Đang tải... (xem toàn văn)
Để sản tăng cường xuất acarbose, trong nghiên cứu này dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 được tối ưu và hoạt chất acarbose trong dịch len men được tinh sạch để thu nhận acarbose có độ tinh sạch cao. Kết quả cho thấy, năng suất acarbose đã tăng từ 2,91 gl lên 9,98 gl trong môi trường có bổ sung 50 gl maltose, 30 gl glucose và 15 gl bột ngô, điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 25oC trong 192 giờ. Sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính, sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T và sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67 thu được acarbose có độ tinh sạch 98%, hiệu suất thu hồi đạt 73,1%. Hoạt chất acarbose tinh sạch có hoạt tính ức chế αglucosidase đạt 68,7 % tăng gấp 1,6 lần sau quá trình tinh sạch.
1 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161 LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC CHỮA BỆNH ðÁI THÁO ðƯỜNG Hà Thị Tâm Tiến 1 , Lê Thanh Hoàng 2 1. Mở ñầu Acarbose là một hợp chất hữu cơ giả ñường, tác dụng ức chế men α-glucosidase trong ruột non. Do ñó, acarbose ñược sử dụng rộng rãi trong ñiều trị bệnh ñái tháo ñường type 2, tạo cho bệnh nhân kiểm soát hàm lượng ñường trong máu tốt hơn sau khi ăn thức ăn chứa tinh bột [1]. Acarbose, một sản phẩm tự nhiên do các chủng Actinoplanes sinh tổng hợp ra [4]. Acarbose thương mại ñã ñược sản xuất từ sự lên men của các chủng Actinoplanes. Nhiều thí nghiệm về sự phân lập, lựa chọn các chủng Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose cao, tạo ra các chủng Actinoplanes ñột biến, các công thức môi trường, ñiều kiện lên men và quá trình tinh sạch acarbose ñã ñược thực hiện nhằm tăng năng suất acarbose. Gần ñây, Wei và cộng sự ñã tối ưu môi trường lên men cho chủng Actinoplanes sp. A56 sinh tổng hợp acarbose, hàm lượng acarbose tăng từ 837 lên 1043 mg/l khi tăng nồng ñộ maltose 30 g/l lên 61,25 g/l và nồng ñộ dịch chiết ngô từ 10 g/l lên 17,5 g/l [9]. Lên men có sự bổ sung cơ chất liên tục ñối với chủng Actinoplanes utahensis ZJB 08196 ñã ñạt năng suất 4878 mg/l acarbose, tăng 15,9 % so với phương pháp nuôi cấy thông thường [8]. Lên men với chủng Actinoplanes sp. A56 theo phương pháp bổ sung cơ chất ñã ñạt năng suất 5000 mg/l acarbose [3]. Việc bổ sung thêm các chất cảm ứng vào môi trường lên men ñể tăng năng suất acarbose cũng ñược nghiên cứu rộng rãi. Sun và cộng sự lên men chủng Actinoplanes utahensis ZJB 08196 có bổ sung thêm S-Adenosylmethionine, năng suất acarbose ñạt 6113 mg/l [6]. Xue và cộng sự lên men chủng Actinoplanes utahensis ZJB 08196 có bổ sung thêm validamine, năng suất acarbose ñạt 6606 mg/l [11]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tối ưu các thành phần môi trường lên men và ñiều kiện lên men ñối với chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 nhằm ñạt năng suất acarbose cao. Ngoài ra chúng tôi cũng tối ưu các ñiều kiện tách chiết tinh sạch acarbose từ dịch lên men ñể tìm ra một phương pháp tinh sạch tối ưu nhất, thu hoạt chất acarbose có ñộ tinh sạch cao. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu Chủng giống: Actinoplanes sp. KCTC 9161 có khả năng sinh tổng hợp acarbose ñược cung cấp từ bộ sưu tập chủng giống KCTC, Hàn Quốc. 2.2. Hóa chất Acarbose chuẩn, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), enzyme α-glucosidase (Sigma), NaCl, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 .3H 2 O, Na 2 CO 3 , Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 (Merck), HCl, ethanol, ethyl acetate, methanol, acid fomic (Trung Quốc), bột ngô, monosodium glutamate (Việt Nam) Hạt sắc ký: amberlite XAD 1600T, amberlite IRA67 (sigma), than hoạt tính (Việt Nam), bản sắc ký lớp mỏng silica gel 60 F254 (Merck). 2.3. Môi trường Môi trường thạch (g/l): 20 glucose, 5 peptone, 0,5 KCl, 1 K 2 HPO 4 , 0,5 MgSO 4 và 20 agar, pH 7. Môi trường nhân giống (g/l): 20 glucose, 5 peptone, 0,5 KCl, 1 K 2 HPO 4 và 0,5 MgSO 4 , pH 7 [7]. Môi trường lên men (g/l): 30 maltose, 30 glucose, 10 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl 2 , 2,5 CaCO 3 , 1,0 K 2 HPO 4 [5]. 2 2.4. Phương pháp Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật tối ưu các thành phần môi trường Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ñược nuôi nhân giống sau 96 giờ, tiếp 10% dịch nhân giống vào mỗi bình 1000 ml chứa 250 ml môi trường lên men theo các công thức thí nghiệm. Quá trình lên men sinh tổng hợp acarbose ñược nuôi trong ñiều kiện 28 o C, 200 vòng/phút trong 192 giờ. Sắc ký lớp mỏng TLC Sắc ký lớp mỏng (TLC) thực hiện trên bản mỏng silica gel, dày 0,25 mm, với hệ dung môi 94% (ethyl acetate: methanol = 1:1) và 6% (nước : acid formic = 5:2). Bản TLC chạy xong ñược sấy khô dung môi và xông hơi axit 10% (v/v) H 2 SO 4 trong ethanol, sau ñó ñốt hiện màu ở 110 o C ñể phát hiện các phân tử ñường có trong dịch mẫu. Sắc ký cột Cột than hoạt tính: Than hoạt tính ñun cách thủy 1 giờ trước khi nhồi cột. Dịch lên men ñược hấp phụ vào than hoạt tính trong ñiều kiện pH 2-3, khuấy nhẹ 1 giờ, sau ñó rửa bằng nước 8- 10 lần trước khi nhồi lên cột và giải hấp phụ acarbose bằng ethanol theo gradien nồng ñộ từ 0% ñến 20% [10]. Các phân ñoạn thu ñược TLC ñể kiểm tra khả năng tinh sạch. Cột trao ñổi ion: Amberlite XAD 1600T là chất trao ñổi cation dạng axít mạnh dựa trên mạng polystyrene. 10 ml mẫu ñược ñưa lên cột và rửa cột bằng nước sau ñó thu mẫu bằng hỗn hợp nước : acetone = 9:1 (v/v). Amberlite IRA67 là chất trao ñổi anion dạng base yếu dựa trên mạng acrylic của chất giá ñể trung hòa các chất axít mạnh. Hạt amberlite IRA67 ñược ngâm hoạt hóa bằng HCl 5% trong 2 giờ trước khi nhồi lên cột, sau ñó rửa cột bằng nước ñến khi pH trong cột ñạt 7 [2]. 10 ml mẫu ñược ñưa lên cột và rửa giải bằng nước ñể trung hòa dung dịch có chứa acarbose. Xác ñịnh hoạt tính ức chế α-glucosidase theo phương pháp của Yamaki và Mori năm 2006 Sử dụng khay vi thể 96 giếng, thí nghiệm (TN) ñược lặp lại 3 lần, có ñối chứng (ðC). Dịch nổi 20 µl ñược cho vào giếng TN, ñệm 0,5 M potasium phosphate buffer (PPB) 20 µl (pH 6,7) ñược cho vào giếng ðC, bổ sung vào mỗi giếng 50 µl emzyme α-glucosidase có nguồn gốc từ ruột chuột 25 mg/ml, 50 µl cơ chất 4-NPG (3mM), và 120 µl ñệm PPB, ủ hỗn hợp phản ứng ở 37°C. Sau khi ủ 45 phút, thêm 50 µl Na 2 CO 3 (0,67 M) vào mỗi giếng ñể kết thúc phản ứng [12]. Hỗn hợp phản ứng ñược ño ở bước sóng 415 nm trên máy Elisa reader (Biotek, ELx800, USA). Mức ñộ ức chế α-glucosidase ñược tính theo công thức: ∆E 415 ðC – ∆E 415 TN % ức chế = ∆E 415 ðC x 100 Trong ñó, ∆E 415 ðC và ∆E 415 TN là giá trị OD ño tại bước sóng 415 nm của các ống ðC và TN 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Môi trường và ñiều kiện nuôi cấy tối ưu Môi trường và ñiều kiện nuôi cấy tối ưu khi tiến hành lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ñạt ñược năng suất acarbose cao nhất gồm các thành phần (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl 2 , 2,5 CaCO 3 , 1,0 K 2 HPO 4 trong ñiều kiện pH 6,5, nhiệt ñộ 25 o C, tốc ñộ lắc 150 vòng/phút, 192 giờ nuôi cấy. Hoạt chất acarbose từ dịch lên men ñược xác ñịnh qua sắc ký ñồ TLC (Hình 1), theo ñó dịch lên men trước khi tối ưu (làn 1) và sau khi tối ưu (làn 2) ñều xuất hiện băng acarbose ngang chuẩn, trong ñó băng acarbose của dịch lên men sau tối ưu ñậm nét hơn chứng tỏ hàm lượng acarbose ñã tăng lên qua quá trình tối ưu. Mặt khác dịch lên men trước tối ưu xuất hiện nhiều 3 băng hơn dịch lên men sau tối ưu ñó là băng của các thành phần môi trường và các sản phẩm sinh tổng hợp khác, chứng tỏ sau khi tối ưu các thành phần môi trường ñã ñược sử dụng nhiều và hạn chế tạo ra các sản phẩm phụ khác. C 1 2 Hình 1. Sắc ký ñồ TLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong môi trường trước và sau tối ưu; 1: MT trước tối ưu; 2: MT sau tối ưu; C: chuẩn acarbose Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose trong dịch lên men sau quá trình tối ưu ñạt 54,2% tăng 5,4% so với trước khi tối ưu (Hình 2). Hàm lượng acarbose trong dịch lên men sau tối ưu ñạt 9,98 g/l, trong khi ñó hàm lượng acarbose trong dịch lên men trước tối ưu chỉ ñạt 2,91 g/l khi phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (Hình 3). Như vậy, sau quá trình tối ưu các thành phần môi trường lên men và các ñiều kiện nuôi lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ñã thu ñược hàm lượng acarbose cao tăng gấp 3,4 lần so với trước khi tối ưu. Hàm lượng acarbose ñạt ñược 9,98 g/l cao hơn hẳn so với các nghiên cứu khác trên thế giới. Li và cộng sự (2012) lên men chủng Actinoplanes sp. A56 ñạt năng suất 5000 mg/l acarbose [3]. Wang và cộng sự lên men chủng A. utahensis ZJB 08196 ñạt năng suất 4878 mg/l acarbose [8]. Sun và cộng sự lên men chủng A. utahensis ZJB 08196 năng suất acarbose ñạt 6113 mg/l [6]. Xue và cộng sự lên men chủng A. utahensis ZJB 08196 năng suất acarbose ñạt 6606 mg/l [11]. Hình 2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong môi trường trước và sau tối ưu 4 (a) Minutes 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 20 30 40 50 60 70 80 90 3.370 0.000 103529422 7.430 Acarbose 0.291 738010 RI 29-8-Ch ph3-F10. dat Retention Time Name ESTD concentration Area (b) Minutes 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 20 30 40 50 60 70 80 3.360 0.000 103925664 7.607 Acarbose 0.499 1264619 RI 29-8-Ch ph1-F20.d at Retention Time Name ESTD concentration Area Hình 3. Sắc ký ñồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 916 trong môi trường tối ưu; (a): Dịch lên men trước tối ưu; (b): Dịch lên men sau tối ưu 3.2. Tinh sạch acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase 3.2.1. Tinh sạch qua cột than hoạt tính 1 Dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ñược hấp thụ vào than hoạt tính, sau ñó giải hấp thụ bằng ethanol theo gradien nồng ñộ từ 0 ñến 20% ñể thu acarbose. Kết quả TLC (Hình 4) cho thấy khi thu mẫu bằng ethanol 15% ñã thu ñược acarbose từ phân ñoạn 14, nhưng ngoài băng acarbose còn thu ñược một băng khác cao hơn, ñến phân ñoạn 21 chỉ còn một băng acarbose duy nhất ngang chuẩn, sau ñó ñến phân phân 31 thì ñộ ñậm của băng acarbose giảm dần và xuất hiện nhiều băng phụ thấp hơn. Như vậy sau khi cho dịch lên men qua cột than hoạt tính 1 chúng tôi ñã thu ñược acarbose tinh sạch một phần tiếp tục ñược tinh sạch qua cột than hoạt tính 2 3.2.2. Tinh sạch qua cột than hoạt tính 2 Kết quả dịch tinh sạch gồm 3 nhóm chính: 20 ml ñầu tiên không có chất nào ñược ñẩy ra, 30 ml tiếp theo tạp chất ñược ñẩy ra, có một băng cao hơn chuẩn, 10 ml sau ñó acarbose ñã ñược ñẩy ra cùng với tạp chất (2 băng), 40 ml cuối cùng ñã thu ñược hoạt chất acarbose có một băng ngang với chuẩn (Hình 5). C 1 2 3 4 C 5 6 7 8 9 10 11 LC 12 13 14 15 16 C 17 18 19 20 LC 21 22 23 24 C 25 26 27 28 29 30 31 32 3 3 34 C 35 5 36 37 38 39 Hình 4. Sắc ký ñồ TLC các phân ñoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột than hoạt tính 1; LC: dịch lên men; 1-39: các phân ñoạn; C: chuẩn acarbose LC 20 C 21 22 23 24 25 26 27 C 28 29 30 31 32 33 34 35 36 C 37 38 39 40 41 Hình 5. Sắc ký ñồ TLC các phân ñoạn tinh sạch acarbose khi qua cột than hoạt tính 2 LC: dịch lên cột; 20-41: các phân ñoạn; C: chuẩn acarbose 3.2.3. Loại bỏ các ion thu acarbose tinh sạch Phân ñoạn có chứa acarbose ñược cô ñặc 90% ñể loại hết dung môi ethanol sau ñó ñưa lên cột trao ñổi cation dạng acid mạnh amberlite XAD 1600T. Cột ñược rửa bằng nước và sau ñó rửa giải bằng hỗn hợp dung môi nước : acetone = 9:1 (v/v). Các phân ñoạn chính có chứa acarbose lại ñược chạy qua cột trao ñổi anion dạng base yếu amberlite IRA67 và rửa giải bằng nước ñể trung hòa dịch có chứa acarbose. Kết quả thu ñược 60 ml dịch acarbose tinh sạch. Cô cạn phân ñoạn chứa acarbose thu ñược chất keo không màu. Chất keo này ñược kết tủa trong methanol tuyệt ñối cho chất bột màu trắng. 3.2.4. Xác ñịnh ñộ tinh sạch và hàm lượng acarbose trong dịch tinh sạch Hàm lượng acarbose trong dịch lên men và dịch tinh sạch ñược xác ñịnh bằng hệ thống HPLC ghép khối phổ (Tại Tổng cục Tiêu chuẩn ðo lường chất lượng). Kết quả sắc ký ñồ HPLC (Hình 6) cho thấy, ở cả 3 mẫu: acarbose chuẩn, dịch lên men và dịch acarbose tinh sạch ñều xuất hiện 1 peak tại thời gian lưu 0,666 phút, khối lượng phân tử 645,6 là peak của hoạt chất acarbose. Hàm lượng acarbose trong dịch lên men ñạt 10,48 mg/ml, trong dịch tinh sạch ñạt 191,5 mg/ml cao gấp 18,3 lần so với dịch lên men. Hoạt chất acarbose thu ñược có ñộ tinh sạch ñạt 98%. Hiệu suất thu hồi sau khi tinh sạch ñạt 73,1%. (a) 6 (b) (c) Hình 6. Sắc ký ñồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 ; (a) : chuẩn acarbose ; (b) : dịch lên men ; (c) : dịch tinh sạch 3.2.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase Kết quả hình 7 cho thấy, hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose tinh sạch ñạt 68,7%, tăng 1,6 lần so với dịch lên men (42,9%) và tăng 4,2 lần so với dịch qua cột than 1 (16,5%). Dịch qua cột than 2 có hoạt tính ñạt 58,0% cao hơn dịch lên men và dịch qua cột than 1 và thấp hơn dịch tinh sạch khi qua hai cột amberlite XAD 1600T và IRA67. Hình 7. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sau khi qua các cột tinh sạch; DLM: dịch lên men, DTS: dịch tinh sạch. 4. Kết luận Môi trường thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 gồm (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl 2 , 2,5 CaCO 3 , 1,0 K 2 HPO 4 trong ñiều kiện pH 6,5, nhiệt ñộ 25 o C, tốc ñộ lắc 150 vòng/phút và thời gian 192 giờ, cho năng suất ñạt 9,98 g/l acarbose tăng gấp 3,4 lần so với trước tối ưu. Tinh sạch acarbose bằng bằng sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính, sắc ký trao ñổi cation amberlite XAD 1600T và sắc ký trao ñổi anion amberlite IRA67 cho hiệu quả cao nhất. Hoạt chất acarbose thu ñược có ñộ tinh sạch 98%, hiệu suất thu hồi acarbose ñạt 73,1%. Tài liệu tham khảo 1. Hanefeld M, Schaper F, Koehler C (2008) Effect of acarbose on vascular disease in patients with abnormal glucose. Tolerance Cardiovasc Drugs Ther, 22: 225-231. 7 2. Hong CL, Kim KH, Choi BT, Choi S, Choi R (2003) "Process for preparing acarbose with high purity". United States Patent US 6649755B1. 3. Li KT, Hou J, Wei SJ, Cheng X (2012) "An optimized industrial fermentation processes for acarbose production by Actinoplanes sp. A56". Bioresource Technology 118 580-583. 4. Mahmud T (2003), "The C7N aminocyclitol family of natural products", Nat Prod Rep, 20, pp. 137-166 5. Nguyễn Thị Nương, ðỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Quyền ðình Thi (2013) "Nghiên cứu thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose ở Actinoplanes sp. KCTC 9161". Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 1 403-406. 6. Sun LH, Li MG, Wang YS, Zheng YG (2012) "Significantly enhanced production of acarbose in fed-batch fermentation with the addition of S-adenosylmethionine". Microbiol Biotechnol 22 826-831. 7. ðỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Vũ Văn Hạnh, Quyền ðình Thi (2011) "Sàng lọc một số chủng Actinoplanes sp. sinh tổng hợp cao chất acarbose có tính ức chế α-glucosidase", Tạp chí Công nghệ sinh học 9 861-865. 8. Wang YJ, Liu LL, Wang YS, Xue YP, Zheng YG, Shen YC (2012b) "Actinoplanes utahensis ZJB-08196 fed-batch fermentation at elevated osmolality for enhancing acarbose production". Bioresource Technology 103 337-342. 9. Wei SJ, Cheng X, Huang L, Li KT (2010) "Medium optimization for acarbose production by Actinoplanes sp. A56 using the response surface methodology". African Journal of Biotechnology 9 1849-1854. 10. Whistler RL, Durso DF (1949) "Chromatographic Separation of Sugar on Charcoal". Purdue University 72 667-679. 11. Xue YP, Qin JW, Wang YJ, Wang YS, Zheng YG (2013) "Enhanced production of acarbose and concurrently reduced formation of impurity C by addition of validaminein fermentation of Actinoplanes utahensis ZJB-08196". BioMed Research International 9 pages. 12. Yamaki K, Mori Y (2006) "Evaluation of α-glucosidase inhibitory activity in colored foods : a trial using slope factors of regression curves". Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi 53 (4): 229-231. . 1 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161 LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC CHỮA BỆNH ðÁI THÁO ðƯỜNG Hà Thị Tâm Tiến 1 ,. cao. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu Chủng giống: Actinoplanes sp. KCTC 9161 có khả năng sinh tổng hợp acarbose ñược cung cấp từ bộ sưu tập chủng giống KCTC, Hàn Quốc XAD 1600T và IRA67. Hình 7. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sau khi qua các cột tinh sạch; DLM: dịch lên men, DTS: dịch tinh sạch. 4.