Nghiên cứu tạo chế phẩm aspergillus niger không sinh độc tố để phòng chống nấm mốc và độc tố ochratoxin a trên cà phê

103 579 1
Nghiên cứu tạo chế phẩm aspergillus niger không sinh độc tố để phòng chống nấm mốc và độc tố ochratoxin a trên cà phê

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I  ðÀO TH HƯƠNG NGHIÊN C U T O CH PH M ASPERGILLUS NIGER KHƠNG SINH ð C T ð PHỊNG CH NG N M M C VÀ ð C T OCHRATOXIN A TRÊN CÀ PHÊ LU N VĂN TH C SĨ NÔNG NGHI P Chuyên ngành : Công ngh Sinh h c Mã s : 60.42.02.01 Gi ng viên hư ng d n : TS Tr n Th Mai TS Nguy n Văn Giang HÀ N I - 2013 L I CAM ðOAN Tơi xin cam đoan s li u k t qu nghiên c u lu n văn hồn tồn trung th c chưa đư c s d ng ñ b o v m t h c v Tơi xin cam đoan m i s giúp ñ cho vi c th c hi n lu n văn ñã ñư c c m ơn thơng tin trích d n lu n văn đư c ghi rõ ngu n g c Tác gi lu n văn ðào Th Hương Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… i L I C M ƠN ð hoàn thành lu n văn t t nghi p này, tơi nh n ñư c s hư ng d n, giúp đ góp ý nhi t tình c a anh ch em đ ng nghi p t i B mơn nghiên c u Công ngh sinh h c sau thu ho ch – Vi n Cơ n nơng nghi p Công ngh sau thu ho ch Và s hư ng d n, góp ý c a quý th y tồn th cán b B mơn Cơng ngh vi sinh – Khoa Công ngh Sinh h c – Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i Trư c h t, xin chân thành c m ơn đ n q th y Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i, ñ c bi t nh ng th y t n tình d y b o cho su t th i gian h c t p t i trư ng Tôi xin g i l i bi t ơn sâu s c ñ n TS Tr n Th Mai TS Nguy n Văn Giang ñã dành r t nhi u th i gian tâm huy t hư ng d n nghiên c u giúp tơi hồn thành lu n văn t t nghi p Tôi xin g i l i c m ơn chân thành t i GS TS Nguy n Thùy Châu ThS Nguy n Văn Nguy n - Vi n Cơ n nơng nghi p Cơng ngh sau thu ho ch ch nhi m ñ tài nghiên c u d án “Hồn thi n cơng ngh s n xu t ch ph m vi sinh ñ phòng ch ng n m sinh ñ c t đ c t n m m c ngơ, l c, cà phê” anh ch em ñ ng nghi p ñã t o m i ñi u ki n đ tơi hồn thành lu n văn Tơi xin chân thành c m ơn gia đình b n bè ñã t o r t nhi u ñi u ki n, giúp đ tơi h c t p hoàn thành t t lu n văn t t nghi p Hà N i, Ngày 03 tháng 04 năm 2013 H c viên ðào Th Hương Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ii M CL C L i cam ñoan i L i c m ơn ii M cl c iii Danh m c ch vi t t t vi Danh m c b ng vii Danh m c hình ix Danh m c đ th x M ð U 1.1 ð tv nñ 1.2 M c tiêu 1.3 N i dung nghiên c u T NG QUAN 2.1.1 ð i cương v cà phê Robusta 2.1.2 ð c ñi m cà phê 2.1.3 ð c ñi m ñ t tr ng cà phê 2.2.1 Ngu n g c ñ c t ochratoxin 2.2.2 Các lo i đ c t ochratoxin 2.2.3 Tính ch t ochratoxin 2.2.4 ð c tính c a ochratoxin A 10 2.3 S t o ñ c t s nhi m ochratoxin A nông s n 11 2.3.1 S t o ochratoxin A b i n m m c 11 2.3.2 Con ñư ng sinh t ng h p ochratoxin A 12 2.3.3 S nhi m ochratoxin A nông s n th c ph m 14 2.3.4 M c ñ nhi m n m m c sinh ñ c t ñ c t ochratoxin A cà phê Vi t Nam Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 16 iii 2.3.5 S t o ñ c t c a A niger 17 2.4.1 Tình hình phịng ch ng ñ c t ochratoxin A th gi i 21 2.4.2 Tình hình nghiên c u 22 2.5.1 Bi n pháp ngăn ng a, h n ch ñ c t n m m c 22 2.5.2 Kh nhi m ochratoxin A b ng h p ph sinh h c 23 2.5.3 Phòng ch ng ochratoxin A phương pháp ñ i kháng c nh tranh 24 V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 26 3.1.1 ð i tư ng nghiên c u: 26 3.1.2 Hóa ch t 26 3.1.3 Môi trư ng 26 3.1.4 Thi t b d ng c 27 3.2.1 Phương pháp l y m u cho phân tích ochratoxin A 28 3.2.2 Phương pháp xác ñ nh m c ñ nhi m m c cà phê 28 3.2.3 Phương pháp phân l p n m m c 29 3.2.4 Xác ñ nh ñ 31 3.2.5 Phương pháp ñ nh lư ng m t ñ Aspergillus niger ch t Vi t nam m 31 nuôi c y ch ph m 3.2.6 Phương pháp xác ñ nh nhanh ch ng n m sinh khơng sinh đ c t ti n hành theo phương pháp c a K Yabe c ng s 32 3.2.7 Xác ñ nh s t o orchratoxin A c a ch ng Aniger 32 3.2.8 Phương pháp phân tích ochratoxin A cà phê 32 3.2.9 Phương pháp xác ñ nh kh gi m ochratoxin A b ng ch ng A niger không sinh ochratoxin A 36 3.2.10 Nuôi c y n m m c Aspergillus niger qui mơ phịng thí nghi m 36 3.2.11 Phương pháp s n xu t bào t A niger qui mô 100kg/m 36 3.2.12 Phương pháp t o ch ph m AN 37 3.2.13 Phương pháp b trí thí nghi m v i cà phê ngồi đ ng ru ng 37 3.2.14 Phương pháp theo dõi su t y u t c u thành su t 38 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iv 3.2.15 Ki m tra ch t lư ng ch ph m m c sau th i gian b o qu n 38 3.2.16 Phương pháp x lý s li u th ng kê 38 K T QU VÀ TH O LU N 39 4.1 Xác ñ nh kh sinh ñ c t ochratoxin A c a ch ng A niger 39 4.2 Nghiên c u kh c nh tranh, gi m ñ c t c a ch ng A niger không sinh v i ch ng sinh OTA hàm lư ng cao 4.2.1 Hi u qu gi m ñ c t OTA c a ch ng sinh ñ c t cao b ng ch ng không sinh ñ c t 4.2.2 42 ðánh giá kh c nh tranh c a ch ng A niger AN2 v i ch ng 44 A niger pec2 sinh ñ c t ochratoxin A cao 4.3 42 Nghiên c u công ngh nhân nuôi t o ch ph m AN ch a ch ng A niger AN2 phòng ch ng n m m c ñ c t ochratoxin A cà phê 45 4.3.1 ði u ki n lên men th i gian thu h i sinh kh i A niger AN2 45 4.3.2 Nghiên c u công ngh nuôi c y b m t s n xu t bào t ch ng 46 A niger AN2 quy mơ phịng thí nghi m 4.3.3 Nghiên c u s n xu t bào t 4.3.4 Qui trình s n xu t ch A niger AN2 ph m AN t quy mơ 100 kg/m ch ng A niger AN2 đ phịng ch ng n m m c đ c t ochratoxin A nhi m cà phê 4.5.1 52 Hi u qu c a ch ph m AN ñ n b nh n m, sinh trư ng su t cà phê t i vùng th nghi m 4.5.2 50 56 Hi u qu phòng ch ng n m m c ñ c t ochratoxin A cà phê c a ch ph m AN 58 4.5.3 ðánh giá ch t lư ng ch ph m AN 61 K T LU N VÀ KI N NGH 64 TÀI LI U THAM KH O 66 PH L C 72 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… v DANH M C CÁC CH VSV: vi sinh v t OTA: VI T T T ochratoxin A A niger: Aspergillus niger KLPT: kh i lư ng phân t KPHð: khơng phát hi n đư c HPLC: s c ký l ng cao áp & cs: c ng s v/ph: vòng/ phút bao bì PP: bao bì polypropylene Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vi DANH M C B NG STT 2.1 Tên b ng Trang Thành ph n h u cơ, vơ khống đ t tr ng cà phê t i huy n Cư Kuin – ð c L c 2.2 Gi i h n nhi m OTA cho phép s s n ph m 16 4.1 Kh sinh OTA c a ch ng Aspergillus niger phân l p t 39 cà phê ñ t tr ng cà phê 4.2 Hi u qu gi m OTA c a ch ng A niger pec2 b ng ch ng A 43 niger khơng sinh đ c t 4.3 M t đ bào t c a ch ng A niger AN2 t o ñư c môi 47 trư ng khác 4.4 Kh t o bào t c a ch ng A niger AN2 nhi t đ ni c y khác 4.5 nh hư ng c a ñ 48 m mơi trư ng đ n kh t o bào t c a 48 ch ng A niger AN2 4.6 nh hư ng c a th i gian ni c y đ n kh t o bào t c a 49 ch ng A niger AN2 4.7 nh hư ng c a t l ti p gi ng t i m t ñ bào t 4.8 nh hư ng c a ñ dày kh i 4.9 t i m t ñ bào t M t ñ bào t A niger AN2 ch t mang A niger AN2 A niger AN2 50 51 th i gian b o qu n khác 52 4.10 T l r ng qu su t cà phê 57 4.11 M t ñ vi sinh v t có kh sinh OTA đ t 58 4.12 T l nhi m n m m c sinh ñ c t hàm lư ng OTA h t cà phê sau thu ho ch sau th i gian b o qu n khác Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 59 vii 4.13 4.14 K t qu phân tích ch ph m bào t m c ch ng A niger AN2 nh hư ng c a th i gian b o qu n ch ph m ñ n m t ñ bào t A niger AN2 4.15 61 61 nh hư ng c a th i gian b o qu n ch ph m ñ n ho t tính gi m ochratoxin A Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nơng nghi p ……………………… 62 viii DANH M C HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Con đư ng sinh t ng h p ochratoxin A 14 2.2 Hình dáng khu n l c A niger 18 2.3 Hình d ng bào t 18 4.1 Ch ng A niger Pec2 ch ng A niger AN2 4.2 Xác ñ nh kh sinh ñ c t c a ch ng b ng phương pháp n m A niger 40 s c kí b n m ng 41 4.3 S c kí đ HPLC ch ng AN pec2 42 4.4 S c kí đ HPLC ch ng AN2 42 4.5 Kh c nh tranh c a ch ng A niger AN2 khơng sinh đ c t ch ng A niger pec2 sinh ñ c t OTA cao 45 4.6 ðư ng cong sinh trư ng c a ch ng A niger AN2 46 4.7 Hi u qu th nghi m cà phê sau 12 tháng b o qu n 60 4.8 S c ký ñ hàm lư ng ochratoxin A cà phê lơ thí nghi m, KPHð Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 60 ix Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 78 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 79 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 80 NGHIÊN C U KI M SOÁT N M M C VÀ ð C T OCHRATOXIN A TRÊN CÀ PHÊ C A N M M C ASPERGILLUS NIGER KHÔNG SINH ð C T ðào Th Hương, 1.Nguy n Văn Nguy n, 1.Nguy n H ng Hà, 1.Vũ Th Hương, 1.Vũ Thu Di m, 1.Nguy n ð c Quân, 1Tr n Th Mai, 1Nguy n Thùy Châu, TÓM T T 13 ch ng A niger b sưu t p n m m c c a B môn nghiên c u Công ngh sinh h c sau thu ho ch – Vi n Cơ n Nơng nghi p Cơng ngh sau thu ho ch phân l p t cà phê ñ t tr ng cà phê ñư c s d ng đ xác đ nh ch ng khơng sinh ochratoxin A đánh giá kh ki m sốt n m Aspergillus niger, Penicillinum sinh ochratoxin A ðã xác ñ nh ch ng A niger AN2 không sinh ñ c t ch ng A niger pec2 sinh ñ c t ochratoxin A cao v i hàm lư ng 50ppb Hi u qu gi m ochratoxin A c a ch ng A niger pec2 b ng ch ng A niger AN2 ñ t 82,5%, k t qu cho th y ch ng A niger AN2 có tri n v ng t t vi c gi m ochratoxin A c a ch ng A niger sinh ochratoxin A cà phê giai đo n ngồi đ ng Ch ph m AN s n xu t t ch ng A niger AN2 khơng sinh đ c t giúp gi m 86% n m m c Aspergillus niger, Penicillinum sinh ñ c t gi m 100% ñ c t n m m c ochratoxin A cà phê giai đo n ngồi đ ng q trình b o qu n T khóa: Ochratoxin A, n m m c, A niger, ch ph m AN, cà phê Vi n Cơ n Nơng nghi p Công ngh Sau thu ho ch I M ð U nư c ta, cà phê ñư c tr ng r ng rãi đóng vai trị tr ng y u có giá tr kinh t r t cao Theo th ng kê c a Hi p h i cà phê ca cao Vi t Nam (Vicofa), hi n c nư c ta có kho ng 530 000 ñ t tr ng cà phê, t p trung ch y u t i t nh Tây Nguyên, ñó ð c L c t nh có di n tích cà phê cao nh t nư c kho ng 190.765 Khí h u nóng m u ki n thu n l i cho n m m c phát tri n gây t n th t l n cho cà phê giai ño n sau thu ho ch Ngoài thi t h i v ch t lư ng cà phê, n m m c sinh ñ c t ochratoxin A ñ c bi t nguy hi m v i s c kho ngư i ñ ng v t kinh t Theo nghiên c u c a Z Ilic c ng s [15], k t qu cho th y 93% m u cà phê nhi m n m m c ch y u A niger, 8,7% s sinh ñ c t ochratoxin A Nghiên c u c a S L Leong c ng s v cà phê Vi t Nam cho th y h u h t m u ki m tra ñ u nhi m n m m c ch y u nhi m A.niger [12] Theo báo cáo c a Nguy n Văn Thư ng [2], h u h t m u cà phê nhi m n m m c A niger, nhi u m u ki m tra phát Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 81 hi n ochratoxin A m c 3-6ppb, v y hàm lư ng đ c t có th s tăng lên trình b o qu n Nguy n Thùy Châu c ng s [1], ki m tra cà phê t i khu v c Tây Nguyên sau tháng b o qu n h u h t nhi m n m m c A.niger sinh ochratoxin A, 20% m u phân tích ch a ochratoxin A v i hàm lư ng t 1-10ppb ðã có nhi u phương pháp ñư c nghiên c u, áp d ng ñ lo i b ochratoxin A b ng hóa ch t, chi u x Các phương pháp mang l i hi u qu làm t n h i đ n ch t lư ng nơng s n, dư lư ng hóa ch t sau x lý m t v n ñ gây m t an toàn th c ph m Ngày nay, vi c lo i b n m m c sinh ñ c t ñ c t n m t trư c thu ho ch b ng ch ng n m m c ñ i kháng ñang ñư c quan tâm Vi c phòng ch ng n m m c sinh ochratoxin A ñã ñư c nhi u nhà khoa h c c a nư c Brazin, Pháp, M nghiên c u Các tác gi Ringot D [10], Bejaoui H [5] cho th y ch ng A niger khơng sinh đ c t có kh c ch ch ng A niger, A ochraceus Penicillium sinh ochratoxin A theo ch c nh tranh K t qu ñã ñư c c ng ñ ng châu Âu công nh n khuy n cáo s d ng ch ng A niger không sinh ñ c t ñ phòng ch ng Ochratoxin A ngơ giai đo n ngồi đ ng nư c ta có nhi u cơng trình nghiên c u v m c ñ nhi m n m m c đ c t , bi n pháp phịng tr ñ c t lương th c, th c ph m Tuy nhiên hi u qu c a phương pháp cơng b h u h t v n chưa cao chưa phù h p v i th c ti n s n xu t M c tiêu c a nghiên c u n ch n ch ng n m m c Aspergillus niger khơng sinh đ c t có kh ki m sốt n m m c đ c t n m m c ochratoxin A cà phê ñ m b o an toàn cho ngư i s d ng môi trư ng V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U V t li u a Nguyên li u 13 ch ng A niger b sưu t p n m m c c a B môn Nghiên c u Công ngh sinh h c sau thu ho ch ñư c phân l p t m u ñ t, cà phê t i hai t nh ð c L c ð c Nông b Các môi trư ng - Môi trư ng th ch khoai tây (PDA) - Môi trư ng Czapex – Dox (g/l) - Môi trư ng Czapek c i ti n (g/l): (môi trư ng phát hi n nhanh kh sinh khơng sinh đ c t ochratoxin A c a n m m c): (NH4) H2PO4: 10, K2HPO4: 1, MgSO4.7H2O Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 82 0,5, KCl 0,5, FeSO4.7H2O 0,01, sucrose 30, HgCl2, Corn steep liquor 0,5, th ch 20, pH 5,5, 1at/25 phút c Hóa ch t, thi t b d ng c liên quan ph c v phân tích n m m c ñ c t ochratoxin A Phương pháp a Phương pháp l y m u ñ t m u cà phê theo phương pháp c a FAO [7] b Phân l p n ch n n m m c ti n hành theo Rapper Fennel [9] c Phân tích t l nhi m m c phân l p n m m c bên h t cà phê theo phương pháp ñ t h t ñĩa th ch c a Christensen [6] d Xác ñ nh m t ñ t bào n m m c theo phương pháp pha loãng hàng lo t e Phương pháp xác ñ nh nhanh ch ng n m sinh khơng sinh đ c t ochratoxin A ti n hành theo phương pháp c a N D Davis [8] f Xác ñ nh s t o ochratoxin A c a ch ng A.Niger ti n hành theo Tanaka c ng s [13] g Phân tích ochratoxin A cà phê theo phương pháp c a Shimomura Ishikuro [11] h Phương pháp b trí thí nghi m v i cà phê ngồi đ ng ru ng - ð a ñi m th nghi m: ð i 32, xã Ea Ktur, huy n Cư Kuin, t nh ð c L c - Quy mô: 2ha, gi ng cà phê: Robusta, tr ng năm 1987 - Th i ñi m bón: 6/2012, mùa mưa t i Tây Nguyên - Cơng th c thí nghi m: Ch ph m AN + Phương pháp canh tác hi n t i c a đ a phương - Cơng th c đ i ch ng: Phương pháp canh tác hi n t i c a đ a phương, lơ đ i ch ng khơng bón ch ph m AN lơ m t chân đ t v i lơ bón ch ph m M i ch đ chăm sóc cà phê đư c ti n hành cơng th c ñ i trà - S d ng ch ph m: 100g/g c cà phê, tr n ñ u v i đ t b t r i bón r i xung quanh g c theo hình chi u tán lá, bón xong tư i nh nư c lên b m t n u ñ t chưa ñ m i Phương pháp b o qu n h t cà phê: Cà phê thu ho ch sau phơi s y tách v , ñ m ñ t 12,5% ñư c ti n hành b o qu n bao PP bên bao d a bên Cà phê ñư c b o qu n kho ñi u ki n thoáng mát Ch tiêu theo dõi: m c ñ nhi m n m m c ñ c t n m m c ochratoxin A ñ t tr ng cà phê cà phê h t Th i ñi m thu ho ch ñư c xác ñ nh th i ñi m cà phê ñư c tách v phơi khơ đ n đ m b o qu n 12,5% Các th i ñi m b o qu n sau đư c tính t th i ñi m thu ho ch ñã xác ñ nh Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 83 I K T VÀ TH O LU N Xác ñ nh ch ng n m m c A niger không sinh ñ c t ki m soát n m m c ñ c t n m m c ochratoxin A cà phê a Kh sinh ñ c t c a ch ng A niger phân l p t cà phê ñ t tr ng cà phê T 13 ch ng n m m c Aspergillus niger b sưu t p ch ng gi ng c a B môn Nghiên c u Công ngh sinh h c sau thu ho ch, ti n hành ñánh giá kh sinh không sinh ñ c t ochratoxin A môi trư ng Czapek c i ti n dư i tia UV 254nm B ng Kh sinh OTA c a ch ng Aspergillus niger phân l p t cà phê ñ t tr ng cà phê STT Kí hi u ch ng Phát quang OTA AN3 Y u AN4 KPHð AN1 M nh AN2 KPHð AN5 KPHð AN6 KPHð ANpec2 R t m nh AN9 Y u AN7 KPHð 10 AN8 M nh 11 AN12 KPHð 12 AN10 KPHð 13 AN11 Y u Chú thích: KPHð: khơng phát hi n đư c K t qu b ng cho th y, ch ng A.niger phân l p t cà phê ñ t tr ng cà phê t i ð c L c ð c Nơng, chúng tơi xác đ nh ñư c ch ng AN1, AN pec2 AN8 có kh phát quang m nh, ch ng AN pec2 phát quang m nh nh t có th k t lu n ch ng có kh sinh đ c t ochratoxin A cao Các ch ng AN2, AN4, AN5, AN6, AN7, AN10, AN12 khơng phát hi n kh sinh đ c t s ch ng AN2, AN7 AN12 có khu n l c phát tri n m nh môi trư ng nuôi c y, ch n ch ng cho thí nghi m ti p theo Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 84 T k t qu ti n hành xác ñ nh kh sinh ñ c t ochratoxin A c a ch ng b ng phương pháp s c ký b n m ng K t qu phân tích s c kí b n m ng ch ng AN2, AN3, AN8 AN pec2 th hi n hình M1 M2 C2 M3 M4 Hình 1: Kh sinh đ c t c a ch ng b ng phương pháp s c kí b n m ng Chú thích: C2: Ochratoxin A chu n n ng ñ 0,5ng/ml; M1: Rf c a ANpec; M2: Rf c a ch ng AN8; M3: Rf c a ch ng AN3; M4: Rf c a ch ng AN2 (khơng sinh) K t qu phân tích s c kí b n m ng cho th y ch ng AN3, AN8 AN pec2 có Rf tương ñương v i Rf chu n ñ c t ochratoxin A n ng đ 0,5ng/ml Rf c a ch ng AN pec2 m nh nh t Ch ng n m m c A niger AN2 không sinh ñ c t có kh sinh trư ng phát tri n m nh, ch n A niger AN2 ANpec2 cho thí nghi m ti p theo T k t qu phân tích s c kí b n m ng, ti n hành phân tích hàm lư ng đ c t ochratoxin A c a A niger AN2 ANpec2 b ng HPLC, k t qu th hi n hình hình 3: Hình S c kí đ HPLC ch ng AN pec2 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nơng nghi p ……………………… 85 Hình S c kí đ HPLC ch ng AN2 B ng phân tích s c kí l ng cao áp, chúng tơi xác đ nh đư c ch ng AN2 khơng sinh đ c t ch ng AN pec2 sinh ñ c t ochratoxin A v i hàm lư ng 50ppb T k t qu trên, ti n hành thí nghi m đánh giá hi u qu gi m ochratoxin A c a ch ng AN pec2 b ng ch ng khơng sinh đ c t n ch n t b ng b Hi u qu gi m ochratoxin A c a ch ng n m m c sinh ñ c t cao b ng ch ng khơng sinh đ c t Ti n hành nuôi h n h p v i t ng ch ng A.niger khơng sinh đ c t (1,0 x 106 CFU/ml), nuôi c y ch t ngơ đư c xác đ nh khơng có ochratoxin A, ñi u ki n nhi t ñ 300C, ñ m 20%, cho A.niger sinh trư ng, phát tri n Sau ngày nuôi c y ki m tra hi u qu gi m ñ c t ochratoxin A c a t ng ch ng A niger không sinh ochratoxin A ñ i v i ch ng sinh ochratoxin A cao B ng Hi u qu gi m OTA c a ch ng A niger pec2 b ng ch ng A niger khơng sinh đ c t TT Cơng th c thí nghi m S n lư ng ochratoxin A (ppb) Hi u qu gi m ochratoxin A(%) Ch ng sinh ñ c t A niger pec2 ñơn ñ c 50 Ch ng A.niger AN2, AN7, AN12 đơn đ c KPHð Ni h n h p ch ng A.niger AN2 khơng sinh đ c t A.niger pec2 sinh ñ c t 8,7 82,5 Nuôi h n h p ch ng A.nigerAN7 không sinh ñ c t A.niger pec2 sinh ñ c t 19 62 Nuôi h n h p ch ng A.niger AN12 khơng sinh đ c t A.niger pec2 sinh ñ c t 24,5 51 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 86 K t qu b ng cho th y ch ng A niger không sinh ñ c t có kh c ch s t o ochratoxin A c a ch ng A niger AN pec2, hi u qu c ch c a ch ng AN2 cao nh t, ñ t 82,5% K t qu cho th y ch ng A niger AN2 có tri n v ng t t vi c gi m ochratoxin A c a ch ng A niger sinh ochratoxin A cà phê giai đo n ngồi đ ng Chúng tơi ti n hành ñánh giá kh c nh tranh c a ch ng A.niger AN2 v i ch ng A.niger pec2 c Kh c nh tranh c a ch ng A.niger AN2 v i ch ng A.niger sinh ñ c t cao ð ki m tra s c nh tranh c a ch ng A.niger AN2 v i ch ng A.niger pec2 sinh đ c t cao, chúng tơi s d ng 2x102 CFU c a ch ng A.niger AN2 2x102 CFU khu n l c A.niger pec2 thu n t c y môi trư ng Czapeck – dox c i ti n v trí đ nh v , theo dõi thí nghi m trình ni c y B ng 3: Kh c nh tranh c a ch ng A.niger AN2 v i ch ng A.niger pec2 Ngày Ch ng A Niger AN2 khơng sinh đ c t Ch ng A Niger pec2 sinh đ c t ni c y 50ppb ð c ñi m KL ðư ng ð c ñi m KL ðư ng kính KL (cm) kính KL (cm) Bơng tr ng, khơng phát quang 2,0 dư i đèn UV Bơng tr ng, s i bào t đen, Khu n l c màu ñen, m c tương 2,0 dư i đèn UV 2,8 khơng phát quang Bơng tr ng, phát quang Bơng đen, phát quang 2,6 r t m nh 4,1 Khu n l c màu ñen, 4,0 phát quang r t m nh ñương v i ch ng sinh đ c t , khơng phát quang Khu n l c màu ñen, phát tri n 6,2 Khu n l c màu ñen, b r t m nh l n án ch ng sinh ñ c ch ng khơng sinh đ c t , khơng phát quang 2,3 t m c trùm lên Phát quang y u dư i ñèn UV Khu n l c màu ñen, phát tri n r t m nh, g n l n án hoàn 8,2 Khu n l c cịn đ m nh màu đen, g n khơng phát quang 0,7 tồn ch ng sinh đ c t ; không Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 87 phát quang K t qu cho th y kh phát tri n vư t tr i c a ch ng A.niger AN2 so v i ch ng A.niger pec2 môi trư ng nuôi c y Sau ngày, khu n l c n m A.niger AN2 g n l n át hoàn toàn khu n l c n m sinh ñ c t A.niger pec2 ðây s quan tr ng kh ng ñ nh thêm kh c nh tranh, ng d ng c a ch ng A.niger AN2 trư c ch ng sinh đ c t đ phịng ch ng n m m c sinh ñ c t ñ c t ochartoxin A cà phê Sau ngày M t sau ((-): ch ng không sinh OTA; (+) : ch ng sinh OTA) M t trư c Hình Kh c nh tranh c a ch ng A niger AN2 v i ch ng A niger pec2 sinh ñ c t cao Kh ki m soát n m m c sinh ñ c t OTA ñ t tr ng cà phê c a ch ph m AN T nghiên c u ti n hành s n xu t ch ph m AN ch a 3x109 CFU/g ch ng A niger AN2 không sinh đ c t b ng phương pháp ni b m t Ch ph m ñư c th nghi m cà phê, hi u qu ki m soát n m m c sinh ñ c t ochratoxin A ñ t tr ng cà phê th hi n b ng B ng 4: M t ñ vi sinh v t có kh sinh OTA ñ t Ch ng Vi sinh v t (CFU/g) Lô ð i Ch ng Lơ Thí Nghi m Trư c thí nghi m Th i m thu ho ch cà phê Trư c thí nghi m Th i m thu ho ch cà phê Không phát hi n đ pha lỗng 10-1 Khơng phát hi n đ pha lỗng 10-1 Khơng phát hi n đ pha lỗng 10-1 6x104-3x105 A niger sinh OTA 3x103-2x104 3x103-6x104 3x103-2x104 1,0x101 Penicillium 2x101-1x102 4x101-2x102 3x101-1x102 1,4x101 A.niger không sinh OTA Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 88 sinh OTA K t qu phân tích m u đ t c hai lơ đ i ch ng thí nghi m cho th y T i hai th i ñi m phân tích, lơ đ i ch ng ph n l n ñ t cà phê nhi m loài n m m c có kh sinh ochtatoxin A Aspergillus niger Penicillium v i m t ñ t i trư c thí nghi m A niger 3x103-2x104 CFU/g Penicillium 2x101-1x102 CFU/g M t ñ ch ng n m m c t i th i ñi m thu ho ch cà phê tăng lên v i m t ñ A niger 3x1036x104 CFU/g Penicillium 4x101-2x102 CFU/g Trong đó, lơ ng d ng ch ph m AN cho th y sau bón ch ph m AN, ch ng A.niger khơng sinh ñ c t ch ph m ñã phát tri n r t t t, l n át ch ng sinh ñ c t A.niger Penicillinum M t đ hai lồi n m m c có kh sinh ochratoxin A gi m ch 1,0x101 1,4x101 CFU/g M t ñ ch ng A.niger AN2 không sinh ochratoxin A tăng lên rõ r t trư c sau bón ch ph m đ t 6x104-3x105 CFU/g Kh ki m soát n m m c ñ c t ochratoxin A cà phê c a ch ph m AN Cà phê ñư c l y m u vào v thu ho ch tháng 10/2011 t i ñ a ñi m th nghi m ch ph m M u cà phê h t t i th i ñi m thu ho ch, sau tháng 12 tháng b o qu n ñư c phân tích m c ñ nhi m n m m c sinh ñ c t ochratoxin A K t qu đư c trình bày b ng sau: B ng 5: T l nhi m n m ñ c t ochratoxin A cà phê sau thu ho ch sau th i gian b o qu n Lơ ð i Ch ng Lơ Thí Nghi m Th i gian T l nhi m Hàm lư ng T l nhi m Hàm lư ng phân tích A.niger sinh OTA (%) ochratoxin A(ppb) A.niger sinh OTA (%) ochratoxin A(ppb) Sau thu ho ch - 1,14 KPHð Sau 06 tháng 75 2,1 KPHð Sau 12 tháng 95 6,2 KPHð KPHð: Không phát hi n ñư c (dư i ngư ng phát hi n c a phương pháp, 1,2ng/g) K t qu b ng cho th y, t i th i ñi m thu ho ch, lơ đ i ch ng t l nhi m n m m c ñ c t ochratoxin A ñã ñư c phát hi n tăng nhanh trình b o qu n Sau 12 tháng b o qu n t l nhi m m c 95% hàm lư ng ñ c t ochratoxin A lên t i 6,2ppb Trong u ki n, cà phê lơ thí nghi m khơng phát hi n ñ c t ochratoxin A t l nhi m n m m c r t th p (1-2%) t i th i ñi m thu ho ch su t trình b o qu n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 89 K t qu cho th y, ch ng n m m c A.niger AN2 có hi u qu cao ki m sốt n m m c đ c t ochratoxin A cà phê ðây s ñ ng d ng ch ph m AN ch a ch ng A.niger AN2 trư c ch ng n m m c sinh đ c t đ phịng ch ng n m m c sinh ñ c t ñ c t ochartoxin A cà phê II K T LU N ðã xác ñ nh ñư c kh sinh ñ c t ochratoxin A c a 13 ch ng A niger b sưu t p n m m c c a B môn nghiên c u Công ngh sinh h c sau thu ho ch – Vi n Cơ n Nơng nghi p Cơng ngh sau thu ho ch Trong xác đ nh ch ng A niger AN2 khơng sinh đ c t có kh sinh trư ng, phát tri n t t nh t ch ng A niger pec2 sinh ochratoxin A cao nh t v i hàm lư ng 50ppb ðã xác ñ nh kh gi m ñ c t ochratoxin A c a ch ng A niger pec2 b ng ch ng khơng sinh đ c t Trong hi u qu gi m ochratoxin A c a ch ng A niger AN2 ñ t cao nh t 82,5% K t qu cho th y ch ng A niger AN2 có tri n v ng t t vi c ki m soát n m m c ñ c t ochratoxin A c a ch ng A niger sinh ñ c t phê cà giai đo n ngồi đ ng Ch ph m AN ch a ch ng A niger AN2 không sinh đ c t có hi u qu gi m 86% n m m c Aspergillus niger, Penicillinum sinh ñ c t gi m 100% ñ c t n m m c ochratoxin A cà phê giai ño n ngồi đ ng q trình b o qu n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 90 TÀI LI U THAM KH O Nguy n Thùy Châu (2010) Độc tố nấm mốc nông sản biện pháp phòng trừ NXB Nông nghiệp Nguy n Vn Thư ng c ng s (2006) SPECIAL R&D REPORT ON THE FAO-VIET NAM COFFEE PROJECT, TCP/VIE/2903 (A) TCVN 4326:2001 (ISO 6496:1999) Xác ñ nh ñ m hàm lư ng ch t bay Abarca M.L., Bragualt M.R., Castella G., Cabanes F.J., 1994 Ochratoxin Aproduction by strains of Aspergillus niger var niger, Applied and Environmental Microbiology 60, 2650–2652 Bejaoui H., Mathieu F, Tailadier P Lebrihi A 2006 Feb Biodegradation of ochratoxin A by Aspergillus section Nigri species isolated from Franch grapes: a potential means of ochratoxin A decontamination in grape juices and must FEMS Microbiol Lett.; 255(2): 203-8 Christensen Clyde, M, 1969, Kaufmann Henry-Grain Storage, Mineapolis University of Minesota Press FAO/WHO/UNEP, 1999) Third Joint FAO/WHO/UNEP International Conference on Mycotoxins, Tunis, Tunisia, 3–6 March 1999 (MYC-CONF/99/8a), Geneva, WHO N D Davis, J W Searcy and U L Diener; 1969 “ Production of ochratoxin A by A.ochraceus in a semisythetic Medium “ American society for Microbiology Rapper , Fennel, 1965 The genus Aspergillus Williams & Wilkins 10 Ringot D, Lerzy B, Chaplain K, Bonhoure JP, Auclair E, Larondelle Y 2006, In Vitro biosoption of ochratoxin A on the yeast industry by- products: Comparison of isotherm model Bioresou Technol Aug 17 11 Shimomura, Ishikuro,1990 Liquid chromatographic analysis of ochratoxin A in cereal grains Journal of Mycotoxins, Japanese Associacion of Mycotoxins, 145 12 S L Leong et al Ochratoxin A-producing Aspergilli in Vietnamese green coffee beans Letters in applied microbiology 45(3):301-6 13 Tanaka K, Kushiro M and Manabe2M, 2008 A review of studies and measures to improve the mycotoxicological safety of traditional Japanese mold-fermented foods Mycotoxin Research Volume 22, Number p 153-158 14 Varga J, Rigo K, Teren J., 2000 Degradation of ochratoxin A by Aspergillus species, Int J Food Microbiol.; 59(1-2): 1-7 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 91 15 Z Ilic et al , 2007 Survey of Vietnamese coffee beans for the presence of ochratoxigenic Aspergilli, Mycopathologia (impact factor: 1.65); 163(3):177-82 CONTROL OF ASPERGILLUS NIGER TOXIGENIC STRAINS AND OCHRATOXIN A IN COFFEE BEANS BY ASPERGILLUS NIGER ATOXIGENIC STRAIN 1 Dao Thi Huong, Nguyen Van Nguyen, 1.Nguyen Hong Ha, 1.Vu Thi Huong, 1.Vu Thu Diem, 1.Nguyen Duc Quan, 1Tran Thi Mai, 1Nguyen Thuy Chau, Abstract Collection of 13 Aspergillus niger strains of Department of Post harvest biotechnology – Vietnam Institute of Agricultural engineering and Post harvest technology had been isolated from coffee beans and coffee-growing soil samples A niger AN2 was identified to be non-toxic, while the strain A niger Pec2 was toxigenic strain, which produced 50ppb of ochratoxin A A niger was proved to effectively inhibit ochratoxin A synthesized by A niger Pec2, namely 82.5% This result indicated that A niger AN2 had a prospect of reducing ochratoxin A synthesized by A niger on coffee seed The goal of this project is to propose a production process of AN product consisting non-toxigenic A niger AN2 in order to protect coffee plants against toxigenic fungi and ocharatoxin A Application of AN product consisting non-toxigenic A niger AN2 for prevention of toxigenic fungi on coffee plants on the field was able to reduce 86% population of Aspergillus niger, Penicillium and 100% of ochratoxin A Key words: Ochratoxin A, fungi, Aspergillus niger, AN product, coffee plant Vietnam Institute of Agricultural engineering and Post harvest technology Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 92 ... m c sinh ochratoxin A xác ñ nh kh t o ñ c t ochratoxin A ch ng phân l p cà phê ñ t tr ng cà phê vùng tr ng ñi m - Nghiên c u kh c nh tranh c a ch ng Aspergillus niger không sinh ochratoxin A v... chăn ni cà phê (Abarca et al Năm 1994; Belli et al, 2004.) Vi c phòng ch ng n m m c A niger A ochraceus sinh ochratoxin A ngô cà phê ñã ñ c nhi u nhà khoa h c c a nư c Brazin, Pháp, M nghiên c... Jacobsen, 2002) G n ñây, năm 2002 Fazekas c ng s ñã kh o sát m c ñ nhi m ochratoxin A c a cà phê Hungari N ng đ trung bình c a ochratoxin A 50 m u cà phê là: cà phê rang 0,5µg/kg, cà phê pha

Ngày đăng: 24/10/2014, 12:11

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • Trang bìa

    • Mục lục

    • 1.Mở đầu

    • 2.Tổng quan

    • 3.Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

    • 4.Kết quả và thảo luận

    • 5.Kết luận và kiến nghị

    • Tài liệu tham khảo

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan