ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  HÀ THỊ PH Ƣ ỢNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2010 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  HÀ THỊ PH Ƣ ỢNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. CHU HOÀNG MẬU Thái Nguyên - 2010 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS. Chu Hoàng Mậu- Phó Giám đốc Đại học Thái nguyên và TS. Chu Hoàng Hà - Phó Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm , Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình h ƣ ớng dẫn , ch bảo , hêt long giúp đỡ tôi trong suốt qua trinh nghiên cƣu va thực hiện đê tai luận văn . Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS .TS. Lê Trần Bình - Nguyên Viên tr ƣ ơng Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ va tạo mọi điều kiện thuận lợi đê tôi hoàn thành luận văn cua minh . Tôi xin chân thành cảm ơn TS . Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Tr ƣ ơng Đại học khoa hoc tƣ nhiên –ĐH Thái nguyên và CN . Hoàng Ha - Phòng Công nghệ tế bào thực vật , Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đê tai luận văn . Trong quá trình thƣc hiên đê tai , tôi đã nhân đƣợc sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các cán bộ Khoa sau đại học, Tr ƣ ờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học. Tôi xin cảm ơn lanh đao tr ƣ ờng THPT Đông Hy , các bạn đng nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn Cuối cùng tôi rất biết ơn những ngƣời thân trong gia đình, các ban cua tôi đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 8 năm 2010 Tác gi luận văn Hà Th Ph ƣ ợng MỤC LỤC Trang phu bia Trang Lơi cam ơn Nh ƣ ng chƣ viêt tăt Danh muc cac bang trong luân an Danh muc cac hinh trong luân an MỞ ĐẦU………………………………………………………… 1 Ch ƣ ơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………… 4 1.1. CÂY ĐÂU T Ƣ ƠNG VA ĐĂC TINH CHIU HAN CỦA CÂY ĐẬU T Ƣ ƠNG 4 1.1.1. Cây đậu tƣơng…………………………… …………… 4 1.1.2. Đặc tính chịu hạn của cây đậu t ƣ ơng………… ……… … 8 1.2. CHÂT ƢC CHÊ CYSTATIN VA GEN CYSTATIN Ở THỰC VÂT VA CÂY ĐÂU T Ƣ ƠNG 12 1.2.1. Chât ƣc chê Cystatin 12 1.2.1.1. Giơi thiêu chung vê Cystatin ơ sinh vât 12 1.2.1.2. Phân loại Cystatin 13 1.2.1.3. Cấu trúc, chức năng của Cystatin thực vật 15 1.2.2. Gen ma hoa Cystatin ơ thƣc vât va cây đâu t ƣ ơng… . …….….… 19 1.3. ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN T TRONG PHÂN LÂP GEN 21 Ch ƣ ơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CU 28 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CU 28 2.1.1. Vật liệu thực vật 28 2.1.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 29 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CU 29 2.2.1. Đánh gía kh năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng ph ƣ ơng pháp gây hạn nhân tạo 29 2.2.2. Xử lý kết qu và tính toán số liệu 31 2.2.3. Ph ƣ ơng pháp sinh học phân tử 31 2.2.3.1. Ph ƣ ơng pháp tách chiết ARN tổng số từ mầm đậu tƣơng 31 2.2.3.2. Ph ƣ ơng pháp điện di ADN trên gel agarose 32 2.2.3.3. Ph ƣ ơng pháp RT-P 32 2.2.3.4. Ph•¬ng ph¸p g¾n gen vµo vector t¸ch dßng 35 2.2.3.5. BiÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5 36 2.2.3.6. Ph•¬ng ph¸p PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c (colony-PCR) 36 2.2.3.7. Tách chiêt plasmit 37 2.2.3.8. Ph ƣ ơng pháp xác định trình tự gen bằng thiết bị tự động( N) 37 Ch ƣ ơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA HẠT VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU T Ƣ ƠNG NGHIÊN CỨU . 38 3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích thƣớc và khối lƣợng hạt 5 giống đậu tƣơng nghiên cứu 38 3.1.2. Kh năng chịu hạn của 5 giống đậu t ƣ ơng 39 3.2. KÊT QUA PHÂN LÂP VA XAC ĐINH TRINH T Ƣ GEN CYSTATIN Ơ ĐÂU T Ƣ ƠNG 40 3.2.1. Tách chiết ARN tông sô 40 3.2.2. KÕt qu¶ RT-PCR 43 3.2.3 KÕt qu¶ biÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5α 44 3.2.4 Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp 46 3.2.5. Kết quả tách chiết ADN plasmid 47 3.2.6. Kết quả kiểm tra các dòng plasmid 48 3.2.7. Kết qu giải trình tự nucleotit 49 KÊT LUÂN VA ĐÊ NGHI ……………… ………………. … 58 CÔNG TRINH CÔNG BÔ LIÊN QUAN ĐÊN LUÂN VĂN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic ASTT Áp suất thẩm thấu ATP- aza Enzym phân giải ATP Bp Cặp bazơ cADN Sợi ADN bổ sung đƣợc tổng hợp từ mARN nhờ enzyme phiên ma ng ƣ ợc dNTP Deoxynucleotid cs Công s ƣ DHA Docosa Hexaenoic Axit EDTA Ethylendiamin tetraacetic axit EPA Eicosa Pentaenoic axit HSP Heat shock protein - Protein sốc nhiệt HSG Heat Shock Granules HSPL Hệ số pha loãng Kb Kilo bazơ = 1000 bp LEA Late embryogenesis abundant MGPT Môi giới phân tử - Molecular chaperone MW Molecular weight - Khối lƣợng phân tử PCR Polymeraza chain reaction - Phản ứng chuỗi polimeraza DANH MC CÁC BẢNG Bảng Tên Bang Trang 2.1 Nguồn gốc, đăc điêm của 6 giống đậu tƣơng nghiên cứu 30 2.2 Thành phần phản ứng của PCR 24 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 37 2.4 Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT 38 3.1 Màu sắc, sô lƣơng và khối lƣợng hạt của 6 giống đậu tƣơng nghiên cứu 42 3.2 Đanh gia kha năng chiu han cua 6 giông đậu t ƣ ơng nghiên cứu 45 3.3 Hê sô tƣơng đông va hê sô khac nhau cua gen cystatin ở 10 giông đâu tƣơng (%) 58 DANH MC CÁC HÌNH Hình Tên Hinh Trang 2.1. Sơ đ vector pBT 38 3.1 Hình ảnh hạt của 6 giống đậu tƣơng nghiên cứu 42 3.2 Hình ảnh cây đậu tƣơng 3 lá trƣớc khi xử lý hạn 44 3.3 Hình ảnh cây đậu tƣơng 3 lá sau khi xử lý hạn 44 3.4 Kết qu tách chiết RNA tổng số 46 3.5 KÕt qu¶ PCR nhân gen cu a giông đâu tƣơng Thai Nguyên 48 3.6 Kết qu biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào kh biến E. coli DH5α 49 3.7 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pUC18F- 50 3.8 Kết qu tách ADN plasmid tái tổ hợp 51 3.9 Kết qu cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI 52 3.10 Trình tự trình tự nucleotid của mẫu nghiên cứu Thái Nguyên và 4 mâu giông đâu tƣơng đa công bô trên genbank 54 3.11 Biêu đô hinh cây so sanh mƣc tƣơng đông gen cystatin cua 10 giông đâu t ƣ ơng 59 3.12 Trình tự axit amin cua mâu nghiên cƣu Thai Nguyên va 4 mâu giông đâu tƣơng đa công bô trên genbank 60 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu tƣơng Glycine max (L.) Merrill là loại cây có vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp, có giá trị kinh tế và hàm lƣợng dinh d ƣ ỡng cao. Hạt đậu tƣơng chứa 30%- 46% protein, 12%-25% lipit, và nhiều loại vitamin (B1, B2, C,D, E, K…), chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin, xystein, lizin…), là ngun năng lƣợng cần thiết cho con ng ƣ ời. Cây đậu t ƣ ơng có thời gian sinh tr ƣ ởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm, tạo kh năng cố định nitơ không khí thành chất hữu cơ nên cây đậu tƣơng th ƣ ờng đƣợc trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc màu. Vì vậy trồng đậu t ƣ ơng góp phần cải tạo đất và bảo vệ môi tr ƣ ờng. Với những giá trị to lớn đó, mà cây đậu t ƣ ơng đƣợc trồng phổ biến ở nhiều nƣơc trên thế giới, phát triển mạnh ở Mỹ, Braxin, Argentina , Trung Quốc va Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây đậu tƣơng đƣợc gieo trồng ở c 7 vùng nông nghiệp trên c nƣớc với nguồn gen rất đa dạng và phong phú, gồm các giống nhập nội, giống lai tạo, giống đột biến và tập đoàn các giống địa phƣơng. Sự đa dạng và phong phú đó chính là nguồn nguyên liệu phục vụ cho công tác giống nhằm chọn tạo những giống đậu tƣơng mới cho năng suất và chất lƣợng phù hợp với mục tiêu chọn giống [9]. Những giống đậu t ƣ ơng địa phƣơng thƣờng có năng suất thấp, nhƣng lại có chất lƣợng hạt tốt và kh năng chống chịu cao đôi với các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh. Trong những năm gần đây diễn biến khí hậu ngày càng phức tạp, lƣợng mƣa phân bố không đều giữa các vùng và giữa các thờì kỳ trong năm nên hạn hán và nắng nóng kéo dài cùng với sự biến đổi của các yếu tố môi tr ƣ ờng khác đã tác động xâu đến sự sinh tr ƣ ởng và phát triển, làm giảm năng suất và [...]... 2008), ở lúa (Ngô Mạnh Dũng và cs 2008) và ở một số loài cây nhƣ đậu đũa, cỏ dại… Đối với cây đậu tƣơng việc nghiên cứu về cystatin và gen mã hóa protein này vẫn còn là vấn đề mới mẻ Từ những lý do trên tôi đã chọn và tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là: ' 'Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương" 2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định khả năng chịu hạn. .. Porcel và cs (2005), đã chỉ ra rằng, gen mã hoá protein dehydrin (LEA-DII) có vai trò với khả năng chống chịu hạn của đậu tƣơng Ở Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây đậ u tƣơng, công trinh đanh gia khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) phân lập các gen liên quan đến khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tƣơng Nghiên cứu phân. .. hạn và phân nhóm khá c nhau vê mƣc đô chiu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu; - Phân tich đăc điêm cua gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 3 Nội dung nghiên cứu - Phân tích khả năng phản ứng đối với hạn của các giống đậu tƣơng ở giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo; - Tách chiết ARN tổng số từ hạt đậu tƣơng ở giai đoạn hạt non; - Thu thâp thông tin vê gen cystatin. .. cứu tìm hiểu cở sở phân tử của đặc tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tƣơng, [8], [12], [17], [32] Tuy nhiên, sự hiểu biết về gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng vẫn còn vẫn còn rât ít và chƣa đƣợc đầy đủ Cystatin là chất ức chế có bản chất protein Sự biểu hiện của các gen cystatin thƣờng trong điều kiện hạn, lạnh, mặn và ở các pha riêng rẽ của quá trình sinh trƣởng, phát triển... proteinase Gen cystatin là gen đã đƣợc khẳng định có mối liên quan với khả năng chịu hạn của thực vật Cystatin và gen mã hóa cystatin cũng đã đƣợc nghiên cứu ở cây đậu xanh (Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cs, 2008), ở lúa của Ngô Mạnh Dũng và cs, (2008) đa nhân bản gen cystatin ở cây lúa từ ADN tổng số bằng kỹ thuật PCR, tách dòng thành công gen cystatin từ các giống lúa nghiên cứu có kích thƣớc phân tử khoảng... thực vật Ở rễ cây dẻ (Castanea sativan) gặp lạnh, sốc muối, stress nóng thì mức độ phiên mã tăng mạnh ở cả tế bào rễ và tế bào lá Cystatin ở cây dẻ không chỉ liên quan đến phản ứng tự vệ với các mầm bệnh và sâu hại mà còn liên quan đến khả năng chống lại tác động bất lợi của các nhân tố môi trƣờng Cystatin và gen mã hóa cystatin cũng đã đƣợc nghiên cứu ở cây đậu xanh (Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cs,... , thiết kế và tổng hợp cặp mồi để nhân gen cystatin; - Tạo dòng cADN từ mARN băng phan ƣng phiên ma ngƣơc va gen cystatin bằng kĩ thuật PCR; - Đọc trình tự nucleotide cua gen cystatin ở cây đậu tƣơng nhân Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Cây đậu tƣơng Đậu tƣơng là cây họ đậu (Fabaceae) có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill Họ... , gen nay gôm 1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin [10] Nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tƣơng bằng phƣơng phap đôt biên thƣc nghiêm cua Chu Hoang Mâu (2001) Nguyễn Thị Thu Hiền (2005), phân lập đƣợc gen dehydrin với kích thƣớc 751bp liên quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống đậu tƣơng vàng Mƣờng Khƣơng và Cao Bằng 4 [5] Hoàng Thị Thu Yến và cs (2003), Chu Hoang Mâu va cs (2006) đã phân lập. .. hƣởng Khả năng thực vật có thể giả m thiểu mức tổn thƣơng do thiếu hụt nƣớc gây ra gọi là tính chịu hạn Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trƣờng nhƣ hạn, nóng, lạnh, Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây, giả m năng. .. gen nào quy định tính chịu hạn của cây mà chỉ tách chiết và phân lập các gen có liên quan Nghiên cứu bản chất của tính chịu hạn ngƣời ta tiếp cận theo hai hƣớng chính: (1) Khả năng bảo vệ của tế bào khỏi tác động bât lơi của điều kiện cực đoan thông qua vai trò của nhóm protein sốc nhiệt (heat shock protein- HSP) Các nhóm chất này liên quan đến sự bảo vệ các enzyme, các cấu trúc trong tế bào và . Brasil dự báo sẽ đạt 67 ,5 triệu tấn, tăng 1 ,5 triệu tấn so với dự báo trƣớc đây và tăng so với 57 ,5 triệu tấn năm ngoái. Sản lƣợng của Argentina ƣớc tính đạt 54 triệu tấn, tăng 0,7 triệu. đậu t ƣ ơng là Đông Nam châu Á, nhƣng 45% diện tích trồng đậu tƣơng và 55 % sản lƣợng đậu t ƣ ơng của thế giới nằm ở Mỹ. Nƣớc Mỹ sản xuất 75 triệu tấn đậu t ƣ ơng năm 2000, trong. RT-P 32 2.2.3.4. Ph•¬ng ph¸p g¾n gen vµo vector t¸ch dßng 35 2.2.3 .5. BiÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5 36 2.2.3.6. Ph•¬ng ph¸p PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c (colony-PCR)