BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ QUỲNH TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC CIRCOVIRUS (PCV2) VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ðỂ CHẨN ðOÁN BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ QUỲNH TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC CIRCOVIRUS (PCV2) VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ðỂ CHẨN ðOÁN BỆNH CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ NGÀNH : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : 1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ LAN 2. PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI – 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô khoa Thú y, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lan và TS. Nguyễn Bá Hiên đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô trong bộ môn Bệnh lý, các anh chị đang công tác tại Phòng thí nghiệm trung tâm trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội, gia đình và bạn bè đã giúp tôi thực hiện đề tài này. Tôi xin cảm ơn các chủ trang trại, các hộ chăn nuôi ở các tỉnh Bắc Giang, Thái Bình, Hưng Yên, Hải Dương, Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thu thập các mẫu bệnh phẩm ở địa phương. Cuối cùng, tôi xin kính chúc toàn thể các Thầy, Cô trong khoa Thú y cùng gia đình luôn mạnh khỏe và công tác tốt. Hà Nội, ngày 30 tháng 07 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Quỳnh Trang Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v Phần I: MỞ ðẦU 1 Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 3 2.1.1. Một số nghiên cứu trên thế giới 3 2.1.2. Một số nghiên cứu tại Việt Nam 6 2.2. HIỂU BIẾT VỀ CĂN BỆNH 7 2.2.1. Phân loại 8 2.2.2. Cấu trúc virus 9 2.2.3. Sức đề kháng 11 2.3. HIỂU BIẾT VỀ BỆNH DO PORCINE CIRCOVIRUS GÂY RA 11 2.3.1. Loài mắc bệnh 12 2.3.2. Lứa tuổi mắc bệnh 13 2.3.3. Chất chứa mầm bệnh 13 2.3.4. Đường xâm nhập 14 2.3.5. Cơ chế sinh bệnh 14 2.3.6. Triệu chứng lâm sàng 15 2.3.7. Bệnh tích 16 2.3.8. Chẩn đoán 18 2.3.9. Phòng và kiểm soát bệnh 20 Phần III: ðỐI TƯỢNG – NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23 3.3. NGUYÊN LIỆU 23 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.4.1. Phương pháp quan sát 24 3.4.2 Phương pháp mổ khám 25 3.4.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản 25 3.4.4. Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể 25 3.4.5. Phương pháp PCR 28 3.4.5.1. Phương pháp tách chiết DNA 30 3.4.5.2. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR 31 3.6. Xử lý số liệu 33 Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2 34 4.2. BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ CHỦ YẾU CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2 38 4.3. TỔN THƯƠNG VI THỂ CHỦ YẾU CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2 42 4.4. KẾT QUẢ PCR MỘT SỐ CƠ QUAN CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2 49 Phần V: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 51 5.1. KẾT LUẬN 51 5.2. ĐỀ NGHỊ 51 Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các vacxin phòng bệnh 22 Bảng 3.1. Cặp mồi đặc hiệu với đoạn gen ORF1 của PCV2 24 Bảng 3.2. Thành phần và thể tích cho phản ứng PCR 31 Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với gen ORF1 của PCV2 32 Bảng 4.1. Nguồn gốc các lợn sau cai sữa trong nghiên cứu 34 Bảng 4.2. Triệu chứng lâm sàng của lợn sau cai sữa nghi mắc PCV2 35 Bảng 4.3. Biến đổi bệnh tích đại thể của lợn sau cai sữa nghi mắc PCV2 39 Bảng 4.4. Biến đổi bệnh tích vi thể một số cơ quan lợn sau cai sữa nghi mắc PCV2 43 Bảng 4.5. Kết quả phản ứng PCR 49 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc virus PCV2 9 Hình 2.2 Mô hình các bước của phản ứng PCR 30 Hình 4.1 Lợn còi cọc, lông xù 37 Hình 4.2 Lợn tiêu chảy, phân màu nâu 37 Hình 4.3 Sưng hạch bẹn nông 37 Hình 4.4 Lợn chậm lớn 37 Hình 4.5 Lợn bị viêm da 37 Hình 4.6 Lợn biểu hiện thở khó 37 Hình 4.7 Gan sưng, tụ máu 41 Hình 4.8 Phổi xuất huyết 41 Hình 4.9 Hạch màng treo ruột sưng 41 Hình 4.10 Ruột xuất huyết 41 Hình 4.11 Thận sưng, xuất huyết 41 Hình 4.12 Hạch lympho sưng, xuất huyết 41 Hình 4.13 Gan sung huyết và thâm nhiễm tế bào viêm ( H.E 10X ) 46 Hình 4.14 Thâm nhiễm tế bào viêm ở gan lợn mắc PCV2 ( H.E 40X ) 46 Hình 4.15 Lách xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ( H.E 10X ) 46 Hình 4.16 Tim sung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ( H.E 10X ) 46 Hình 4.17 Phổi lợn mắc PCV2 sung huyết nghiêm trọng ( H.E 10X ) 46 Hình 4.18 Viêm phổi kẽ ( H.E 40X ) 46 Hình 4.19 Hạch lympho sung huyết 47 Hình 4.20 Thâm nhiễm tế bào bạch cầu ái toan và tế bào khổng lồ ở hạch ( H.E 40X ) 47 Hình 4.21 Tế bào khổng lồ ở lách 47 Hình 4.22 Thận xuất huyết 47 Hình 4.23 Tế bào khổng lồ nhiều nhân ở hạch lympho ( H.E 40X ) 47 Hình 4.24 Ruột thâm nhiễm tế bào viêm 47 Hình 4.25 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR 49 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1 Phần I MỞ ðẦU Ngành chăn nuôi ngày càng phát triển và giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế. Đặc biệt ngành chăn nuôi lợn đã có nhiều thay đổi đáng kể, đáp ứng nhu cầu thực phẩm của người dân. Chăn nuôi lợn đã trở thành nguồn thu nhập quan trọng và là một trong những ngành nghề góp phần dịch chuyển cơ cấu nền kinh tế nông nghiệp. Cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi, kéo theo đó là sự gia tăng về tình hình dịch bệnh, trong đó có bệnh do circovirus gây ra. Circovirus có 2 type porcine circovirus type 1 (PCV1) và porcine circovirus type 2 (PCV2). PCV1 không có tính gây bệnh, PCV2 được xem là tác nhân gây hội chứng còi cọc sau cai sữa ở lợn (PMWS - post weaning multisystemic wasting syndrome). Đã có rất nhiều nghiên cứu về virus này, trong đó có các nghiên cứu tìm hiểu kiểu gen của PCV2 ở các nước trên thế giới. Các nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hồng và cs (2006); T.Opriessnig và cs (2008) đã xác định trình tự nucleotide của PCV1 và PCV2 tương đồng nhỏ hơn 80% và tương đồng về aminoacid nhỏ hơn 70% đồng thời cũng xác định được PCV2 có rất nhiều subtype khác nhau như PCV-2a, PCV-2b, PCV- 2c, PCV-2d và PCV-2e. Circovirus không phải là một virus mới. Đây là một virus rất phổ biến trong chăn nuôi lợn từ trước tới nay, thậm chí có những đàn lợn tuy biểu lộ dương tính với Circovirus nhưng chẳng bao giờ thấy biểu hiện của bệnh. Tỷ lệ nhiễm PCV2 rất cao, có thể chiếm 90 - 100%, nhưng tỷ lệ lợn mắc bệnh PMWS điển hình lại rất thấp, chỉ khoảng 5 - 15%. Tuy nhiên PMWS không chỉ do Circovirus gây ra, dù nó được xem là một yếu tố cần thiết và PCV2 không chỉ liên quan tới PMWS, gần đây người ta sử dụng thuật ngữ “bệnh đồng hành với porcine circovirus” (Porcine Circovirus Associated Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 2 Disease - PCVAD) để chỉ tất cả các bệnh liên quan tới PCV2 xảy ra trên lợn bao gồm: PMWS, phức hợp bệnh hô hấp trên lợn (PRDC), viêm phổi hoại tử tiến triển trên lợn (PNP), bệnh tiêu chảy, hội chứng viêm da và viêm thận (PDNS - Porcine Dermatitis and Nephoropathy Syndrome). Cho đến nay, PCV2 có mặt tại hầu hết khắp các quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Tỷ lệ nhiễm PCV2 ở Việt Nam tương đối cao và tăng qua các năm. Nguyễn Tiến Hà (2008) kiểm tra 1073 mẫu huyết thanh lợn đực giống và lợn nái ở 8 tỉnh thành phía Nam trong các năm 2000-2006; tỷ lệ huyết thanh dương tính chiếm 38,9% năm 2000 và 96,47% năm 2006. Tại miền Bắc các nghiên cứu về Circovirus vẫn còn hạn chế. Bệnh do Cirovirus gây ra gần đây mới được quan tâm nên việc nghiên cứu tìm hiểu bệnh có ý nghĩa quan trọng, góp phần bổ sung lý luận về bệnh và vào quá trình chẩn đoán, phòng và trị bệnh đạt hiệu quả, giảm thiệt hại do bệnh gây ra. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên, được sự đồng ý của Khoa Thú Y, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Bộ môn Bệnh lý, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số ñặc ñiểm bệnh lý của lợn mắc Circovirus (PCV2) và ứng dụng kỹ thuật PCR ñể chẩn ñoán bệnh”. Mục ñích nghiên cứu của ñề tài - Làm rõ các đặc điểm triệu chứng lâm sàng, bệnh lý đại thể, vi thể của một số cơ quan trên lợn mắc PCV2. - Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh. Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 3 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 2.1.1. Một số nghiên cứu trên thế giới Từ tháng 5 - 2003 đến tháng 8 - 2005 Zong và cs đã tiến hành thu thập ngẫu nhiên 1250 mẫu huyết thanh và các mẫu mô lợn nghi nhiễm PCV2 bao gồm: lách, gan, hạch lympho từ 6 quận huyện ở Hàng Châu, tỉnh Chiết Giang. Sử dụng phương pháp ELISA đã phát hiện thấy 40% mẫu huyết thanh dương tính với PCV2. Đồng thời, bằng phương pháp PCR trên các mẫu mô cho thấy tại Hàng Châu đang lưu hành ngoài chủng PCV2 Trung Quốc còn lưu hành rộng rãi các chủng PCV2 khác trên thế giới như: Hà Lan, Canada, Mỹ, Đức và Vương Quốc Anh. Năm 2010, Long và cs đã sử dụng phương pháp PCR-RELP đã xác định được 19 chủng PCV2 đang lưu hành tại Trung Quốc chia làm 3 kiểu gen trong đó kiểu PCV-2d là kiểu gen mới và kiểu gen PCV-2a, PCV-2b là hai kiểu gen phổ biến tại Trung Quốc. Năm 2010, Jun và cs đã gây nhiễm trên 48 chuột chủng Côn Minh cho thấy virus nhân lên trong chuột, chuột chết sau 7, 14, 28 và 42 ngày gây nhiễm tương ứng. Bằng phương pháp PCR tìm thấy kháng thể trong huyết thanh chuột gây nhiễm, virus PCV2 trong mô lympho chuột. Tổn thương vi thể do PCV2 tập trung và gây suy giảm chức năng các hạch lympho, thỉnh thoảng thấy hoại tử tế bào lympho, vỏ não và hành tủy ở những con chuột được gây nhiễm . Năm 1998 những trường hợp đầu tiên của PMWS được mô tả ở Thái Lan nhưng có nghiên cứu chỉ ra đã phát hiện PMWS trên lợn từ năm 1993. Dựa vào phương pháp PCR khảo sát sơ bộ tỷ lệ nhiễm PCV2 ở Thái Lan là [...]... c a PCV2 - PCR (polymerase chain reaction): ñư c s d ng ñ phát hi n axit nucleic c a PCV2 v i ñ chính xác và ñ nh y cao (Choi và cs., 2000) Có các bi n th khác như: multiplex PCR, nested PCR, multiplex-nested PCR, quantitative real time PCR, reverse transcriptase (RT) PCR - Lai t i ch (In situ hybridization – ISH): s d ng m t ñ u dò DNA phù h p v i m t ño n ñ c bi t c a b gen PCV2 (Kim và Chae, 2003)... thái gi ng như Circovirus nhưng chúng ñư c x p vào m t chi khác – Anellovirus b i vì nh ng ñ c ñi m riêng bi t khác 2.2.1 Phân lo i Các thành viên trong h Circoviridae có h t virus, và h gen ph n nào gi ng nhau nhưng v sinh thái h c, ñ c tính sinh h c và tính kháng nguyên khá khác bi t Hi n t i h Ciroviridae chia làm hai chi Circovirus và Gyrovirus Chi Circovirus g m virus gây b nh m và lông, canady... còi c c, ch m l n D a vào tri u ch ng t n thương và phát hi n kháng nguyên trong mô, nghiên c u ñã ch ra có 23,4% (162/629) l n, 50,4 % (65/129) tr i dương tính v i PCV2 Trong ñó, t l ch t c a l n 30 - 120 ngày tu i m c PMWS là 0,1 - 30% Theo Kwang năm 2009 phương pháp nested -PCR (nPCR) nh y hơn phương pháp PCR thông thư ng g p 104 l n nPCR ngoài giúp phân bi t 2 lo i virus PCV1 và PCV2 còn giúp phân... S suy gi m các t bào b ch c u, viêm u h t các cơ quan g m mô lympho, ph i, gan và th n (3) Tìm th y kháng nguyên PCV2 trong các mô t n thương Ch n ñoán PCV2 ch có các d u hi u lâm sàng và t n thương b nh lý là không ñ , và không có d u hi u lâm sàng và t n thương b nh lý cũng có th nghi ng m c PCV2 Ch n ñoán lâm sàng D a vào tri u ch ng lâm sàng ñ c trưng: L n b nh là còi c c ch m l n, thư ng xuyên... là ñư c 3.4.5 Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction): Các nghiên c u ch ra r ng phương pháp PCR là phương pháp nh y nh t ñ phát hi n PCV2 Tuy nhiên, giá thành c a phương pháp này còn cao K thu t PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân b n m t ño n DNA mong mu n t h gen DNA c a cơ th sinh v t thành nhi u b n sao, ñư c Kary mullis và c ng s phát minh vào năm 1985 K thu t này... hành phân tích ñ c tính di truy n và so sánh ñ c tính di truy n virus PCV2 l n r ng và virus PCV2 l n trong nư c, k t qu th y PCV2 c a hai l n r ng liên quan ch t ch t i nhau và cùng nhóm v i ch ng phân l p t l n r ng Hungari John C.S.Harding và cs năm 1998 ñã xác ñ nh d ch t h c và tri u ch ng lâm sàng c a l n m c PMWS: l n sau cai s a t l t vong ñ t m c cao nh t vào tháng 9 c a d ch (7,67%), sau... canady virus, goose virus, pigeon virus, porcine circovirus type 1 và porcine circovirus type 2 Virus gây thi u máu gà là m t nhánh thu c chi Gynovirus Porcine circovirus PCV1 phân l p ñư c ñ u tiên ð c năm 1974 t dòng t bào th n l n PK15 nhi m lâu dài virus này, các nghiên c u huy t thanh ban ñ u cho th y virus có m t trong t t c các con l n ki m tra Nh ng nghiên c u g n ñây, s d ng nhi u hơn các ph n... này và kho ng cách ngư ng 0,035, ki u gen c a PCV2 ñư c g i tên là PCV2a, PCV2b, PCV2c Tháng 10 năm 2009, Wang và cs xu t b n bài báo “Genetic varition analysis of Chinese strain of porcine circovirus type 2” trong 40 h gen PCV2 ñư c phân l p trong kho ng nh ng năm 2004 – 2008 ñư c so sánh và ñưa ra s t n t i c a 2 ki u gen PCV2 m i là PCV2d và PCV2e 2.2.2 C u trúc virus Hình 2.1 C u trúc virus PCV2 Circovirus. .. ñ t ng t, co gi t Nghiên c u c a Welch J và cs (2006); Yilmaz A và cs (2004), trong ñàn v i tri u ch ng PMWS m c nh , d u hi u m c ñ khác nhau tùy thu c vào quá trình qu n lý chăm sóc, nhưng d nh n th y nh t là dũi mõm liên t c Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 15 Khi có các y u t stress, nuôi chung l n các l a tu i làm tăng nguy cơ m c b nh và bi u hi n PMWS... Canada b ng phương pháp PCR ñư c Gagnon C.A và cs (2007) s d ng và ñã phát hi n ra ki u gen m i khác v i ki u gen PCV2 trên Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 5 l n nhưng không ph i loài m i và ñư c g i là “PCV-2b” Năm 2011, nhóm tác gi ñã thu th p m u b nh ph m ch y u là h ch và huy t thanh t 23 con l n r ng có ngu n g c t khu v c ñ a lý khác nhau Rumani trong . Nội và Bộ môn Bệnh lý, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu một số ñặc ñiểm bệnh lý của lợn mắc Circovirus (PCV2) và ứng dụng kỹ thuật PCR ñể chẩn ñoán bệnh . Mục ñích nghiên cứu của. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ QUỲNH TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC CIRCOVIRUS (PCV2) VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ðỂ CHẨN. cứu của ñề tài - Làm rõ các đặc điểm triệu chứng lâm sàng, bệnh lý đại thể, vi thể của một số cơ quan trên lợn mắc PCV2. - Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh. Trường ðại Học Nông