BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** ðÀO THANH VÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 2.3.2.1B PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI , 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** ðÀO THANH VÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 CLADE 2.3.2.1B PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 PGS.TS. NGUYỄN VIẾT KHÔNG 2 PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI , 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan: Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này trung thực, do tôi tiến hành nghiên cứu và thu thập, có sự hợp tác, giúp ñỡ của các ñồng nghiệp và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan: Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện ñề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án ñều ñược cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận án ñều chính xác và ñược nêu rõ nguồn gốc. Hà nội, tháng 11 năm 2013 Học viên ðào Thanh Vân Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: PGS. TS. Nguyễn Viết Không, Phó viện trưởng Viện Thú y, trưởng bộ môn Siêu Vi trùng - Viện Thú y và PGS. TS. Nguyễn Bá Hiên - trưởng bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y – Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội, là những người thầy ñã tận tình hướng dẫn và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Lãnh ñạo và các cán bộ của Viện Thú y, các bạn ñồng nghiệp của bộ môn Siêu Vi trùng Viện Thú y ñã tạo ñiều kiện thuận lợi về thời gian và cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành ñề tài nghiên cứu của mình; các nghiên cứu sinh tại Viện Thú Y ñã chia sẻ thông tin và hợp tác nghiên cứu. Tập thể cán bộ thuộc bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, khoa Thú y – Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội, ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Ban Giám hiệu, Viện ðào tạo Sau ðại học, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y- Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội ñã tạo ñiều kiện cho tôi ñược theo học chương trình ñào tạo thạc sĩ tại trường. Gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã nhiệt tình giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong quá trình thực hiện, hoàn thành nội dung nghiên cứu và bản luận văn này. Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Học viên ðào Thanh Vân Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các bảng vii Danh mục các hình viii Danh mục các từ viết tắt ix MỞ ðẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm 3 1.1.1. Khái niệm bệnh cúm gia cầm 3 1.1.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3 1.1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới 4 1.2. ðặc ñiểm sinh học của vi rút cúm type A 5 1.2.1. ðặc ñiểm phân loại hình thái và cấu trúc 5 1.2.2. ðặc tính kháng nguyên của vi rút cúm type A 7 1.2.3. Các phương thức biến ñổi kháng nguyên 9 1.2.4. ðộc lực của vi rút 10 1.2.5. Nuôi cấy và lưu giữ vi rút cúm gà 12 1.3. Tiến hóa và hình thành genotype của vi rút cúm gia cầm 12 1.3.1. Sự tiến hóa của vi rút cúm A/H5N1 12 1.3.2. Tiến hóa của kiểu hình H5 15 1.3.3. Khả năng thích ứng ña vật chủ của vi rút cúm A/H5N1 17 1.4. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 17 1.5. Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm 19 1.5.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm 19 1.5.2. Bệnh tích 20 1.6. Tình hình dịch và nghiên cứu về cúm gia cầm ở Việt Nam 20 1.6.1. Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam 20 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 1.6.2. Tình hình nghiên cứu cúm gia cầm trong nước 24 Chương 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2.1. ðối tượng và nội dung 28 2.1.1. ðối tượng 28 2.1.2. Nội dung 28 2.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 28 2.3. Nguyên liệu 28 2.3.1. Tế bào, vi rút và sinh phẩm 29 2.3.2. Môi trường, sinh phẩm 29 2.3.3. Máy, thiết bị, vật liệu và dụng cụ 29 2.4. Phương pháp nghiên cứu 30 2.4.1. Phương pháp phân lập vi rút trên phôi trứng gà 30 2.4.2. Phương pháp tiếp ñời (hồi phục) vi rút chủng ñã phân lập 31 2.4.3. Xác ñịnh chỉ số EID 50 31 2.4.4. Xác ñịnh chỉ số TCID 50 31 2.4.5. Phương pháp Reed-Muench 34 2.4.6. Phương pháp gây bệnh cho ñộng vật thí nghiệm 34 2.4.7. Phương pháp HA, HI 35 2.4.8. Phương pháp xác ñịnh MDT 36 2.4.9. Phương pháp tính chỉ số IVPI 36 2.4.10. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide và cây phả hệ 37 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Giám ñịnh ñặc tính vi rút cúm gia cầm A/H5N1 phân lập ñược 39 3.1.1. Nguồn gốc của các chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 phân l ập ñược 39 3.1.2. ðặc tính di truyền (gene H5) của các chủng vi rút phân lập 40 3.1.3. ðặc tính nuôi cấy trên phôi trứng gà 42 3.2. ðộc lực của vi rút cúm gia cầm A/H5N1 44 3.2.1. Chỉ số EID 50 của các chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 44 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi 3.2.2. ðặc tính nhân lên trên tế bào MDCK c ủa các chủng vi rút phân lập 47 3.2.3. Kết quả xác ñịnh chỉ số IVPI của các chủng vi rút phân lập 48 3.2.4. Trình tự axit amin tại cleavage site của chủng phân lập 50 3.3. ðặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút clade 2.3.2.1B 51 3.4. ðộc lực của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 trên gà 54 3.4.1. Kết quả xác ñịnh LD 50 của chủng A/Duck/VNBN/06/12 54 3.4.2. Tính ổn ñịnh ELD 50 và LD 50 của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Tiếng Việt 61 Tiếng Anh 67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 : Sơ ñồ pha loãng vi rút 32 Bảng 2.2 : Sơ ñồ thực hiện chuẩn ñộ vi rút 33 Bảng 2.3 : Bảng tính EID 50 , ELD 50 /TCID 50 theo Reed-Meunch 34 Bảng 2.4 : Bảng tính chỉ số IVPI 37 Bảng 3.1 : Nguồn gốc của các chủng vi rút cúm gia cầm A/H5N1 39 Bảng 3.2 : Hiệu giá HA của nước trứng gây nhiễm vi rút cúm 43 Bảng 3.3 : Chỉ số EID 50 và MDT của vi rút cúm trên phôi trứng 44 Bảng 3.4 : Chỉ số TCID 50 của các chủng vi rút cúm trên tế bào MDCK 47 Bảng 3.5 : Chỉ số IVPI của 2 chủng vi rút phân lập 49 Bảng 3.6 : Trình tự Amino acid tại Cleavage site 50 Bảng 3.7 : Chỉ số HI miễn dịch chéo giữa các chủng vi rút phân lập 51 Bảng 3.8 : LD 50 của chủng vi rút A/Duck/VNBN/06/12 trên gà 54 Bảng 3.9 : ELD 50 của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 sau tiếp ñời 55 Bảng 3.10: LD 50 của chủng vi rút A/Duck/VNBN/06/12 sau tiếp ñời 57 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Mô phỏng cấu trúc của vi rút cúm 6 Hình 1.2. Mô phỏng cấu trúc kháng nguyên bề mặt vi rút (Stubb 1965) 8 Hình 1.3. Cây phả hệ dựa trên gene HA vi rút cúm A/H5N1 ñộc lực cao 14 Hình 1.4. Tiến hóa của các clade vi rút cúm A/H5N1 theo thời gian 16 Hình 1.5. Sự xuất hiện các clade H5N1 ở Việt Nam (Hui et al., 2008) 26 Hình 3.1. Phả hệ vi rút cúm gia cầm clade 2.3.2.1 41 Hình 3.2. Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của các vi rút phân lập 43 Hình 3.3.Tương quan (C) của chỉ số EID 50 (A) và MDT (B) của các chủng vi rút phân lập 45 Hình 3.4. Tương quan giữa chỉ số EID 50 và TCID 50 của vi rút cúm A 48 Hình 3.5. ELD 50 và MDT của vi rút sau tiếp ñời trên phôi trứng 56 Hình 3.6. LD 50 và MDT trên gà của vi rút sau tiếp ñời trên phôi trứng 57 Hình 3.7. Biến ñộng ELD 50 , LD 50 và MDT của vi rút sau tiếp ñời trên phôi trứng gà 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Tên ñầy ñủ AI Avian Influenza CEF Chicken Embryo Fibroblast CK Chicken DEF Duck Embryo Fibroblast Dk Duck EID 50 Embryo Infectious Dose 50% FAO Food and Agriculture Organisation HA Haemaglutinine HI Haemaglutination Inhibition HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza IVPI Intravenous Pathogenicity Index LD 50 Leathal Dose 50% LPAI Low Pathogenic Avian Influenza M Matrix protein MDCK Mardine Darby Canine Kidney MDEF Muscovy Duck Embryo Fibroblast MDT Mean Dead Time MEGA Molecular Evolution Genetic Analysis NA Neuraminidase NP Nucleoprotein NS Non-strutural protein OIE Office International des Epizooties PA Polymerase acid protein 1 PB1 Polymerase basic protein 1 PB2 Polymerase basic protein 2 RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction TCID 50 Tissue Culture Infectious Dose 50% WHO World Health Organisation [...]... dõi phân b v th i gian c a các clade vi rút cúm A/H5N1 cho th y: Clade 1 xu t hi n Vi t Nam t năm 2003 ñ n nay; clade 2.3.4 xu t hi n t năm 2007 ñ n năm 2010; clade 2.3.2 xu t hi n trong năm 2006 sau ñó không xu t hi n và tái xu t hi n trong năm 2010 cho ñ n nay S li u phân tích các m u vi rút t các d ch cúm gia c m và s li u giám sát vi rút cúm cho th y nhánh vi rút m i (clade 2.3.2) c a vi rút cúm A/H5N1. .. 2 hay nhi u vi rút cúm A ñ ng nhi m t o ra vi rút m i có ki u hình khác bi t mang tính t h p c a 2 hay nhi u vi rút H gene c a vi rút cúm A g m 8 phân ño n riêng bi t Khi ñ ng nhi m s n ph m có th bao g m thành ph n phân ño n có ngu n g c t c hai vi rút tái t h p (reassort) ho c trao ñ i (swap) Vi rút m i hình thành có ñ c tính c a hai vi rút b m ð c tính này d n ñ n vi rút hoàn toàn có tính kháng... i h c Nông nghi p Hà N i và Vi n Thú Y, t i th i ñi m tháng 6/2012, chúng tôi ti n hành ñ tài: Nghiên c u m t s ñ c tính sinh h c c a vi rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1B phân l p Vi t Nam • M c tiêu c a ñ tài Hi u bi t rõ hơn v các ñ c ñi m sinh h c c a vi rút cúm gia c m clade ph bi n nh t (clade 2.3.2.1B) ñang lưu hành ñ có th ñ xu t m t ch ng vi rút chu n s d ng trong nghiên c u ki m ñ nh hi u qu... t (WHO, 7/2012) Vi rút cúm A/H5N1 có ñ c tính bi n ch ng r t nhanh ð n nay ñã có nhi u bi n ch ng vi rút A/H5N1 ñã ñư c phát hi n và phân l p khác nhau t châu Á sang châu Âu ð c bi t nhi u nư c Vi t Nam, chúng ta cũng ñã phát hi n ñư c nhi u ch ng vi rút A/H5N1 khác nhau ñư c phân lo i vào các nhánh (clade) khác nhau như: clade 1, clade 3, clade 2.3.4, clade 2.3.2.1A, clade 2.3.2.1B, clade 7…(C c Thú... et al., 2011) Cho ñ n nay t t c 10 clade c a vi rút cúm gia c m ñ c l c cao A/ H5N1 ñã ñư c phát hi n và phân l p rút cúm gia c m ñã xu t hi n khu v c ðông Á Tính ñ n 2007, có 6 clade vi Vi t Nam (hình 1.5) Vi rút A/H5N1 gây nên d ch cúm gia c m Vi t Nam t cu i năm 2003 Tuy nhiên, qua ñi u tra, ngư i ta ñã t ng phát hi n th y vi rút A/H5N1 có m t ch gia c m s ng Vi t Nam t năm 2001 (Nguyen, Uyeki et... c a vi rút cúm gia c m ñã t ng h p quá trình này như cây ph h hình 1.4 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 15 Hình 1.4 Ti n hóa c a các clade vi rút cúm A/H5N1 theo th i gian Trong giai ño n 1996-2001, vi rút cúm gia c m ñ c l c cao A/H5N1 ch y u ch lưu hành phía Nam Trung Qu c Giai ño n này ghi nh n có 4 clade vi rút A/H5N1 khác nhau là clade 0, clade. .. clade 0, clade 3, clade 5 và clade 9, trong ñó clade 0 là vi rút thu t A/Goose/Guangdong/96 (H5N1) Sơ ñ bi n ñ i kháng nguyên HA c a vi rút cúm gia c m A/H5N1 ñ c l c cao (hình 1.3) qua các giai ño n khác nhau, cho th y th y s bi n ñ i liên t c c a vi rút cúm và ñ c bi t là có nh ng clade vi rút ti p t c phân hóa thành các nhánh ph như clade 2: Năm 2004 ch có 1 l p clade 2; ð n năm 2005 clade 2 ñã ti n... genotype c a vi rút cúm gia c m 1.3.1 S ti n hóa c a vi rút cúm A/H5N1 Năm 1996, vi rút cúm A/H5N1 ñư c phân l p l n ñ u tiên t ng ng Qu ng ðông (Trung Qu c) và ch ng này ñư c coi là ch ng nguyên th y t o nên các dòng vi rút gây b nh cúm gia c m trong 12 năm qua Ch ng vi rút nguyên Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 12 th y t h p v i các ch ng vi rút khác... Tình hình nghiên c u cúm gia c m trong nư c B nh cúm gia c m xu t hi n Vi t nam t cu i năm 2003 (Trương Văn Dung và Nguy n Vi t Không, 2004) T ñó ñ n nay ñã có nhi u nghiên c u v vi rút và b nh cúm gia c m Vi t Nam Nh ng nghiên c u này t p trung vào các hư ng chính bao g m: - Nh ng nghiên c u v căn b nh, d ch t , giám sát s lưu hành c a vi rút xây d ng ph h xác ñ nh ngu n g c phát sinh loài Nghiên c... 2011) Sáu clade lưu hành ñ n 2007 (Wallace et al., 2007), (Wan, Nguyen et al., 2008), (Lê Thanh Hòa và cs,, 2008), (Nguy n Th Bích Nga và cs, 2008), bao g m: Clade 3 (2001), clade 1 và 5 (2003); clade 0 và clade 2.3.2 (2005); clade 2.3.4 (2007) Vi rút cúm A/H5N1 thu c clade 7 ñư c phân l p biên gi i phía B c và m t s ch gia c m s ng phía B c Vi t Nam (Nguy n Tùng và cs, 2011) Vi rút A/H5N1 thu c clade . (clade) khác nhau như: clade 1, clade 3, clade 2. 3. 4, clade 2. 3 .2. 1A, clade 2. 3 .2. 1B, clade 7…(Cục Thú y, 20 13) . Qua theo dõi phân bố về thời gian của các clade vi rút cúm A/H5N1 cho thấy: Clade. hiện các clade H5N1 ở Vi t Nam (Hui et al., 20 08) 26 Hình 3. 1. Phả hệ vi rút cúm gia cầm clade 2. 3 .2. 1 41 Hình 3 .2. Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của các vi rút phân lập 43 Hình 3. 3.Tương. IVPI của các chủng vi rút phân lập 48 3 .2. 4. Trình tự axit amin tại cleavage site của chủng phân lập 50 3. 3. ðặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút clade 2. 3 .2. 1B 51 3. 4. ðộc lực của vi rút