BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** HOÀNG VĂN KHOẢN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VĂC XIN BẤT HOẠT TỤ HUYẾT TRÙNG GIA CẦM NHŨ DẦU QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1 PGS.TS. NGUYỄN VIẾT KHÔNG 2 TS. NGUYỄN BÁ TIẾP HÀ NỘI, 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan: Các kết quả nghiên cứu thể hiện trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc. Hà nội, ngày …. tháng 10 năm 2013 Tác giả luận văn Hoàng Văn Khoản Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành ñề tài nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Viết Không - Phó viện trưởng, Viện Thú y Quốc gia TS. Nguyễn Bá Tiếp - Trưởng Bộ môn Giải phẫu - Tổ chức, Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðã luôn tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài cũng như trong quá trình hoàn thiện luận văn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: - Các thầy cô và cán bộ giảng dạy của Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giảng dạy, truyền ñạt ñầy ñủ kiến thức chuyên môn cần thiết cho chúng tôi trong quá trình học tập tại trường. - Ban lãnh ñạo và toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng và Chuyển giao công nghệ thú y - Viện Thú y Quốc gia ñã tạo ñiều kiện tốt nhất giúp tôi triển khai và thực hiện ñề tài tại Trung tâm. - Gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ tôi về tinh thần, vật chất và chuyên môn trong quá trình học tập và thực hiện ñề tài tốt nghiệp. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày …. tháng 10 năm 2013 Hoàng Văn Khoản Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii Danh mục các từ viết tắt viii MỞ ðẦU 1 1. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 3 1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh Tụ huyết trùng 3 1.2. Tình hình nghiên cứu văc xin phòng bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam 5 1.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida 6 1.3.1. ðặc tính sinh học 6 1.3.2. ðặc tính nuôi cấy của Pasteurella multocida 7 1.3.3. ðặc tính sinh hóa của Pasteurella multocida 8 1.3.4. Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida 10 1.3.5. ðộc tố của vi khuẩn Pasteurella multocida 11 1.3.6. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 11 1.4. Bệnh tụ huyết trùng gia cầm 15 1.4.1. Dịch tễ học 15 1.4.2. ðặc tính gây bệnh và ñộc lực 15 1.4.3. ðường xâm nhập và phương thức truyền bệnh 15 1.4.4. Lứa tuổi mắc và tỷ lệ tử vong 16 1.4.5. ðộng vật cảm thụ 16 1.4.6. Nguồn bệnh và phương thức lây truyền bệnh 16 1.4.7. Các loại kháng nguyên P.multocida 17 1.4.8. ðáp ứng miễn dịch trong bệnh Tụ huyết trùng gia cầm 19 1.5. Văc xin phòng bệnh Tụ huyết trùng gia cầm 21 1.5.1. Quá trình phát triển văc xin phòng Tụ huyết trùng 21 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 1.5.2. Chất bổ trợ văc xin 22 1.5.3. Ứng dụng công nghệ tiên tiến trong sản xuất văc xin 23 1.5.4. Các loại văc xin Tụ huyết trùng gia cầm 24 2. CHƯƠNG II. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1. ðối tượng và nội dung 27 2.1.1. ðối tượng 27 2.1.2. Nội dung 27 2.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 27 2.3. Nguyên liệu 27 2.3.1. Vi sinh vật, sinh phẩm 27 2.3.2. Môi trường 28 2.3.3. Hóa chất 28 2.3.4. Máy, thiết bị, vật liệu và dụng cụ 28 2.4. Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1. Phương pháp kiểm ñịnh giống P.multocida N41 29 2.4.2. Phương pháp xác ñịnh ñậm ñộ vi khuẩn 29 2.4.3. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hóa lý của văc xin 30 2.4.4. Phương pháp xác ñịnh chỉ tiêu an toàn văc xin 30 2.4.5. Phương pháp xác ñịnh chỉ tiêu hiệu lực của văc xin 31 2.4.6. Phương pháp xác ñịnh ñáp ứng miễn dịch và ñộ dài miễn dịch 31 2.4.7. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 34 3. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1. Kết quả kiểm ñịnh giống sản xuất P.multocida N41 35 3.2. Giải pháp kỹ thuật tối ưu hóa hiệu quả lên men sinh khối 37 3.2.1. Ảnh hưởng của chất lượng môi trường ñến ñậm ñộ vi khuẩn 37 3.2.2. Xác ñịnh hàm lượng oxy hòa tan (DO) tối ưu 41 3.3. Kết quả thử nghiệm, lựa chọn chất bổ trợ phù hợp 43 3.4. Sản xuất thử nghiệm văc xin tụ huyết trùng gia cầm nhũ dầu 47 3.5. ðặc tính sinh miễn dịch của kháng nguyên trong văc xin nhũ dầu 50 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 3.5.1. Mức ñộ ñáp ứng miễn dịch theo thời gian 50 3.5.2. Kết quả giám sát ñộ dài miễn dịch 53 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 5.1. Tài liệu tiếng Việt 57 5.2. Tài liệu tiếng Anh 59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.01 Một số ñặc tính sinh hóa thông thường của P.multocida 9 Bảng 1.02 Hệ thống phân loại Pasteurella multocida 13 Bảng 1.03 Mối liên hệ giữa hai hệ thống ñịnh type P.multocida 14 Bảng 2.01 Thành phần phản ứng IHA 33 Bảng 3.01 Kết quả kiểm ñịnh một số chỉ tiêu giống sản xuất 35 Bảng 3.02 Thành phần môi trường thử nghiệm 38 Bảng 3.03 Ảnh hưởng của môi trường ñến ñậm ñộ vi khuẩn 39 Bảng 3.04 Ảnh hưởng của hàm lượng DO ñến ñậm ñộ vi khuẩn 42 Bảng 3.05 Kết quả ñánh giá chất lượng nhũ dầu thử nghiệm 44 Bảng 3.06 Ảnh hưởng của chất bổ trợ ñến chỉ tiêu an toàn và hiệu lực của văc xin 45 Bảng 3.07 Kết quả theo dõi biểu hiện lâm sàng của gà sau khi ñược tiêm văc xin nhũ dầu THT 46 Bảng 3.08 Kết quả kiểm nghiệm văc xin (bổ trợ Montanide ISA 70M VG) 48 Bảng 3.09 Kết quả kiểm nghiệm văc xin (bổ trợ Montanide ISA 760 VG) 49 Bảng 3.10 Chỉ số miễn dịch của gà ñối với văc xin 51 Bảng 3.11 ðộ dài miễn dịch của văc xin Tụ huyết trùng nhũ dầu 54 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.01 Sơ ñồ pha loãng canh khuẩn 30 Hình 2.02 Mô hình phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp 31 Hình 3.01 Biểu ñồ biến ñộng năng suất sinh khối (log CFU/ml) theo thành phần và nguồn gốc môi trường 40 Hình 3.02 Biến ñộng ñậm ñộ vi khuẩn tại các mức DO theo thời gian 42 Hình 3.03 Biểu ñồ biến ñộng chỉ số miễn dịch nhóm ở các lô gà tiêm văc xin 53 Hình 3.04 Biểu ñồ biến ñộng tỷ lệ bảo hộ theo thời gian 55 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Tên ñầy ñủ AGPT Agar Gel Precipitation Test BHI Brain Heart Infustion (Brorth) BSA Bovine Serum Albumine DNA Deoxyribonucleic Acid DNT Dermo Necroti Toxin DO Disolve Oxygen ðC ðối chứng ELISA Enzyme – linked Immunosorbant assay HC Hồng cầu HT Huyết thanh IHA Indirect Haemagglutination Assay KHT Kháng huyết thanh KN Kháng nguyên LD 50 50 percent Lethal Dose LPS Lipo-Polysaccharide MR Methyl red NK Ngưng kết OMPs Outer Membrance Proteins P.multocida Pasteurella multocida PBS Phosphate Buffered Saline THT Tụ huyết trùng VP Voge – Praskauer Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết của ñề tài Là một trong hai lĩnh vực trọng yếu của sản xuất nông nghiệp. Hiệu quả kinh tế do ngành chăn nuôi mang lại ñã góp phần quan trọng hiện thực hóa chính sách “xóa ñói, giảm nghèo bền vững” do Chính phủ ñề ra, giải quyết công ăn việc làm cho người dân tại các vùng nông thôn, ñảm bảo cung cấp ñủ thực phẩm cho nhu cầu xã hội và tiến tới xuất khẩu. Tuy nhiên, mặt trái của sự phát triển ñó là tình trạng ô nhiễm môi trường, dịch bệnh bùng phát rất khó kiểm soát và thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm do lạm dụng thuốc kháng sinh, hóa dược trong chăn nuôi và công tác phòng chống dịch bệnh ñang từng ngày ñe dọa sức khỏe người dân. Trong những năm gần ñây, thế giới lên tiếng cảnh báo về tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh và hóa dược trị liệu trong công tác khống chế và kiểm soát dịch bệnh trong chăn nuôi. Việc lạm dụng thuốc kháng sinh khá phổ biến trong chăn nuôi tiềm ẩn nhiều nguy cơ như: Tồn dư thuốc kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi, ảnh hưởng ñến sức khỏe người sử dụng, bên cạnh ñó là nguy cơ kháng thuốc kháng sinh ở vi khuẩn, gây khó khăn cho công tác phòng chống dịch bệnh trên người và ñộng vật. Chính vì vậy, sử dụng các chế phẩm sinh học ñể phòng chống dịch bệnh trong chăn nuôi là hướng ñi tất yếu ñể ñảm bảo có một ngành chăn nuôi an toàn và bền vững. Bệnh tụ huyết trùng gia cầm là bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn tụ huyết trùng (Pasteurella multocida) gây ra ở tất cả các loài gia cầm: Gà, vịt, ngan, ngỗng và ở các lứa tuổi ñều có thể mắc bệnh. Tỷ lệ chết có thể lên tới 80-90% nếu không can thiệp thuốc kháng sinh kịp thời. Tổn thất kinh tế do bệnh tụ huyết trùng gây ra hàng năm ñối với ngành chăn nuôi gia cầm là không nhỏ. Cụ thể, theo thống kê của Chi cục thú y các tỉnh cho thấy; năm 2004 chỉ trong tháng 1 ñã ghi nhận số gia cầm chết do tụ huyết trùng tại tỉnh Long An khoảng 100.000 con, tỉnh Tiền giang khoảng 40.000 con (http://vietbao.vn/Xa-hoi/Ga-chet-hang-loat-Co-trieu-chung-cua-benh-tu-huyet- trung/40014931/157/) Thống kê hằng năm của các trang trại chăn nuôi gia cầm tập chung cũng cho thấy: Tỷ lệ gia cầm chết do tụ huyết trùng là không nhỏ, thiệt hại ñáng kể nhất trên ñàn gia cầm [...]... chúng tôi ti n hành ñ tài nghiên c u: Nghiên c u quy trình s n xu t văc xin b t ho t T huy t trùng gia c m nhũ d u quy mô phòng thí nghi m” 2 M c ñích nghiên c u và ý nghĩa c a ñ tài - L a ch n ch t b tr nhũ d u cho quy trình s n xu t v c xin t huy t trùng s d ng gi ng g c P multocida N41 - Hoàn thi n quy trình công ngh s n xu t v c xin THT gia c m d ng nhũ d u - Xác ñ nh ñư c hi u qu s d ng v c xin... trang thi t b hi n ñ i, ti p nh n chuy n giao quy trình công ngh tiên ti n và t ng bư c làm ch quy trình công ngh Trong ñó, văc xin vi trùng ñư c s n xu t b ng công ngh lên men s c khí v i thi t b nh p kh u hi n ñ i, quy trình khép kín Văc xin virus b t ñ u ñư c quan tâm nghiên c u và s n xu t trên môi trư ng t bào nuôi c y nhân t o cho hi u qu cao hơn Vi c quan tâm nghiên c u c i thi n ch t lư ng văc... ng ,1993 ñã nghiên c u ch t o văc xin T huy t trùng gia c m t ch ng N41, xác nh n môi trư ng t y t tiêu Hottinger là môi trư ng phù h p ñ nuôi c y vi khu n T huy t trùng cho ñ m ñ cao, sau 8 gi nuôi c y s lư ng vi khu n ñ t 26,5 t /ml T ñó, khi ch t o văc xin có th gi m li u tiêm t 2-3ml/con xu ng còn 0,5ml/con, r t thích h p cho vi c tiêm phòng t huy t trùng gia c m ñ i trà * Lê L p, 1996 nghiên c u... sau 6 tháng, so sánh v i văc xin keo phèn 2.2 ð a ñi m và th i gian nghiên c u ð a ñi m: Phòng Nghiên c u và s n xu t văc xin vi trùng, Trung tâm Nghiên c u ng d ng và Chuy n giao Công ngh Thú y, Vi n Thú y Th i gian: T 1/7/2012 ñ n 30/6/2013 2.3 Nguyên li u 2.3.1 Vi sinh v t, sinh ph m - Gi ng T huy t trùng gia c m P.multocida ch ng N41 (Do Phòng qu n lý gi ng vi Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu... năng ch ng b nh kém Nh ng nghiên c u c a Trusscott và c ng s , 1990; Ramdani và Adler, 1991 ñ u nh n th y P.multocida có th t n t i s ng trong các t bào ñ i th c bào c a gia c m, s ñ kháng c a P.multocida có ñư c là nh các protein ñ c t màng ngoài c a vi khu n 1.5 Văc xin phòng b nh T huy t trùng gia c m 1.5.1 Quá trình phát tri n văc xin phòng T huy t trùng B nh t huy t trùng gia c m thư ng x y ra th... s d ng phòng t huy t trùng gia c m v i hi u l c và kh năng b o h cao 3 Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a ñ tài Làm cơ s xây d ng quy trình công ngh t i ưu trong s n xu t v c xin T huy t trùng gia c m d ng nhũ d u có ch t lư ng t t, hi u qu phòng b nh cao, h giá thành s n ph m Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 2 1 CHƯƠNG I T NG QUAN 1.1 L ch s nghiên. .. Thanh Phư ng và c ng s nghiên c u văc xin nhũ hóa t huy t trùng trâu bò trong s n xu t K t qu , s n xu t kháng nguyên trong bình lên men s c khí, t o nhũ trong máy gây nhũ, b o qu n văc xin trong ñi u ki n nhi t ñ 4-100C, hi u l c văc xin ñ t 100% trong 12 tháng (công trình nghiên c u KHKT thú y 1990-1991) Văc xin phòng bênh t huy t trùng cho gia súc gia c m có 3 lo i: Văc xin vô ho t không có ch t b tr... cho ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gia c m nói riêng Chính vì v y, công tác nghiên c u, ch t o văc xin phòng b nh ñã thu hút s quan tâm c a r t nhi u nhà khoa h c trong nư c Nh ng công trình nghiên c u khoa h c ñó ñã góp ph n r t quan tr ng giúp ngành thú y nư c ta làm ch và phát tri n công ngh s n xu t văc xin phòng b nh T huy t trùng cho gia súc, gia c m * Năm 1991, Phan Thanh Phư ng ñã phân... s nghiên c u ch t o văc xin nhũ hóa T huy t trùng trâu bò có hi u l c mi n d ch cao nh m thay th văc xin keo phèn có hi u l c mi n d ch th p (K t qu nghiên c u khoa h c k thu t thú y 1979-1984) Nguy n Ngã, Lê Minh Tâm và Nguy n Bá Cư ng nghiên c u s n xu t văc xin t huy t trùng trâu bò ch ng Iran (K t qu nghiên c u khoa h c k thu t thú y 1985-1989) Phan Thanh Phư ng và c ng s nghiên c u văc xin nhũ. .. trong môi trư ng có thêm s t (Choi, 1991) Nh ng protein này ñóng vai trò quan tr ng trong quá trình mi n d ch phòng v chéo gi a các serotype P.multocida Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 21 gây b nh T huy t trùng cho gia súc gia c m (Kennett, 1993; Glisson, 1993) Nh ng k t qu nghiên c u trên ñã ñư c Carmel và c ng s (1996) v n d ng ñ nghiên c u văc xin phòng . xin bất hoạt Tụ huyết trùng gia cầm nhũ dầu quy mô phòng thí nghiệm . 2. Mục ñích nghiên cứu và ý nghĩa của ñề tài - Lựa chọn chất bổ trợ nhũ dầu cho quy trình sản xuất vắc xin tụ huyết trùng. HÀ NỘI *** HOÀNG VĂN KHOẢN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VĂC XIN BẤT HOẠT TỤ HUYẾT TRÙNG GIA CẦM NHŨ DẦU QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà SỐ : . tác phòng và ñiều trị bệnh tụ huyết trùng gây ra trên gia cầm, ñặc biệt là gia cầm sinh sản. Xuất phát từ nhận ñịnh trên chúng tôi tiến hành ñề tài nghiên cứu: Nghiên cứu quy trình sản xuất