1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Chitosan (CTS) là một polysaccarit trong thiên nhiên rất phong phú và đa dạng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực vì an toàn cho con người và thân thiện với môi trường. CTS thường được chế tạo từ phản ứng deaxetyl chitin vỏ tôm, vỏ cua và mai mực mềm. Nhờ các tính năng ưu việt như không độc, tương hợp và phân hủy sinh học, kích kháng nên CTS được dùng nhiều trong công nông nghiệp, y học và dược phẩm. Do khối lượng phân tử (KLPT) CTS thường khá cao đã hạn chế khả năng tan trong môi trường trung tính và kiềm nên các ứng dụng của nó hầu như chỉ giới hạn ở môi trường axit. Để khắc phục nhược điểm đó, một trong những biện pháp thường dùng là cắt mạch CTS làm giảm KLPT và chế tạo oligochitosan để mở rộng và nâng cao hiệu quả sử dụng. Có 3 phương pháp chính thường dùng để làm giảm KLPT của CTS là cắt mạch bằng hóa học, enzym và chiếu xạ. Đa phần các nghiên cứu cắt mạch CTS là chỉ dùng các phương pháp một cách riêng rẽ. Việc kết hợp các phương pháp lại với nhau để nghiên cứu cắt mạch CTS là cần thiết và cấp bách. Đặc biệt là kết hợp kỹ thuật chiếu xạ gamma Co-60 với H 2 O 2 là vấn đề mới nhằm tạo ra bước đột phá gia tăng hiệu quả cắt mạch CTS. Mục tiêu, tính khoa học và thực tiễn của đề tài Dựa vào những cơ sở trên, mục tiêu của luận án đặt ra là nghiên cứu biến tính cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit và kỹ thuật chiếu xạ để ứng dụng trong nông nghiệp. Để thực hiện mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: cắt mạch CTS bằng H 2 O 2 ; cắt mạch bằng bức xạ gamma Co-60 đối với CTS dạng vảy không có và có oxi hóa trước bằng H 2 O 2 ; cắt mạch bằng bức xạ gamma Co-60 đối với CTS dung dịch không có và có sự 2 hiện diện của H 2 O 2 chế tạo oligochitosan; khảo nghiệm hiệu ứng kích kháng bệnh và tăng trưởng của oligochitosan đối với cây mía và cây lúa. Bố cục của luận án: Luận án gồm 189 trang có mở đầu, 4 phần, 9 chương, 37 bảng, 49 hình, 114 tài liệu tham khảo, 105 phụ lục. Trong đó, tổng quan 35 trang; thực nghiệm 17 trang; kết quả và thảo luận 74 trang; kết luận và kiến nghị 3 trang; các công trình công bố của tác giả, tài liệu tham khảo và phụ lục 60 trang. PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 1. Giới thiệu chung chitin/chitosan 1.1. Nguồn gốc chitin/chitosan Lượng chitin trong thiên nhiên ước tính 100 tỉ tấn/ năm, nhiều thứ hai sau celluloz, nó làm nhiệm vụ vỏ bảo vệ cơ thể cho các loài giáp xác. Chitin có ở nhiều loài khác nhau, từ các loại nấm đến vỏ tôm, vỏ cua, vỏ côn trùng, vỏ tế bào vi khuẩn, mai mực… Chitin tồn tại dưới ba dạng: -, -, và -chitin. Phổ biến nhất là -chitin vỏ tôm, cua và -chitin mai mực. 1.2. Cấu trúc của chitin/chitosan Hình 1.1. Cấu trúc của celluloz, chitin và chitosan 3 1.3. Tình hình nghiên cứu cắt mạch chitin/chitosan trên thế giới và trong nước 1.4. Tình hình sản xuất chitin/chitosan (CT/CTS) Chương 2. Công nghệ bức xạ và hóa học bức xạ 2.1. Công nghệ bức xạ (CNBX) và ứng dụng 2.2. Hóa học bức xạ của nước và dung dịch nước Chương 3. Một số phương pháp biến tính cắt mạch chitosan 3.1. Cắt mạch bằng enzym Chitosan có thể bị cắt mạch bằng enzym tạo glucosamin hay oligoglucosamin. Các loại enzym khác nhau được sử dụng để cắt mạch như chitosanase, chitinase, cellulase, pectinase… 3.2. Cắt mạch bằng hóa học Các tác nhân hóa học khác sử dụng để cắt mạch chitosan như các axit HCl, HNO 2 , các tác nhân oxi hóa K 2 S 2 O 8 , NaNO 2 , và H 2 O 2 cũng đã làm giảm dần M v của chitosan theo thời gian cắt mạch. Cơ chế quá trình cắt mạch CTS bằng H 2 O 2 : H 2 O 2   H + + HOO - (3.1) HOO -  OH - + (O) (3.2) HOO - + H 2 O 2  HO . + O 2 + H 2 O (3.3) RH + HO .  R . + H 2 O (3.4) R .  R . 1 + R 2 (3.5) (RH: kí hiệu của CTS) 3.3. Cắt mạch bằng bức xạ Ershov và ccs (1987) đã đề nghị cơ chế cắt mạch của chitosan được chiếu xạ ở trạng thái vảy khô như sau: R-H  R . (C 4 -C 6 ) + H . (3.6) R-H + H .  R . (C 1 -C 6 ) + H 2 (3.7) R . (C 1 ,C 4 )  F 1 . + F 2 (cắt mạch) (3.8) 4 Chiếu xạ phân ly nước chủ yếu sinh ra gốc OH . , e - aq và H . theo Ulan’ski. Trong môi trường axit cơ chế cắt mạch bức xạ có thể: H 2 O  H 2 O 2 , H 2 , OH . , H . , H + , OH - , e - aq , H 3 O + (3.9) e - aq + H +  H . (3.10) R-H + H .  R . (C 1 -C 6 ) + H 2 (3.11) R-H + OH .  R . (C 1 -C 6 ) + H 2 O (3.12) R . (C 1 ,C 4 )  F . 1 + F 2 (cắt mạch) (3.13) Trường hợp dung dịch chitosan có 1%H 2 O 2 , sẽ có thêm các phản ứng: H 2 O 2 h   2OH . (3.14) e - aq + H 2 O 2  OH . + OH - (3.15) H . + H 2 O 2  OH . + H 2 O (3.16) PHẦN 2. THỰC NGHIỆM Chương 4. Thực nghiệm 4.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 4.1.1. Nguyên liệu, hóa chất - Nguyên liệu: Vỏ tôm, mai mực mềm, mía giống: DLM24, VN85- 1427, lúa giống: OM1490. - Hóa chất: Các hóa chất sử dụng đều ở dạng tinh khiết. 4.1.2. Thiết bị: SVST-Co-60/B, nhớt kế Otwald, sắc ký gel: HP-GPC 1100, phổ FT-IR được đo trên máy EQUINOX 55, phổ 1 HNMR đo trên máy Brucker Avance 500mHz, giản đồ XRD đo trên máy XD-5A SHIMADZU, tủ sấy, máy li tâm. 4.2. Phương pháp thực nghiệm 4.2.1. Chế tạo các mẫu chitosan làm nguyên liệu đầu 4.2.1.6. Xác định độ deaxetyl (DD%) - Xác định DD% bằng phổ FT-IR DD% = 100 - (A 1320 /A 1420 - 0,3822)/0,03133 (4.1) Trong đó A 1320 và A 1420 lần lượt là mật độ quang tương ứng tại các đỉnh hấp thụ 1320 và 1420 cm -1 . 5 - Xác định DD% bằng phổ 1 H-NMR DD% = [ I H1D /(I H1D + I HAc /3)] 100 (4.2) Trong đó I H1D và I HAc lần lượt là tích phân tương ứng tại các đỉnh proton H1D và 3 proton HAc. 4.2.1.8. Xác định khối lượng phân tử trung bình độ nhớt M v M v được tính theo phương trình Mark-Houwink: [] = k  M v  (4.3) 4.2.2. Cắt mạch chitosan bằng dung dịch (dd) H 2 O 2 4.2.2.5. Tính toán các giá trị đánh giá cắt mạch từ các kết quả M v , M w , DD%  Hằng số tốc độ cắt mạch k (giờ -1 ) được tính theo phương trình: (4.4) M o và M t : KLPT trung bình CTS đầu và sau t (giờ) oxi hoá, chiếu xạ  m: khối lượng trung bình một mắc xích CTS, tính từ phương trình: m = [(DD%161)+203(100-DD%)]/100 (4.5) 4.2.3. Chiếu xạ cắt mạch chitosan dạng vảy 4.2.3.1. Chiếu xạ cắt mạch các mẫu chitosan dạng vảy không được oxi hóa trước bằng H 2 O 2 4.2.3.2. Chiếu xạ cắt mạch các mẫu chitosan dạng vảy đã được oxi hóa trước bằng H 2 O 2  Hiệu suất cắt mạch bức xạ (dạng vảy) G d (số liên kết bị đứt/100eV) được tính theo phương trình Charlesby và cs (1960): 1/M v - 1/M v0 = G d  1,04  10 -7  D (4.6) M v0 và M v : KLPT trung bình CTS ban đầu và tại các liều xạ D (kGy) 4.2.4. Chế tạo oligochitosan  Hiệu suất cắt mạch bức xạ (dung dịch) G s được tính với đơn vị mol/J theo Wasikiewicz (2005) : 1/M w - 1/M w0 = G s  D  d  1000/2C (4.7) m kt MM t  0 11 6 M w0 và M w : KLPT trung bình khối của CTS ban đầu và tại các liều xạ D (kGy), d- tỷ trọng dung dịch (g/cm 3 ), C- nồng độ dung dịch (g/lít) 4.2.4.8. Khảo sát hiệu ứng đồng vận.  Phần trăm suy giảm KLPT của CTS cắt mạch được xác định bằng công thức: %M = [(M w0 –M w )/M 0 ] 100 (4.8) 4.2.4.9. Xác định hàm lượng oligochitosan tan Oligochitosan tan (%) = (m 0 – m)  100/m 0 (4.9) m 0 và m: khối lượng CTS trong dung dịch chiếu xạ và kết tủa tại pH7. 4.2.5. Khảo nghiệm oligochitosan làm chất kích kháng trong nông nghiệp PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương 5. Chế tạo các mẫu chitosan (CTS) làm nguyên liệu đầu 5.1. Phương pháp xử lý ảnh hưởng đến DD%, M v của CTS nguồn Hình 5.1. Phổ FT-IR của CTS70 (a), CTS84 (b) và CTS94 (c) Kết quả xác định DD% từ FT-IR và M v của các CTS nguồn bằng đo độ nhớt trình bày ở bảng 5.1. 7 Bảng 5.1. Ảnh hưởng phương pháp xử lý chitin (CT) đến DD%, M v của chitosan STT Ký hiệu mẫu Phương pháp xử lý DD% M v (Da) 1 2 3 4 5 CTS70 CTS84 CTS94 CTS70 CTS90 CT+NaOH 50%, t o phòng, 96giờ CT + NaOH 50%,110 o C, 2giờ CTS84 + NaOH 50%,110 o C, 2giờ CT + NaOH 30%, t o phòng, 48giờ CT + NaOH 50%, t o phòng, 6giờ 70,3 84,0 94,1 72,3 90,8 598.000 460.000 115.000 1.318.000 293.000 Bảng 5.1 cho thấy việc chế tạo chitosan nguồn phụ thuộc vào điều kiện phản ứng deaxetyl hóa và dạng chitin ban đầu: DD% chitosan tăng còn M v chitosan giảm dần theo chiều tăng nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian deaxetyl. 5.2. Hiệu quả các loại phổ đánh giá cấu trúc của chitosan Hình 5.2. Phổ 1 H-NMR của CTS84 8 Cấu trúc của CTS90 được khảo sát bằng phổ 1 H-NMR ở hình 5.3. Hình 5.3. Phổ 1 H-NMR của CTS90 DD% của CTS84, CTS90 tính từ phổ FT-IR, 1 H-NMR ở bảng 5.2. Bảng 5.2. Kết quả tính giá trị DD% của CTS84 và CTS90 Bảng 5.2 cho thấy độ deaxetyl của các chitosan thu được bằng phổ FT-IR và 1 H-NMR với các giá trị 84,02% và 85,06% của CTS84; 90,81% và 91,16% của CTS90. Chứng tỏ độ lệch giữa 2 phép đo là không đáng kể. Nên dùng phổ FT-IR để đánh giá cấu trúc của chitosan là rất hiệu quả về độ tin cậy cũng như hiệu quả về kinh tế. Cấu trúc CTS70 được khảo sát bằng XRD thể hiện ở hình 5.4. FT-IR 1 H-NMR Ký hiệu mẫu A 1320 /A 1420 DD% I H1D I COCH3 DD% CTS84 0,883 84,02 1,000 0,527 85,06 CTS90 0,670 90,81 1,000 0,291 91,16 9 2 Theta (độ) Hình 5.4. Giản đồ XRD của CTS70 Hình 5.4 của giản đồ XRD cho thấy ở các đỉnh tại 2  ~10 0 và 20 0 xuất hiện với cường độ mạnh chứng tỏ cấu trúc tinh thể chiếm ưu thế đối với CTS có DD thấp. Chương 6. Cắt mạch chitosan (CTS) bằng dung dịch H 2 O 2 6.1. Ảnh hưởng nồng độ H 2 O 2 đến cắt mạch chitosan Bảng 6.1. Ảnh hưởng nồng độ H 2 O 2 đến M v chitosan cắt mạch M v (10 5 Da) Nồng độ H 2 O 2 % CTS70 (6giờ) CTS84 ( 2giờ) CTS70 (16giờ) CTS90 ( 2giờ) 0 5,98 4,60 13,18 2,93 1,0 5,74 3,28 4,87 1,92 1,5 4,50 2,92 3,27 1,72 2,0 4,38 2,87 2,98 1,63 Bảng 6.1 khi nghiên cứu cắt mạch chitosan với H 2 O 2 từ 0- 2% trong môi trường dị thể đối với CTS70, CTS84, CTS70, CTS90 10 cho thấy khối lượng phân tử trung bình M v chitosan giảm dần theo chiều tăng nồng độ H 2 O 2 . Nồng độ H 2 O 2 1% và 1,5% là cắt mạch có hiệu quả tương ứng đối với CTS và CTS. 6.2. Cắt mạch CTS bằng H 2 O 2 trong môi trường dị thể 6.2.1. Khảo sát cấu trúc của các CTS cắt mạch bằng phổ FT-IR, 1 H-NMR và giản đồ XRD Bảng 6.2. Ảnh hưởng thời gian oxi hóa đến DD% của các CTS (Tính từ phổ FT-IR) DD% theo thời gian t (giờ) Ký hiệu mẫu 0 2 4 8 16 αCTS70 70,3 - 69,9 70,0 70,0 αCTS84 84,0 - - 84,9 85,0 βCTS90 90,8 89,9 91,5 91,3 - Các sản phẩm cắt mạch theo thời gian oxi hóa thu được có DD% đều không có thay đổi đáng kể so với chitosan ban đầu tương ứng. 2 Theta (độ) Hình 6.5. Giản đồ XRD của a. CTS70 và b. CTS70-OX [...]... giá trị hiệu suất cắt mạch bức xạ dạng vảy Gd: 0,20 và 0,96; 1,03 và 5,73; 1,69 và 6,37 liên kết/100eV lần lượt của CTS70 và CTS70-OX; CTS84 và CTS84-OX; CTS94 và CTS94-OX  kcx đối với CTS: 0,92  10-5 và 3,25  10-5; 4,02  10-5 và 16,69  10-5 giờ-1 lần lượt của CTS70 và CTS70-OX; CTS90 và CTS90-OX  Các giá trị hiệu suất cắt mạch bức xạ dạng vảy Gd: 0,38 và 1,36; 1,76 và 7,31 liên kết/100eV... tương ứng 1.318.000 - 293.000 Da bằng H2O2 đã chế tạo được các CTS có KLPT thấp Đã xác định được hằng số tốc độ cắt mạch oxi hóa tăng theo chiều tăng của độ deaxetyl; Hằng số tốc độ cắt mạch của CTS cao hơn CTS 22 2 Khảo sát hiệu ứng cắt mạch CTS dạng vảy bằng bức xạ γ-Co 60 cho thấy CTS được cắt mạch bằng H2O2 trước có hằng số tốc độ và hiệu suất cắt mạch cao hơn so với chitosan ban đầu khoảng 4,0 –... Gd: 0,38 và 1,36; 1,76 và 7,31 liên kết/100eV lần lượt của CTS70 và CTS70OX; CTS90 và CTS90-OX  kcx và Gd tăng khi DD% tăng, kcx và Gd của CTS-OX lớn hơn CTS ban đầu, chứng tỏ CTS có DD% cao và CTS-OX dễ bị cắt mạch bằng bức xạ; kcx và Gd của CTS lớn hơn CTS (cùng DD%), chứng tỏ cũng giống như cắt mạch oxi hóa CTS dễ bị cắt mạch bằng bức xạ hơn so với CTS 15 Kết quả thiết lập được 8 phương trình... Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan, Tạp chí Hóa học và Ứng dụng, T.57, Số 9, Tr.38-41, 2006 3 Bùi Phước Phúc, Hà Thúc Huy, Nguyễn Ngọc Duy, Đặng Văn Phú, Nguyễn Quốc Hiến, Nghiên cứu cắt mạch beta -chitosan bằng H2O2 kết hợp với bức xạ Gamma 60Co, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Khoa học và Công nghệ Hạt nhân lần thứ VI, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Tr.367-371, 2007... 0,584  -7 10 và 2,32  10-7 lần lượt của C70-0%H2O2 và C70-0%H2O2 Gs khi chiếu xạ dung dịch C70-0%H2O2 lớn gấp 3,97 lần so Gs của C70-0%H2O2 Bảng 8.2 Các giá trị Gs thu được từ chiếu xạ dung dịch CTS tương ứng C70 Kiểu cắt mạch Gs (10-7 mol/J) C70 4kGy 12kGy 16kGy 16kGy Chiếu xạ 0,760 1,477 1,889 0,519 Chiếu xạ + 26,003 22,899 22,465 4,963 1%H2O2 Bảng 8.2 nhận thấy xử lý cắt mạch bằng chiếu xạ có... chitosan, còn cắt mạch kết hợp oxi hóa -chiếu xạ dung dịch đã tạo ra oligochitosan có cấu trúc vô định hình 8.3 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch dd CTS- 1% H2O2 bằng chiếu xạ Bảng 8.5 Phần trăm suy giảm Mw của CTS cắt mạch (%Mw) C70 Ký hiệu C70 4kGy 16kGy 16kGy (3giờ) (12giờ) (12giờ) a 10,38 23,50 33,83 b Chiếu xạ 21,75 73,44 50,12 c %Mw Oxi hóa Oxi hóa+ 90,49 97,05 90,57 58,36 0,11 6,62 Chiếu xạ %Hiệu... độ và hiệu suất cắt mạch theo DD% và 5 phương trình tính thời gian oxi hóa, thời gian hoặc liều chiếu xạ cần thiết để nhận được CTS có Mt mong muốn từ CTS có giá trị Mv0, m, và DD% ban đầu 5 Hiệu ứng kích kháng bệnh và tăng trưởng của oligochitosan 5.1 Đối với cây mía  Oligochitosan R3DD đã nâng cao khả năng kháng bệnh, giảm bệnh hại, tăng khả năng sinh trưởng phát triển dẫn đến tăng năng suất và. .. và hiệu suất cắt mạch bức xạ càng lớn 3 Khảo sát hiệu ứng đồng vận bức xạ γ-Co 60/ 1% H2O2 cắt mạch CTS dung dịch đã xác định được hiệu suất cắt mạch bức xạ dung dịch có sự hiện diện của H2O2 cao hơn so với không có H2O2 Đã giảm liều xạ xuống khoảng 5 lần để chế tạo được oligoCTS Chỉ ở liều thấp 16kGy đã nhận được oligoCTS có Mw = 2.700 Da tan hoàn toàn ở pH7 4 Kết quả nghiên cứu từ quá trình cắt mạch. .. C=C và C=O trong cấu trúc oligoCTS 8.2.3 Khảo sát phổ nhiễu xạ rơngen (XRD) 18 2 Theta (độ) Hình 8.10 Giản đồ XRD của C70 (a), oligoCTS C70-40kGy (b) Hình 8.10 cho thấy cường độ XRD xuất hiện các đỉnh tại 2 ~ O 10 và 20O của oligochitosan chiếu xạ so với chitosan ban đầu là giảm đáng kể Chứng tỏ cắt mạch bằng oxi hóa cũng như chiếu xạ riêng rẽ không làm thay đổi đáng kể cấu trúc tinh thể của chitosan, ... và 8.2 cho thấy cắt mạch bức xạ dung dịch chitosan có sự hiện diện của H2O2 là rất hiệu quả đối với cả dạng  lẫn  Kết quả đã xác định được:  Các giá trị hằng số tốc độ cắt mạch bức xạ dung dịch kcx: 0,14  10-3 và 0,54  10-3 giờ-1 lần lượt của C70-0%H2O2 và 17 C70-0%H2O2 kcx khi chiếu xạ dung dịch C70-0%H2O2 lớn gấp 3,86 lần so kcx của C70-0%H2O2  Các giá trị hiệu suất cắt mạch bức xạ dung . CTS. Mục tiêu, tính khoa học và thực tiễn của đề tài Dựa vào những cơ sở trên, mục tiêu của luận án đặt ra là nghiên cứu biến tính cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit và kỹ thuật chiếu xạ để. chúng tôi tiến hành nghiên cứu: cắt mạch CTS bằng H 2 O 2 ; cắt mạch bằng bức xạ gamma Co-60 đối với CTS dạng vảy không có và có oxi hóa trước bằng H 2 O 2 ; cắt mạch bằng bức xạ gamma Co-60. 2.2. Hóa học bức xạ của nước và dung dịch nước Chương 3. Một số phương pháp biến tính cắt mạch chitosan 3.1. Cắt mạch bằng enzym Chitosan có thể bị cắt mạch bằng enzym tạo glucosamin hay