BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðỖ TẤT ðẠT NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN NHƯỢC ðỘC DỊCH TẢ VỊT CHỦNG DP - EG - 2000 Chuyên ngành: Thú Y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI, 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn ðỗ Tất ðạt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CÁM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại lớp Cao học chuyên ngành Thú y trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ, giảng dạy nhiệt tình của các thầy giáo, cô giáo trong nhà trường. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tập thể các thầy giáo, cô giáo; ñặc biệt là các thầy, cô trong bộ môn Vi sinh vật-Truyền nhiễm Khoa Thú Y trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS. Nguyễn Bá Hiên, người ñã tận tình hướng dẫn, tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu này. Xin cảm ơn các bạn ñồng nghiệp và những người thân ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Rất mong nhận ñược sự ñóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn ñồng nghiệp ñối với ñề tài nghiên cứu của tôi. Xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận văn ðỗ Tất ðạt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Trang Lời cam ñoan i Lời cám ơn ii Mục lục iii Danh mục các bảng vi Danh mục ñồ thị và hình viii Danh mục chữ viết tắt ix MỞ ðẦU 1 1. Tính cấp thiết của ñề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Bệnh dịch tả vịt 3 1.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh 3 1.1.2. Virus gây bệnh dịch tả vịt 8 1.1.3. Truyền nhiễm học 13 1.1.4. Triệu chứng và bệnh tích 15 1.1.5. Chẩn ñoán 17 1.1.6. Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt 25 1.2. Miễn dịch chống virus dịch tả vịt 30 1.2.1. ðáp ứng miễn dịch không ñặc hiệu 30 1.2.2. ðáp ứng miễn dịch ñặc hiệu 31 1.2.3. ðộ dài miễn dịch 35 Chương 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1. Nội dung nghiên cứu 39 2.1.1. Kiểm tra các chỉ tiêu về giống vi sinh vật dùng ñể sản xuất vacxin 39 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 2.1.2. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy virus 39 2.1.3. Hoàn thiện quy trình kiểm nghiệm vacxin 39 2.1.4. Ứng dụng vacxin trong phòng bệnh và can thiệp dịch 39 2.2. Nguyên liệu 39 2.2.1. Giống virus 39 2.2.2. Phôi gà 39 2.2.3. ðộng vật thí nghiệm 40 2.2.4. Dụng cụ và hoá chất phòng thí nghiệm 40 2.3. Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1. Phương pháp xác ñịnh khả năng thích ứng và ổn ñịnh của chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 trên phôi gà 40 2.3.2. Phương pháp xác ñịnh chỉ số ELD 50 (liều gây chết 50% phôi) của chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 41 2.3.3. Phương pháp xác ñịnh chỉ số EID 50 (liều gây nhiễm 50% phôi) của chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 42 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất working seed 41 2.3.5. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng 43 2.3.6. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn 43 3.3.7. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực 43 2.3.8. Phương pháp xác ñịnh khả năng ñáp ứng miễn dịch của vịt sau khi tiêm vacxin nhược ñộc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000 44 2.3.9. Phương pháp kiểm tra ñộ dài bảo quản của vacxin nhược ñộc dịch tả vịt sau th ờ i gian l ư u kho 46 2.3.10. Ứ ng d ụ ng vacxin trong phòng b ệ nh và can thi ệ p d ị ch 46 2.3.11. Ph ươ ng pháp x ử lý s ố li ệ u 46 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 47 3.1. Kiểm tra một số ñặc tính sinh học của chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 47 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 3.1.1. Khả năng thích ứng và ổn ñịnh của chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 trên phôi gà 47 3.1.2. Kết quả xác ñịnh chỉ số ELD 50 của chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 53 3.1.3. Kết quả xác ñịnh chỉ số EID 50 của chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 55 3.2. Hoàn thiện quy trình nuôi cấy virus sản xuất vacxin 57 3.2.1 Kết quả nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin workingseed 57 3.2.2. Kiểm ñịnh và bảo quản giống 60 3.2.3. Chuẩn bị trứng 60 3.2.4. Cấy virus sản xuất vacxin 60 3.2.5. Thu hoạch, xử lý và bảo quản vacxin 61 3.2.6. Sử dụng vacxin 61 3.3. Hoàn thiện quy trình kiểm nghiệm vacxin 63 3.3.1. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin 63 3.3.2. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin 66 3.3.3. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin 68 3.3.4. Kết quả xác ñịnh khả năng ñáp ứng miễn dịch của vịt sau khi ñược tiêm phòng vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 74 3.3.5. Kết quả kiểm tra ñộ dài bảo quản của vacxin nhược ñộc dịch tả vịt sau th ờ i gian l ư u kho 79 3.4. K ế t qu ả ứ ng d ụ ng vacxin nh ượ c ñộ c d ị ch t ả v ị t DP-EG-2000 trong phòng b ệ nh và can thi ệ p d ị ch 88 3.4.1. K ế t qu ả ứ ng d ụ ng vacxin trong phòng b ệ nh 88 3.4.2. K ế t qu ả s ử d ụ ng vacxin nh ượ c ñộ c d ị ch t ả v ị t DP-EG-2000 trong can thi ệ p d ị ch t ạ i m ộ t s ố ñị a ph ươ ng 91 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 93 1. Kết luận 93 2. ðề nghị 94 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tình hình bệnh dịch tả vịt ở một số nước châu Á 7 Bảng 3.1. Kết quả cấy truyền chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 trên phôi gà 49 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể trên phôi sau khi gây nhiễm virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 52 Bảng 3.3. Kết quả xác ñịnh chỉ số ELD 50 của chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 54 Bảng 3.4. Kết quả xác ñịnh chỉ số EID 50 của chủng virus nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 56 Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra các ñặc tính tính sinh học của các ñời workingseed. 58 Bảng 3.6a. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 64 Bảng 3.6b. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm virus viêm gan vịt 66 Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 67 Bảng 3.8. Kết quả xác ñịnh chỉ tiêu hiệu lực của vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 73 Bảng 3.9. Kết quả ñánh giá ñộ dài miễn dịch của vịt sau khi tiêm vacxin 3, 6 , 9, 12 và 13 tháng 76 B ả ng 3.10. K ế t qu ả ki ể m tra hi ệ u l ự c c ủ a vacxin nh ượ c ñộ c d ị ch t ả v ị t d ạ ng t ươ i sau th ờ i gian b ả o qu ả n 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng và 18 tháng b ằ ng ph ươ ng pháp công c ườ ng ñộ c 81 B ả ng 3.11. K ế t qu ả ki ể m tra hi ệ u l ự c c ủ a vacxin nh ượ c ñộ c d ị ch t ả v ị t d ạ ng t ươ i sau th ờ i gian B ả ng 3.12. K ế t qu ả s ử d ụ ng vacxin nh ượ c ñộ c d ị ch t ả v ị t DP-EG-2000 vào phòng b ệ nh cho v ị t ở m ộ t s ố ñị a ph ươ ng 90 B ả ng 3.13. K ế t qu ả s ử d ụ ng vacxin nh ượ c ñộ c d ị ch t ả v ị t DP-EG-2000 trong can thi ệ p d ị ch t ạ i m ộ t s ố ñị a ph ươ ng 92 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC ðỒ THỊ VÀ HÌNH Trang ðồ thị 3.1. ðường biểu diễn ñộ dài miễn dịch của vịt sau khi tiêm vacxin 79 ðồ thị 3.2. ðường biểu diễn hiệu lực vacxin sau thời gian lưu kho 87 Hình 1.1. Bản ñồ phân bố bệnh dịch tả vịt trên TG (2011) 5 Hình 1.2. Cấu trúc virusHerpesviridae 8 Hình 1.3. Sơ ñồ chẩn ñoán bệnh dịch tả vịt 19 Hình 3.1. Phôi gà xuất huyết, còi cọc. 52 Hình 3.2: Sơ ñồ tóm tắt quy trình sản xuất vacxin nhược ñộc dịch tả vịt chủng DP-EG-2000…………………………………………………58 Hình 3.3. Vịt liệt chân, phù ñầu 69 Hình 3.4. Gan sưng, xuất huyết. 70 Hình 3.5. Ruột xuất huyết hình nhẫn 70 Hình 3.6. Dạ dày tuyến, dạ dày cơ xuất huyết vệt 71 Hình 3.7. Tim sưng, xuất huyết mỡ vành tim 71 Hình 3.8: Thực quản và diều xuất huyết, loét và loại tử 72 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Diễn giải CPE : Cytopathic pathogene effect Cs : cộng sự DEF : Duck Embryo Fibroblast DEV : Duck enteritis virus DNA : Dezoxy ribonucleic acid DVE : Duck virus enteritis EID 50 : 50 percent Embryo Infective Dose ELD 50 : 50 percent Embryo Lethal Dose LD 50 : 50 percent Lethal Dose NI : Neutralization Index OIE : Office International des Epizooties p : page PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase chain reaction SN : Serum Neutralization Tr : trang VN : Virus Neutralization VSV-TN : Vi sinh vật - Truyền nhiễm [...]... số năm qua và trong nhiều năm tiếp theo Giá trị xuất khẩu thủy sản các năm qua đã đóng góp một phần không nhỏ vào tổng kim ngạch xuất khẩu cả nớc Từ năm 1995 đến 1999, năm nào kim ngạch xuất khẩu thủy sản cũng chiếm tỷ trọng trên dới 10% so với tổng giá trị xuất khẩu, đặc biệt năm 1995, tỷ trọng này là 10,1% Xuất khẩu thủy sản chủ yếu là tôm và một số lợng lớn mực nang và mực đông Năm 1998, tổng sản. .. Nguồn: - Bộ Thủy sản -Số liệu thống kê nông, lâm nghiệp và thủy sản thời kỳ 19901998 và dự báo năm 2000 Qua bảng số liệu trên đây ta thấy rằng: kim ngạch xuất khẩu thủy sản nớc ta đã tăng rất đáng kể qua các năm, trung bình mỗi năm tăng gần 100 triệu USD Từ năm 1995 đến 1999, giá trị xuất khẩu thủy sản tăng 420,52 triệu USD, hay tăng 76,37%, đóng vai trò là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực... một số lợng lớn mực nang và mực đông Năm 1998, tổng sản lợng thủy sản xuất khẩu đạt 193.000 tấn (tăng 25% so với năm 1995), kim ngạch xuất khẩu đạt 858,68 triệu USD Dự kiến xuất khẩu thủy sản của Việt Nam sẽ tăng từ 971,12 triệu USD năm 1999 lên 1,1 tỷ USD năm 2000, 2tỷ USD năm 2005 và 2- 2,2 tỷ USD vào năm 2010 2.3 Vai trò của ngành thủy sản trong việc tạo công ăn việc làm ỏn: Nhng gii phỏp y mnh xut... 8.712 tấn Về sản phẩm mực đông, năm 1998 tăng so năm 1997 là 35,64 tấn hay tăng 2,16%, nhng về giá trị kim ngạch xuất khẩu chỉ bằng 80% so với năm 1997 hay chỉ đạt 4.067.693 USD Điều này là do công nghệ chế biến mực hiện nay của ta đã có nhiều cải tiến, song việc tạo ra những sản phẩm có giá trị cao vẫn còn hạn chế, chủ yếu là xuất nguyên liệu Về sản phẩm cá đông lạnh, năm 1998 sản lợng xuất khẩu là... Các sản phẩm thủy sản khác nh: mực khô, bạch tuộc, cá hộp, cá hun khói năm 1998 giảm 629,64 tấn so với năm 1997 là bởi vì các sản phẩm này có giá trị không cao, ít doanh nghiệp Việt Nam tham gia kinh doanh Các doanh nghiệp chỉ tập vào các sản phẩm có giá trị cao nh tôm đông, cá đông nên đã tác động rất lớn đến tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu thủy sản sang EU năm 1998 Năm 1999, giá trị kim ngạch xuất. .. thực phẩm Chỉ thị 91/493/EEC ban hành tháng 6 năm 1993 quy định các doanh nghiệp tại nớc xuất khẩu phải có điều kiện sản xuất tơng đơng nh các doanh nghiệp của nớc nhập khẩu và phải đợc cơ quan kiểm tra chất lợng của EU công nhận Đối với hàng thực phẩm đóng gói phải ghi rõ tên sản phẩm, thành phần, trọng lợng, thời gian và cách sử dụng sản phẩm, nơi sản xuất, các điều kiện để bảo quản và sử dụng, mã... hoạt động hỗ trợ thủy sản ớc tính lên tới 8 triệu ngời Ngoài ra, đánh bắt và nuôi trồng thủy sản còn đảm bảo việc làm không thờng xuyên và thu nhập phụ cho hơn 20 triệu ngời Theo dự tính, số lao động trong ngành thủy sản năm 2000 sẽ là 3,4 triệu ngời (trong đó: khai thác hải sản khoảng 420.000 ngời, nuôi trồng thủy sản khoảng 559.364 ngời, chế biến thủy sản: 58.768 ngời, lao động dịch vụ nghề cá khoảng... 8,1 triệu ngời vào năm 2000 và 10 triệu ngời vào năm 2010 Hơn nữa, thu nhập trực tiếp của những ngời lao động thờng xuyên trong nghề cá và nuôi trồng thủy sản dự tính sẽ tăng trung bình 16% /năm trong thời gian nêu trên Trên 1,2 triệu ngời trong các hộ gia đình phụ thuộc vào nghề cá và nuôi trồng thủy sản sẽ có thêm thu nhập vào năm 2000 Điều đó có nghĩa là số dân đợc ngành thủy sản hỗ trợ sẽ tăng 3... 1998 Năm 1999, giá trị kim ngạch xuất khẩu thủy sản sang EU của Việt Nam giảm 2,65% hay giảm 2.424.317 USD so với năm 1998 Điều này là do các sản phẩm thủy sản nớc ta xuất đi EU phần lớn là thông qua các công ty của ASEAN Đây là vấn đề bức xúc đối với ngành thủy sản nớc ta trong việc giao dịch xuất khẩu, phải làm sao hạn chế các trung gian, tăng cờng xuất khẩu trực tiếp với các nớc EU III NH HNG CA... Nguồn: Bộ Thủy sản Qua bảng số liệu trên đây, ta thấy rằng khối lợng sản phẩm thủy sản xuất khẩu sang EU năm 1998 so với năm 1997 có tăng nhng tăng không đáng kể, chỉ tăng 452 tấn hay tăng 1,96%, trong khi giá trị kim ngạch xuất khẩu tăng 21,8% ỏn: Nhng gii phỏp y mnh xut khu mt hng thy sn ca Vit Nam sang th trng EU trong nhng nm ti (tăng 16.367.967 USD) Điều đó là do cơ cấu từng loại sản phẩm đã gia . số EID 50 của chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000 55 3.2. Hoàn thiện quy trình nuôi cấy virus sản xuất vacxin 57 3.2.1 Kết quả nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin workingseed. chủng virus vacxin nhược ñộc dịch tả vịt DP-EG-2000. - Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin. - ðánh giá khả năng bảo hộ của vacxin. - Bước ñầu ứng dụng vacxin vào thực tế sản xuất. . (VSV-TN). Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: " ;Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin nhược ñộc dịch tả vịt chủng DP - EG - 2000". 2. Mục tiêu nghiên cứu - Kiểm tra sự ổn ñịnh