ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN o0o QCH NGƠ DIỄM PHƢƠNG KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VIỆC NI CẤY TẾ BÀO HAI LỒI DROSERA Chun ngành: Sinh hóa Mã số: 62 42 30 15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh, năm 2011 Công trình được hoàn thành tại: Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, TP.HCM Người hướng dẫn khoa học: NGƯT. PGS. TS. BÙI VĂN LỆ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: (ghi tên các thư viện nộp luận án) 1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án: Drosera có giá trị dược tính trong điều trị các căn bệnh như: lao, ung thư, HIV, tim mạch, ho gà, hen suyễn…kể cả những căn bệnh do đột biến [Samaj J., 1999]. Drosera trong tự nhiên tương đối hiếm, là loài có nguy cơ tuyệt chủng, nhiều quốc gia đã ban hành luật để bảo vệ chúng [Blehova A, 1995], [Bonnet M, 1984]. Ở Việt Nam, có 3 loài Drosera [Phạm Hoàng Hộ, 1995]; chưa loài nào được nghiên cứu về thành phần hóa học, dược tính [Đỗ Tất Lợi]. Đề tài đã ra đời với nhu cầu thiết yếu của nó. Mục tiêu đề tài: Bảo tồn nguồn cây Drosera vốn khan hiếm; khai thác tiềm năng dược tính 1 loài cây hoang dại ở Việt Nam; đáp ứng nhu cầu thực vật cũng như về dược chất 1 cách chủ động Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu: Đối tượng: cây bắt ruồi D. indica L. và D. burmanii Vahl Nội dung nghiên cứu: thiết lập quy trình vi nhân giống 2 loài Drosera được thu hái ở Việt Nam; sàng lọc, thu nhận, xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của 2 loài Drosera này; khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất có tiềm năng trên hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro Drosera (cây con, dịch huyền phù): lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp; bổ sung tiền chất; sử dụng những nhân tố cảm ứng con đường sinh tổng hợp (elicitor, stress) Bố cục của luận án: luận án gồm 150 trang, bao gồm: Mở đầu 2 trang, Tổng quan tài liệu 32 trang, Vật liệu phương pháp 28 trang, Kết thào luận 82 trang, Kết luận và đề nghị 3 trang, với 54 bảng, 76 hình. Tài liệu tham khảo gồm 11 tài liệu tiếng Việt, 108 tài liệu tiếng Anh, 11 tài liệu từ internet. 2 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Dịch chiết từ Drosera được chứng minh là có nhiều dược tính và những hoạt tính có giá trị ứng dụng khác [Samaj J., 1999]. Cho đến nay, Drosera vẫn còn đang là đối tượng thu hút các nhà khoa học về giá trị trị liệu của chúng. Tháng 5/2009, V.Madhavan và các cộng sự (2009) vừa chứng minh được cả dịch chiết alcohol và dịch chiết nước của D. burmanii đều có khả năng chống thụ thai trên chuột. Tháng 10/2009, Hema B và cộng sự (2009) đã khẳng định có thể sử dụng D. burmanii để điều chế thuốc điều trị chứng co giật, động kinh với giá thành rẻ mà hạn chế tác dụng phụ hơn so với thuốc tổng hợp. Do nhu cầu của Drosera trên thế giới ngày càng tăng cao mà cây trong tự nhiên lại đang trong tình trạng bị đe dọa tuyệt chủng nên nhiều công trình trên thế giới đã tập trung nghiên cứu nuôi cấy in vitro cũng như thu nhận dược chất bằng công nghệ nuôi cấy tế bào Drosera và đã thu được một số kết quả khả quan [Hook L.(2001), Nahalka J.(1996), Putalun W.(2010), Krolicka A.(2008)] . Thế nhưng cho đến nay chưa thấy tài liệu nào công bố những nghiên cứu trên đối tượng này ở Việt Nam. 2 VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP Nguyên liệu nuôi cấy: trái chứa hạt của 2 loài Drosera được thu thập từ khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu (tỉnh Bà Rịa– Vũng Tàu). Việc định danh mẫu thu hái được tiến hành bởi BM. Thực vật học (nay là BM. Sinh thái và Sinh học tiến hóa) của Trường ĐH Khoa học tự nhiên, TP. HCM. 2.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu Nhân giống bằng chồi bên và tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào bằng cách bổ sung BA với các nồng độ khác nhau từ 0- 5mg/l; thử 3 nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước trong việc cải thiện hệ số nhân chồi [Christoph W.,2009]; tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/ 1 mẫu, chiều cao chồi. 2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera Các bước tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro của hai loài Drosera Xử lý mẫu: cây trưởng thành in vitro sau 8-10 tuần nuôi cấy của hai loài Drosera được rửa sạch, phơi hay sấy khô ở nhiệt độ 50 0 C đến trọng lượng không đổi, xay nhuyễn tạo bột cây khô. Điều chế các loại cao chiết: bột cây khô được chiết kiệt với lần lượt 4 loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetate, ethanol bằng phương pháp ngâm dầm trong 48 giờ, ở nhiệt độ thường [Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007]. Sàng lọc các cao chiết có hoạt tính sinh học mạnh: tiến hành khảo sát và chọn phân đoạn cao có hoạt tính sinh học cao nhất ở mỗi định hướng: (1)tìm hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh bằng thử nghiệm năng lực khử của các phân đoạn cao có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp Yen và Duh (1993); (2)tìm hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư ruột kết DLD-1 của các phân đoạn cao có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) [Rubinstein L.V.,1990] Cô lập hoạt chất từ các phân đoạn đã sàng lọc: sắc ký cột silica gel, sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, sắc ký lớp mỏng điều chế với bảng sắc ký tráng sẵn Kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập: (1) sử dụng phương pháp TBA (thiobarbituric acid) và phương pháp FTC (ferric thyocyante) để kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa [Zin Z. M.,2002]; 4 (2) khảo sát ảnh hưởng của hoạt chất lên sự tăng sinh và phát triển tế bào ung thư ruột kết DLD-1 bằng phương pháp đếm tế bào trên máy Coulter counter và ảnh hưởng của hoạt chất lên sự sinh tổng hợp protein và biểu hiện của protein mTOR (mammalian target of rapamycin) [Sarbassov D. D.,2005], một protein kinase thiết yếu cho sự tăng sinh và phát triển tế bào động vật, bằng phương pháp điện di miễn dịch Western Blot. 2.2.1 Xác định cấu trúc và hàm lượng hoạt chất Xác định cấu trúc: kết hợp các phương pháp hóa lý hiện đại như khối phổ MS, cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ( 1 H-, 13 C-, DEPT- NMR, COSY, HMQC, HMBC) Xác định hàm lượng: phổ tử ngoại (UV), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 2.2.2 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này Các hợp chất có hoạt tính sinh học sau khi cô lập và xác định cấu trúc, được xác định hàm lượng trong hai loài Drosera nuôi cấy in vitro bằng phương pháp HPLC. 2.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng ở Drosera: theo dõi và ghi nhận thời gian của từng giai đoạn ở mỗi cá thể trong một quần thể có cùng điều kiện nuôi cấy và trên cùng thành phần môi trường như đã cố định từ khi hạt được gieo trong điều kiện nuôi cấy in vitro cho đến khi cây bắt đầu có phát hoa từ đỉnh sinh trưởn, nhằm tìm thời điểm thích hợp cho việc nuôi cấy cũng như tác động tăng sinh hoạt chất. 5 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con: lựa chọn các điều kiện nuôi cấy như hàm lượng khoáng đa lượng, ánh sáng, pH môi trường, mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu. Khảo sát một số tác nhân tác động lên sự tích lũy hoạt chất của cây con: chất điều hòa tăng trưởng NAA, bổ sung tiền chất (phenyalanine, tyrosine), sử dụng chất cảm ứng (acid salicylic, cao nấm men), gây stress nitrogen. Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các tác nhân đã khảo sát. 2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào Tạo mô sẹo: tìm nền khoáng và nồng độ đường thích hợp cho sự sống của lớp mỏng tế bào, trên nền khoáng và nồng độ đường đó tìm sự kết hợp 3 loại hormone tăng trưởng 2,4-D, NAA, KN thích hợp nhất. Tạo dịch huyền phù tế bào từ mô sẹo: 20-30 mẫu mô sẹo tạo thành được chuyển vào một erlen có thể tích 125ml chứa 15ml môi trường lỏng có cùng thành phần với môi trường tạo sẹo trước đó, erlen được đặt trong điều kiện nuôi đã cố định, trên máy lắc 125 vòng/phút. Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lớp mỏng tế bào: thử nghiệm nuôi lỏng lắc 20-30 mẫu lớp mỏng tế bào thân và rễ trong điều kiện nuôi tương tự như tạo dịch huyền phù từ mô sẹo. Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong các dịch huyền phù tế bào tạo thành bằng phương pháp nhuộm TTC: tế bào chết không có màu trong khi tế bào sống có màu hồng do hoạt động hô hấp của tế 6 bào tạo ra những hợp chất có khả năng kết hợp với 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC) tạo phức chất formanzan màu hồng [Victor M., 2006]. Lựa chọn dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ loại mô có khả năng tích lũy hoạt chất cao hơn làm nguồn vật liệu đầu cho các thí nghiệm tăng sinh: xác định hàm lượng plumbagin trong mô lá, mô rễ thu hoạch từ cùng các cá thể cây in vitro có độ tuổi 8-10 tuần 2.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Khảo sát đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào có mật độ tế bào nuôi ban đầu khác nhau: kết hợp khảo sát đường cong tăng trưởng và mật độ nuôi cấy tế bào ban đầu thích hợp. Theo dõi và ghi nhận thời gian của mỗi pha trong dịch huyền phù tế bào bằng phương pháp đếm tế bào trong buồng đếm có khả năng giữ lượng thể tích cố định dịch huyền phù tế bào trên một diện tích đã biết để xác định mật độ tế bào nuôi cấy cứ 4 ngày một lần. Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất: ánh sáng, tốc độ lắc Khảo sát một số tác nhân tác động lên sự tích lũy hoạt chất của dịch huyền phù: chất điều hòa tăng trưởng 2,4-D; bổ sung tiền chất (phenylalanine, tyrosine), sử dụng chất cảm ứng (acid salicylic). Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Drosera của các tác nhân đã khảo sát bằng phương pháp HPLC. 2.5 Xử lý thống kê Số liệu thu được từ kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0 với Duncan, Dunnett test, độ tin cậy 95% . 7 3 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy: quy trình khử trùng có bước cải tiến hơn là xử lý hạt với giberelin 1% trong 24 giờ, giúp rút ngắn rất nhiều thời gian nẩy mầm thông thường của hạt Drosera (từ 21 ngày xuống còn 15 ngày), với tỷ lệ hạt vô trùng và nẩy mầm đạt 93-95%. Nhân giống bằng chồi bên: nồng độ thích hợp để nhân chồi bên từ đốt thân D. indica là (0,5 mg/l), và D. burmanii là (2mg/l). Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào: các bộ phận lóng thân, lá, cuống lá, cuống hoa của cây con Drosera đều được thử nghiệm. Tuy nhiên, sau 5 tuần nuôi cấy, chỉ có lớp tế bào ở đoạn ngọn phát hoa là có khả năng tái sinh chồi bất định dưới tác động của BA. Trong đó, nồng độ thích hợp để tạo chồi bất định từ lớp tế bào của đoạn ngọn phát hoa của D. indica là (1 mg/l), và D. burmanii là (2mg/l). Kết quả này được xem là 1 thành công trong việc nhân nhanh giống cho Drosera, đặc biệt ở D. burmanii: cá thể có 1 đốt thân rất ngắn nhưng có thể có từ 2-4 phát hoa dài; khi phát hoa được cắt đi, lập tức phát hoa khác sẽ được tái sinh và nếu cắt liên tục phát hoa non, cây có thể kéo dài đời sống hơn bình thường. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước trong việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển thành cây con hoàn chỉnh: đốt thân hay chồi con được tiến hành nhân giống theo hai bước: (1) nuôi cấy trên môi trường MS (rắn, lỏng) với nồng độ BA thích hợp đã xác định (0,5mg/l cho D. indica; 2mg/l cho D. burmanii) nhưng chỉ trong 2 tuần; (2) sau đó các mẫu cấy đã được cảm ứng nhân chồi bên được lập tức chuyển sang môi trường MS (rắn, lỏng) bổ sung đầy đủ các thành phần ngoại trừ BA trong 3 tuần tiếp theo. Sau 5 tuần nuôi cấy, 8 so sánh với mẫu đối chứng không áp dụng quy trình nuôi cấy lỏng 2 bước. Kết quả cho thấy việc nuôi cấy hai bước theo quy trình của Christoph Wawrosch (2009) áp dụng trên cả hai loài Drosera đều đạt hiệu quả cao, trong đó NT2 (2 tuần đầu cảm ứng tạo chồi bằng MS rắn bổ sung BA, 3 tuần sau chuyển mẫu đã cảm ứng sang môi trường MS lỏng không bổ sung hormone) là thích hợp nhất cho việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển cây con với tỷ lệ tạo chồi cao nhất (100%) và số chồi trên một mẫu cao hơn (D. indica: cao gấp 1,58 lần; D. burmanii cao gấp 2,03 lần) so với đối chứng. Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh: chồi con tách ra từ cụm chồi mẹ sau 6-8 tuần nuôi cấy có thể phát triển thành cây con hoàn chỉnh trên môi trường MS với đầy đủ các bộ phận kể cả việc tạo rễ mà không cần bổ sung auxin. 3.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera 3.2.1 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa 3.2.1.1 Sàng lọc và cô lập hoạt chất Kết quả sàng lọc lần 1: trong 8 loại cao chiết đã điều chế, cao chiết chloroform của D.indica (15,72g) được chọn. Tiến hành giải ly trên sắc ký cột silica gel bằng hệ dung môi gồm (chloroform:ethyl acetate) với độ phân cực tăng dần từ 0% ethyl acetate đến 100% ethyl acetate trong chloroform. Định tính phân đoạn chứa phenolic: chọn được 5 phân đoạn (1, 2, 5, 6, 9) trong 9 phân đoạn. Kết quả sàng lọc lần 2: phân đoạn 6 ( 2g cao) có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất. Sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, giải ly với hệ dung môi chloroform-methanol (1:1) phân đoạn 6 cho phép cô lập được một [...]... 20_40 25_40 số tế bào 104/ ml 25 20 15 10 5 0 0 4 8 12 16 Hình 3.1 Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D burmanii có mật độ tế bào ban đầu khác nhau Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu thích hợp là (15:40) tương ứng với số tế bào ban đầu là 2,6×104 tế bào/ ml Để chọn thời điểm khảo sát sự tích lũy hoạt chất trong tế bào D burmanii, chúng tôi chọn khoảng thời gian nuôi cấy đủ để quá trình biến... tăng trưởng tế bào Với nồng độ thích hợp, chỉ trong vòng 4 ngày acid salicylic có thể cải thiện hàm lượng plumbagin tăng lên 1,78 lần so với đối chứng trong hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D burmanii 3.4.2.6 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của các kỹ thu t đã khảo sát Ở mỗi kỹ thu t tăng sinh đã khảo sát, nuôi cấy đồng loạt... còn 1 vết tròn rõ có Rf = 0,48 Kết quả cho phép cô lập được một hợp chất B (m=65mg) 3.2.2.2 Khảo sát hoạt tính của hợp chất cô lập được theo định hướng có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư ruột kết ở người DLD-1 Kết quả từ các thí nghiệm đếm tế bào bằng máy đếm và xác định kích thước tế bào Coulter counter cho thấy hợp chất B có khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào (IC50=3,53µM sau... huyền phù tế bào D burmanii theo quy trình nuôi cấy đã xác định và theo các nghiệm thức được xác định là thích hợp cho tăng sinh plumbagin đem xác định hàm lượng hoạt chất đích Kết quả cho thấy ở hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D burmanii, việc loại bỏ 2,4-D ra khỏi môi trường nuôi cấy khi tế bào bước vào giai đoạn giảm tăng 21 trưởng là một kỹ thu t hiệu quả nhất trong việc tăng sinh thu nhận plumbagin... tái sinh của các kỹ thu t đã khảo sát Ở mỗi kỹ thu t tăng sinh đã khảo sát, nuôi cấy đồng loạt hệ thống cây in vitro theo quy trình nuôi cấy đã xác định đem xác định hàm lượng plumbagin Kết quả chứng minh được hiệu quả của các kỹ thu t tăng sinh đã khảo sát Trong đó, việc sử dụng cao nấm men làm tác nhân cảm ứng trong thời gian 20 ngày là hiệu quả nhất cho hệ thống nuôi cấy D burmanii in vitro khi thu. .. huyền phù tế bào được tạo thành từ mô rễ (theo phương pháp trực tiếp hay gián tiếp thông qua mô sẹo) được chọn làm nguồn vật liệu đầu cho các thí nghiệm tăng năng suất thu nhận plumbagin ở bước tiếp theo 3.4.2 Ứng dụng một số kỹ thu t tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 3.4.2.1 Khảo sát đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào có mật độ tế bào nuôi ban... tuần, dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo lá và rễ đều có dấu hiệu tăng trưởng, các tế bào quan sát dưới kính hiển vi đa số đều có nhân to, hạt tinh bột mịn Thử nghiệm tạo dịch huyền phù trực tiếp từ lớp mỏng tế bào: sau 2 tuần, dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào có chứa nhiều cụm tế bào không nhân và hạt tinh bột lớn và một ít cụm tế bào có nhân to, hạt tinh... Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này Trong giới hạn của luận án, để nghiên cứu ứng dụng các kỹ thu t tăng sinh thu nhận hoạt chất trên Drosera, kết quả định lượng bằng HPLC giúp chọn 1 hoạt chất đích là plumbagin và đối tượng nghiên cứu được chọn trong hai loài là D burmanii 3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thu t làm... xuất thử nghiệm trên quy mô pilot plumbagin từ hệ thống nuôi cấy cây in vitro bằng hệ thống nuôi cấy tự động bioreactor với việc kết hợp các điều kiện nuôi và các kỹ thu t tăng năng suất thu nhận đã khảo sát, đặc biệt là kỹ thu t bổ sung tiền chất và sử dụng tác nhân cảm ứng cao nấm men Nghiên cứu tiếp tục một số kỹ thật tăng sinh có tiềm năng khác với đối tượng này mà luận án đã chưa có điều kiện tiếp... cao (2,5-5µM), hợp chất B làm giảm kích thước tế bào dần dần cho đến khi tế bào mất khả năng bám dính rồi chết So với resveratrol, một hợp chất ly trích từ vỏ trái nho đang được nghiên cứu sử dụng như một dược chất điều trị ung thư, tác dụng ức chế tăng sinh và phát triển của hợp chất B trên dòng tế bào DLD-1 khác hẳn: res cũng ức chế sự tăng sinh tế bào nhưng làm tăng kích thước tế bào trong 48 giờ . ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN o0o QCH NGƠ DIỄM PHƢƠNG KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VIỆC NI CẤY TẾ. suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các tác nhân đã khảo sát. 2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thu t làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy. chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thu t đã khảo sát Ở mỗi kỹ thu t tăng sinh đã khảo sát, nuôi cấy đồng loạt hệ thống cây in vitro theo quy trình nuôi cấy đã xác định đem