (kDa) côn trùng cry1A – 1M Lưỡng tháp 130 - 138 Cánh vảy Lepidoptera cry2A -cry2C Cầu 69 - 71 Cánh vảy Lepidoptera/ Gen Hai cánh Diptera... với cả hai loài thuộc bộ cánh vảy và bộ hai cánh [56] - Nhóm Cry3: Nhóm này gồm 17 protein thuộc các nhóm Cry3ACry3C, có khối lượng khoảng 73kDa, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh cứng [56] - Nhóm Cry4: Gồm 8 protein thuộc nhóm Cry4A -Cry4B tích lũy cả hai loại tinh thể có khối lượng khoảng 70kDa và 130kDa Nhóm này có hoạt tính với các loài thuộc bộ hai cánh Những protein này cùng với protein. .. cấu trúc gen 9 tự nhiên cho một số chủng Bacillus thuringiensis [21] Hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng [45] Trong một thời gian dài người ta cho rằng các protein tinh thể được mã hóa chung trên các plasmid lớn Khi sử dụng kỹ thuật lai ADN với các mẫu dò cho gen cry đã... proteaza thì: Protein 27 kDa bị phân hủy thành protein 25 kDa (cả 2 protein này đều có hoạt lực diệt côn trùng thấp) Protein 72 kDa bị phân hủy thành các tiểu phần 31 và 35 kDa, 2 tiểu phần này cũng có tác dụng diệt muỗi thấp Protein 78 kDa bị phân hủy thành nhân độc 58 kDa Protein 128 và 135 kDa bị phân hủy thành nhân độc 58 và 73 kDa [28] 17 Cấu trúc tinh thể cầu của Bti được tạo thành từ ba dạng thể... cứu chuyển gen diệt muỗi từ Bti vào tảo lam… 1.4 Tổng quan về côn trùng thử nghiệm Muỗi là một nhóm sinh vật thuộc lớp côn trùng hợp thành họ Muỗi Culicidae, bộ hai cánh [34] Chúng có một đôi cánh vảy, một đôi cánh cứng, thân mỏng, các chân dài Muỗi đực hút nhựa cây và hoa quả để sống, muỗi cái hút cả máu người và động vật Kích thước muỗi thay đổi theo loài nhưng thường không lớn hơn 15mm Đa số có trọng... Gonzalez thì plasmid có mặt trong hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis số lượng plasmid dao động từ 2 đến 12 trong các chủng nghiên cứu Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại các gen tổng hợp nhiều độc tố trong một tế bào Bacillus thuringiensis Chẳng hạn như trong Bacillus thuringiensis israelensis có 4 gen cry và 2 gen cyt mã hoá các protein Cry4Aa (125 kDa), Cry4Ab (135 kDa),... thể mà là protein tiết từ tế bào Độc tố Vip được phát hiện đầu tiên là Vip3A1 và Vip3A2 vào năm 1996 nhờ Estruch và cộng sự Gen vip3A mã hóa protein 88 kDa được tổng hợp trong suốt pha sinh dưỡng nhưng nó không được tiết ra ngoài Gen mã hóa protein Vip3A xuất hiện trong cả các chủng Bacillus thuringiensis và Bacillus cereus Protein này có hoạt tính đối với rất nhiều côn trùng gây hại thuộc bộ cánh vảy . TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG Chuyên ngành: Công. NAM TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG . nghiên cứu đề tài: Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hoá 2 protein diệt côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thuộc thnh phố Nha Trang . Mục tiêu