Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT o0o VŨ ĐÌNH DUY ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI THÔNG ĐỎ BẮC (TAXUS CHINENSIS (PILG.) REHD.) ĐANG BỊ ĐE DỌA TRONG HỆ SINH THÁI RỪNG NHIỆT ĐỚI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60. 42. 0114 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN MINH TÂM Hà Nội, 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận văn Vũ Đình Duy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, quý trọng đến thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học TS. Nguyễn Minh Tâm. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của cơ sở đào tạo sau Đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Lãnh đạo phòng Phân loại thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, các bạn bè đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Để hoàn thành bản luận văn này, tôi chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học; phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh; Ban lãnh đạo các khu Bảo tồn và vườn Quốc gia và chính quyền địa phương đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực hiện đề tài. Luận văn được thực hiện bởi Dự án BVMT.VAST: “Bảo tồn và sử dụng bền vững một số loài thông quý hiếm có giá trị kinh tế cao đang bị đe dọa tuyệt chủng và khu hệ nấm nội ký sinh có ích trong các loài nghiên cứu” và sự hỗ trợ bởi học bổng Nagao – Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên Môi trường (CRES), Việt Nam. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi hoàn thành khóa luận này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleit (Deoxyribonucleic acid) AFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism) bp Cặp bazơ (base pair) CR Loài cực kỳ nguy cấp EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Genbank Ngân hàng gen quốc tế ISSR Trình tự lặp đơn giản ngẫu nhiên (interal simple sequence repeat) matK Maturase gen ME Phương pháp tiến hóa tối thiểu (Minimum Evolution Method) MEGA Phần mền phân tích di truyền tiến hóa phân tử MP Phương pháp tiết kiệm tối đa (Maximum Parasimony Method) NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (National Center for Biotechnology Information) NJ Phương pháp kết nối liền kề (Neighbor Joining Method) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) RADP Đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA) rbcL Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit gen RFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism) rpoC1 RNA polymerase C gen SSR Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats) UPGMA Phân tích Unweighted Pair Group Method Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn UV Ánh sáng tử ngoại VU Loài sẽ nguy cấp Quần thể BDS Bát Đại Sơn, Quản Bạ, Hà Giang BL Xuân Trường, Bảo Lạc, Cao Bằng HK Hang Kia, Mai Châu, Hòa Bình HLS Hoàng Liên, Sa Pa, Lào Cai TPT Thài Phìn Tùng, Đồng Văn, Hà Giang YC Mường Lựm, Yên Châu, Sơn La DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 2.1 Địa điểm và số mẫu thu thập cho phân tích cpSSR 22 2.2 Danh sách các loài Thông dùng xác định phân tích vị trí phân loại 23 2.3 Trình tự các nucleotide của 6 cặp mồi cpSSR 24 2.4 Các cặp mồi sử dụng để xác định vị trí phân loại giữa các taxon 24 3.1 Cấu trúc tuổi quần thể của loài Thông đỏ bắc 38 3.2 Đa dạng di truyền quần thể của loài Thông đỏ bắc 42 3.3 Hệ số tương đồng di truyền (trên) và khoảng cách di truyền (dưới) theo Nei (1987) ở mức độ quần thể và 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn loài của loài Thông đỏ bắc 3.4 Phân tích AMOVA (khác nhau ở mức độ phân tử) của loài Thông đỏ bắc 46 3.5 Thành phần bazơ (%) của 3 vùng gen rpoC1, rbcL, matK của 20 loài Thông 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang 1.1 Hình ảnh về loài cây Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) 19 2.1 Bản đồ chỉ ra địa điểm nghiên cứu loài Thông đỏ bắc 24 3.1 Hình ảnh ADN tổng số đại diện của loài Thông đỏ bắc 39 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR của 6 cặp mồi cpSSR trên gel polyacrylamide 5% 39 3.3 Cấu trúc không gian alen của các quần thể nghiên cứu 41 3.4 Phân tích NJ trên cơ sở khoảng cách di truyền giữa các quần thể của loài Thông đỏ bắc 44 3.5 Phân tích UPGMA trên cơ sở khoảng cách di truyền từ 148 cá thể từ 6 quần thể của loài Thông đỏ bắc 45 3.6 Vị trí phân loại của 14 loài Thông nghiên cứu theo phương pháp NJ trên cơ sở vùng gen matK 54 3.7 Vị trí phân loại của 17 loài Thông nghiên cứu theo phương pháp NJ trên cơ sở vùng gen rbcL 55 3.8 Vị trí phân loại của 14 loài Thông nghiên cứu theo phương pháp NJ trên cơ sở vùng gen rpoC1 55 3.9 Vị trí phân loại của 14 loài Thông nghiên cứu theo phương pháp NJ trên cơ sở kết hợp 3 vùng gen rpoC1, matK và rbcL 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cám ơn ii Những từ viết tắt iii Danh mục các bảng iv Danh mục các hình v MỞ ĐẦU 1 MỤC TIÊU VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC 3 1. Mục tiêu nghiên cứu 3 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Khái niệm về quần thể thực vật 4 1.2. Tính đa đa dạng di truyền của quần thể thực vật 4 1.3. Ảnh hưởng của phân cắt nơi sống đến đa dạng di truyền thực vật 5 1.4. Đa dạng di truyền trong quần thể nhỏ và cô lập 5 1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường được dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật 7 1.5.1. Kỹ thuật isozyme 7 1.5.2. Kỹ thuật RAPD 7 1.5.3. Kỹ thuật RFLP 8 1.5.4. Kỹ thuật AFLP 9 1.5.5. Kỹ thuật SSR 9 1.5.6. Kỹ thuật ISSR 10 1.6. Tình hình nghiên cứu ngoài nước và trong ngoài nước về đa dạng di truyền và tiến hóa phân tử 11 1.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11 1.6.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 16 1.7. Một số đặc điểm của loài Thông đỏ bắc 18 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Vật liệu nghiên cứu 20 2.2. Địa điểm, thời gian và phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 23 2.2.2. Thời gian nghiên cứu 24 2.2.3. Phương pháp khảo sát thực địa 24 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 24 2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số 24 2.2.4.2. Nhân bản ADN 25 2.2.4.3. Phân tích số liệu 26 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1. Hiện trạng quần thể, loài Thông đỏ bắc 27 3.1.1. Phân bố của loài Thông đỏ bắc 27 3.1.2. Cấu trúc nơi sống 28 3.1.3. Cấu trúc quần thể 35 3.2. Đa dạng di truyền quần thể và loài 37 3.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số và điện di sản phẩm PCR 37 3.2.2. Đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể của loài Thông đỏ bắc 39 3.2.3. Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền 42 3.2.4. Phân bố không gian di truyền 43 3.2.5. Phân tích AMOVA 45 3.3. Mức độ tiến hóa phân tử của một số loài Thông 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.) thuộc chi Thông đỏ (Taxus), họ Thông đỏ (Taxaceae) là loài quý hiếm có giá trị đặc biệt về mặt y học được sử dụng để sản xuất taxol (hợp chất chữa bệnh ung thư) [64], xây dựng nhà cửa, đóng đồ dùng gia đình, thủ công mỹ nghệ và làm cảnh. Các loài này phân bố ở vùng núi đá vôi và núi đất phía Bắc Việt Nam. Theo các tiêu chí mới của IUCN 2010 [36] loài này cần được xếp vào bậc sắp bị tuyệt chủng VU A2ac, B2ab (i-v), đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam với bậc sắp bị tuyệt chủng VU A1a, c, B1+2b, c [2] và Loài này thuộc nhóm IIA: Thực vật rừng hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại của nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/3/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm [3]. Mặc dù, một số quần thể của chúng là đối tượng đã được bảo vệ trong một số khu bảo tồn, nhưng chúng vẫn đang ở trong tình trạng bị đe doạ. Các tác giả đã chỉ ra rằng Thông đỏ bắc hiện chỉ còn khoảng 250 cá thể, phân bố tản mạn, với kích thước quần thể rất nhỏ. Thông đỏ bắc hiện có mặt tại một số địa điểm như Quản Bạ, Đồng Văn (Hà Giang), Sapa (Lào Cai), Bảo Lạc (Cao Bằng), Yên Châu (Sơn La), Hang Kia - Pà Cò (Hoà Bình). Đã có một số biện pháp bảo vệ loài này với các hình thức khác nhau, như bảo vệ nguyên vị tại một số khu bảo tồn và chuyển vị (giâm hom) [7]. Tuy nhiên, các nhà quản lý và các nhà khoa học còn thiếu các thông tin quan trọng về đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài, đặc biệt các yếu tố ảnh hưởng xấu đến sự tồn tại của chúng liên quan đến tác động của con người. Điều này rất khó để nâng cao hiệu quả của công tác bảo tồn và sử dụng bền vững loài Thông nghiên cứu. Để góp phần đưa ra các giải pháp bảo tồn và phục hồi loài thì việc đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Thông có ý nghĩa quan trọng. Mức độ đa dạng di truyền không những chỉ ra khả năng tồn tại của loài ở hiện tại và tương lại, mà còn chỉ ra tiềm năng tiến hoá của loài. Ngày nay, kỹ thuật công nghệ sinh học được sử dụng rộng rãi, nhanh và có hiệu quả trong việc đánh giá mức độ đa [...]...dạng di truyền quần thể và loài, đặc biệt các loài Thông đang có nguy cơ bị đe dọa [43], [4], [11], [51], [59] Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài Đánh giá đa dang di ̣ truyên loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis (Pilg.) Rehd.) đang bị đe doa ̀ ̣ trong hê sinh thai rƣng nhiêt đơi Viêt Nam ̣ ́ ̀ ̣ ́ ̣ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại... bị đe doạ [6], đặc biệt Sách Đỏ Việt Nam, 2007 [2], được xuất bản bởi Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và đưa ra một số biện pháp bảo tồn nguyên vị và chuyển vị Rất ít công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể và loài thực vật, đặc biệt các loài đang bị đe doạ tuyệt chủng Một số công trình mới chỉ đề cập đến đa dạng di truyền ở mức độ cá thể, tuy nhiên cũng chỉ dừng lại ở mức đánh giá đa. .. phấn và mật độ cá thể thấp trong quần thể Một công trình khác đề cập đến ảnh hưởng của sự phân cắt đến cấu trúc di truyền quần thể của loài thực vật đặc hữu Brongniartia vazquezii đang bị đe doạ trong rừng khô nhiệt đới ở miền Trung Mexico [18] Sáu lô cút đa hình đã được sử dụng để đánh giá các thông số đa dạng di truyền Chẳng hạn, hệ số cận noãn đã khám phá ra sự thiếu hụt gen di hợp tử ở cả tập Số hóa... tích số liệu Đánh giá các thông số đa dạng di truyền quần thể và loài của loài Thông đỏ bắc: tần số alen và haplotyp sử dụng phần mềm Arlequin 3.1 [28], các alen cho một lô cút: số alen trung bình (A), số alen hữu hiệu (Ae), số alen hiếm (Ap) và các thông số đa dạng di truyền quần thể: phần trăm lô cút đa hình (P), chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I), hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho), Hệ số gen dị... tính đa dạng di truyền quần thể và loài của loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) : VU A1a, c, B1+2b, c [2] Xác định được các nguyên nhân làm mất tính đa dạng di truyền quần thể và loài và đưa ra các giải pháp phục hồi loài Thông nghiên cứu 2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Đề tài không những cho phép các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về sự tuyệt chủng trên cơ sở đánh giá mức độ suy giảm đa dạng di truyền... http://www.lrc-tnu.edu.vn Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu: Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền cả hai mức độ quần thể và loài, 148 mẫu lá từ 6 quần thể loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) đã được thu thập (bảng 2.1) Xác định vị trí phân loại của 18 loài Thông thuộc bộ Thông (Coniferales) ở Việt Nam trên cơ sở xác định trình tự nucleotide của 3 vùng gen rpoC1, rbcL và matK, chúng... tính đa dạng di truyền và dẫn đến sự tuyệt chủng của một số loài cũng được khám phá trên cơ sở phân tích isozym Hai thông số được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền quần thể là tỉ lệ phần trăm lô cút đa hình (P) và hệ số gen di hợp tử (H) Nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng hệ số (H) để đánh giá tầm quan trọng của gen dị hợp tử trong quần thể tự nhiên Chẳng hạn, có sự liên quan giữa giá. .. hệ di truyền của các loài thông trên cơ sở giải mã vùng 18S-rDNA đã được tiến hành bởi Stefanovic và cộng sự vào năm 1998 [56] Kết quả đã khẳng định họ Thông đỏ (Taxaceae) thuộc bộ Thông (Coniferales) Trước đó Flori (1951) [29], họ này được xếp tách thành bộ riêng bộ Thông đỏ (Taxales) và có hướng tiến hoá song song với bộ Thông (Coniferales) Trong bộ Thông, họ Thông Pinaceae có thành phần loài đa. .. của tỉ lệ phần trăm lô cút đa hình và số alen xuất hiện ở loài đặc hữu Các loài có đặc điểm sinh thái như chu kỳ sống dài (lâu năm), sinh sản hữu tính và phát tán hạt nhờ động vật duy trì tính đa dạng di truyền cao hơn các loài với đặc điểm sinh thái khác Đối với quần thể, giá trị trung bình của hệ số đa dạng di truyền và lô cút đa hình là 0,113 và 34%, tương ứng Mức độ di truyền cao được duy trì đối... thế hệ được sản sinh bằng thụ phấn cận noãn sẽ dẫn đến sự khác nhau về di truyền giữa các quần thể là lớn, mất tính đa dạng di truyền và tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ 1.2 Tính đa dạng di truyền của các quần thể thực vật Đa dạng sinh học thường đề cập đến mức độ khác nhau của các dạng sống bao gồm các cá thể động vật, thực vật, vi sinh vật và được biểu hiện từ mức độ phân tử đến hệ . NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT o0o VŨ ĐÌNH DUY ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI THÔNG ĐỎ BẮC (TAXUS CHINENSIS (PILG. ) REHD .) ĐANG BỊ ĐE DỌA TRONG HỆ SINH. http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Loài Thông đỏ bắc (Taxus chinensis (Pilg. ) Rehd .) thuộc chi Thông đỏ (Taxus) , họ Thông đỏ (Taxaceae) là loài quý hiếm có giá trị đặc biệt về mặt y học được sử. loài cây Thông đỏ bắc (Taxus chinensis) 19 2.1 Bản đồ chỉ ra địa điểm nghiên cứu loài Thông đỏ bắc 24 3.1 Hình ảnh ADN tổng số đại di n của loài Thông đỏ bắc 39 3.2 Phổ điện di sản phẩm