1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sắn là cây trồng dễ tính, dễ trồng thích hợp với nhiều chất đất và địa hình (tận dụng tốt các loại đất nghèo dinh dưỡng và khô hạn), chống được động vật ăn cỏ do có cyanogen (HCN). Hơn nữa, củ sắn có thể tồn tại trong đất qua nhiều năm mới thu hoạch nên có thể coi là nguồn lương thực dự trữ. Nông dân trồng sắn hầu như không phải đầu tư nhiều, hợp khả năng kinh tế với nhiều hộ gia đình nông dân nghèo, thiếu lao động, tận dụng đất để lấy ngắn nuôi dài, có khả năng sử dụng tốt các đất đã cạn kiệt, cho năng suất cao và ổn định nên được nó được xem như cây “xóa đói giảm nghèo” cho nông dân. Sắn rất quan trọng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi gia súc sau lúa và ngô, chế biến lương thực, nhiên liệu sinh học và xuất khẩu [9]. Hiện nay, tinh bột chế biến từ sắn, thậm chí sắn lát phơi khô, trở thành mặt hàng mới trong xuất khẩu, đặc biệt sau khi hàng loạt các nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học trong và ngoài nước được thành lập. Lần đầu tiên sau hàng chục năm, Bộ Công Thương đã đưa sắn và các sản phẩm chế biến từ sắn vào danh mục các mặt hàng xuất khẩu chủ lực [1]. Tuy nhiên, cây sắn cũng có một số hạn chế như trồng sắn làm kiệt đất, củ sắn nghèo đạm và vitamin, có độc tố HCN trong sắn củ tươi, chế biến sắn gây ô nhiễm môi trường. Một trong những giải pháp phát triển sắn bền vững là áp dụng giống mới và kỹ thuật canh tác sắn bền vững để đạt năng suất lợi nhuận cao và duy trì độ phì nhiêu của đất mà không mở rộng diện tích trồng sắn. Mặc dù cây sắn dễ nhân giống vô tính bằng cành giâm nhưng rất khó khăn trong nhân giống hữu tính. Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen nhằm tạo ra giống sắn có năng suất cao, có hàm lượng tinh bột cao nhằm đáp giải quyết các vấn đề thực tiễn cũng như khoa học là hết sức cần thiết, đặc biệt trong sản xuất nhiên liệu sinh học, hàm lượng tinh 2 bột được đánh giá cao hơn năng suất. KM 94 là một trong những giống sắn chủ lực ở Việt Nam do năng suất và hàm lượng tinh bột ổn định và cao hơn các giống mới, được lựa chọn làm đối tượng chuyển gen [16]. Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật nên là đối tượng được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là dùng làm đối tượng chuyển gen. Gen ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) qui định tổng hợp nên enzyme AGPase có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp tinh bột cây trồng. Những lý do trên đây là cơ sở để chúng tôi xây dựng đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) vào giống sắn KM 94 và cây thuốc lá K326”. 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định sự có mặt của gen ADP Glucose pyrophosphorylase ở cây thuốc lá K326. - Xác định khả năng sống sót của mẫu sắn KM 94 chuyển gen trên môi trường chọn lọc. 3. Nội dung của đề tài - Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm tái sinh cây: Nhân nhanh cây sắn KM 94 và cây thuốc lá K326. - Tiến hành quá trình biến nạp vi khuẩn A. tumefaciens mang gen đích. - Kiểm tra, xác định hiệu quả chuyển gen ở cây thuốc lá K326. - Xác định khả năng sống sót của sắn KM 94 chuyển gen trên môi trường chọn lọc. 4. Đối tƣợng và thời gian nghiên cứu 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu Khả năng mang gen AGPase của cây thuốc lá K326 và cây sắn KM 94 chuyển gen. 3 4.2. Thời gian nghiên cứu - Tháng 09/ 2013: Sưu tầm, nghiên cứu tài liệu liên quan đến đề tài. - Tháng 10/2013: Xây dựng đề cương đề tài. - Tháng 11/2013 đến tháng 01/2014: Chuẩn bị nguyên liệu chuyển gen, thực hiện quá trình biến nạp và tái sinh cây chuyển gen. - Tháng 02/2014 đến tháng 03/2014: Kiểm tra, xác định hiệu quả chuyển gen. - Tháng 04/2014 đến tháng 05/2014: Viết hoàn thiện đề tài và nghiệm thu. 5. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu 5.1. Địa điểm nghiên cứu Phòng thực hành Thực vật-Di truyền-Phương pháp-Vi sinh, Khoa Sinh Hóa – Trường Đại Học Tây Bắc. 5.2. Phạm vi nghiên cứu Đánh giá sự có mặt của gen ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) ở cây thuốc lá K326 và khả năng sống của mẫu sắn KM 94 chuyển gen. 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về cây thuốc lá K326 Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotinana tabacum , thuộc ngành hạt kín Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Asteridae, bộ hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà, chi Nicotiana. Trong chi Nicotiana có 50 - 70 loài, đa số là dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là các dạng dại phụ [6]. Là loài bản địa của vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới châu Mỹ, nhưng hiện đã được trồng khắp thế giới. Hình 1. Thuốc lá (Nicotinana tabacum) Trên thế giới cây thuốc lá được trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích canh tác khoảng 2.500.000ha, Châu Mĩ là 1.600.000ha và Châu Phi khoảng 326.000ha với nhiều loại thuốc lá khác nhau trong đó giống thuốc lá sợi vàng phổ biến nhất.Vùng trồng thuốc lá cho chất lượng cao tập trung chủ yếu ở một số bang của nước Mĩ, Cu Ba, Ấn Độ. Tại Việt Nam cây thuốc lá được canh tác từ Bắc chí Nam, 5 chủ yếu ở các tỉnh Cao Bằng và Lạng Sơn (khu vực phía Bắc), Gia Lai và Đăk Lăk (khu vực miền Tây nguyên), Đà Nẵng, Ninh Thuận (khu vực miền Trung) và Tây Ninh (khu vực phía Nam) [13]. Là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế đối với người nông dân vừa được các nhà sinh học rất quan tâm trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ tế bào thực vật. Có rất nhiều công trình trong và ngoài nước nghiên cứu chuyển gen vào cây thuốc lá đã thành công. Cây thuốc lá có nhiều ưu điểm như: Dễ tái sinh, thời gian sinh trưởng ngắn (60 -70 ngày ở vụ đông xuân, 50 - 60 ngày ở vụ hè thu), hệ số nhân cao, dễ chăm sóc . . Đó cũng chính là lí do giải thích vì sao cây thuốc lá đã được các nhà khoa học sử dụng làm mô hình trong nhiều nghiên cứu biến nạp gen. 1.2. Sơ lƣợc về cây sắn 1.2.1. Nguồn gốc và phân loại 1.2.1.1. Nguồn gốc Lịch sử tiến hóa của cây sắn cũng như các cây có củ khác là rất khó xác định được chính xác nguồn gốc phát sinh. Bởi vì những di chỉ khảo cổ còn lại đối với các bộ phận của cấy có bột rất hiếm hoi. Qua rất nhiều tranh cãi thì gần đây nhiều tác giả kết luận rằng : Cây sắn có nguồn gốc phức tạp và có 4 trung tâm phát sinh là ở Braxin có 2 trung tâm và còn lại là ở Mêhicô và Bolivia. Sắn được trồng cách đây khoảng 3000 – 7000 năm [8]. 1.2.1.2. Phân loại Sắn hay khoai mì có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz. Thuộc ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, họ Euphorbiaceae, chi Manihot, loài M.esculenta. Sắn có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 36 là loại cây mang lại giá trị kinh tế cũng như gái trị dinh dưỡng cao. 6 Sắn gồm 2 loại: Sắn đắng và sắn ngọt. Sắn đắng: là sắn có hàm lượng acid hydrocyanic lớn hơn 50mg/kg sắn tươi. Sắn ngọt: là sắn có hàm lượng acid hydrocyanic ít hơn 50mg/kg sắn tươi [9]. 1.2.1.3. Tính đa dạng và phân bố Trong chi Manihot có 19 giống và trên 100 loài, trong đó có một số giống sắn phổ biến ở Việt Nam như: KM 94, KM 140, KM 98-5, KM 98-1, SM 937-26, KM 419, KM 325 Trong đề tài này chỉ nghiên cứu giống sắn: KM 94 Hình 2. Cây sắn KM 94 *Đặc điểm giống sắn KM 94 KM 94 có tên gốc là KU50 được nhập nội từ CIAT/Thái Lan trong bộ giống khảo nghiệm Liên Á năm 1990. KM 94 là con lai của tổ hợp lai Rayong1 × Rayong 90. Thuộc nhóm sắn đắng, thân xanh, hơi cong ở phần gốc, không phân nhánh ở đồng bằng nhưng lại phân nhánh cấp một ở những tỉnh miền núi. Giống ít bị nhiễm bệnh cháy lá, củ đồng đều, thịt củ màu trắng, năng suất củ tươi: 33,0 tấn/ha, hàm lượng tinh bột 28,7%, thời gian thu hoạch 9-11 tháng. 7 Giống sắn KM 94 là giống sắn được trồng phổ biến nhất trên phạm vi toàn quốc. Điển hình là Tây Ninh và Đồng Nai đã áp dụng giống KM 94 với diện tích hàng trăm ha/hộ, đạt năng suất trên 30 tấn/ha [8]. 1.2.2. Giá trị cây sắn Cây sắn có giá trị kinh tế lớn về nhiều mặt. Sắn là nguồn lương thực đáng kể cho con người, là nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi, nguồn nguyên liệu cho công nghiệp. Tất cả các bộ phận của cây sắn đều có thể sử dụng vào mục đích kinh tế [9]. Thành phần hóa học chính của củ sắn là gluxit, ở củ sắn tươi có tỷ lệ các chất khoáng và vitamin khá cao đặc biệt lá canxi. Tuy nhiên, sắn có tỷ lệ protein và lipit thấp, vì vậy khi sử dụng sắn làm lương thực phải bổ sug thêm thức ăn giàu đạm và lipit mới cung cấp đủ năng lượng cho cơ thể. Sử dụng sắn làm lương thực: Thực tế ở nhiều vùng trên thế giới đã coi sắn và các sản phẩm từ sắn là nguồn lương thực chính, đặc biệt là các nước Châu Phi. Sắn đứng vị trí thư tư trên thế giới về mặt cung cấp năng lượng cho con người. Trong thập kỉ 20, có khoảng 450-500 triệu người ở 26 nước nhiệt đới sử dụng nguồn năng lượng tứ sắn tới 300 kcal/ngày. Từ sau năm 1991, đặc biệt từ năm 1996 đến nay nhờ sự tiến bộ trong công tác nghiên cứu tuyển chọn giống sắn mới và khuyến nông sắn, với việc giới thiệu giống sắn mới KM 60, KM 94 vào sản xuất đã tạo ra bước đột phá trong nghề trồng sắn ở Việt Nam cùng với việc đưa 42 nhà máy chế biến tinh bột sắn vào hoạt động, đã đánh dấu sự chuyển dịch vị trí cây sắn từ cây lương thực thành cây trồng hàng hóa. Sử dụng sắn làm thức ăn gia súc: Bên cạnh sử dụng lương thực và chế biến tinh bột phục vụ cho các ngành công nghiệp, sắn còn là nguồn thức ăn cho gia súc. 8 Ở nước ta, sắn là nguồn thức ăn quan trọng trong chăn nuôi của các hộ gia đình. Trong những năm gần đây, bên cạnh phối hợp sắn vào khẩu phần thức ăn hỗn hợp trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, việc nghiên cứu ủ chua sắn củ tươi phục vụ chăn nuôi lợn quy mô gia đình đã được chú ý và đã xây dựng thành quy trình kỹ thuật đang được nhiều hộ gia đình áp dụng vào chăn nuôi lợn ở khu vực miền Trung. Chế biến tinh bột từ củ sắn: Củ sắn là nguyên liệu chế biến tinh bột và tinh bột biến tính. Trong đó Châu Á là lục địa chế biến và xuất khẩu đứng đầu thế giới. Sử dụng lá sắn: Lá sắn có chứa nhiều chất dinh dưỡng. Lá sắn ngọt là một loại rau đối với Châu Phi, lá sắn được bó thành bó bán ở chợ như một loại rau. Ở Việt Nam, nhân dân ta dùng lá sắn non để luộc ăn hoặc muối chua [8]. 1.2.3. Thực trạng phát triển sắn ở Việt Nam Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực, thức ăn gia súc quan trọng sau lúa và ngô. Năm 2005, cây sắn có diện tích thu hoạch 432 nghìn ha, năng suất 15,35 tấn/ha, sản lượng 6,6 triệu tấn, so với cây lúa có diện tích 7.326 ha, năng suất 4,88 tấn/ha, sản lượng 35,8 triệu tấn, cây ngô có diện tích 995 ha, năng suất 3,51 tấn/ha, sản lượng gần một triệu tấn (FAO, 2007). Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ. Sắn chủ yếu dùng để bán (48,6%) kế đến dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%), chỉ có 12,2% dùng tiêu thụ tươi [8]. Sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước. Sắn là nguyên liệu chính để chế biến bột ngọt, bio- ethanol, mì ăn liền, bánh kẹo, siro, nước giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất giữ ẩm cho đất. Toàn quốc hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 3,8 triệu tấn củ tươi/năm và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ công rãi rác tại hầu hết các tỉnh trồng sắn. Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm khoảng 800.000 – 9 1.200.000 tấn tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước. Sản phẩm sắn xuất khẩu của Việt Nam chủ yếu là tinh bột, sắn lát và bột sắn. Thị trường chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Singapo, Hàn Quốc. Đầu tư nhà máy chế biến bio- etanol là một hướng lớn triển vọng [8]. Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam tầm nhìn đến năm 2020. Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất lúa, ngô và coi trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có điều kiện phát triển. Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự báo thuận lợi và có lợi thế cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến bioethanol, bột ngọt, thức ăn gia súc và những sản phẩm tinh bột biến tính. Diện tích sắn của Việt Nam dự kiến ổn định khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và sản lượng sắn bằng cách chọn tạo và phát triển các giống sắn tốt có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác sắn bền vững và thích hợp vùng sinh thái [8]. 1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và ngoài nƣớc 1.3.1. Trên thế giới Các chương trình nhân giống truyền thống tại Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Colombia, và Viện Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế (IITA), Nigeria, hai Trung tâm CGIAR đã thành công trong việc phát triển và tạo các giống sắn tăng khả năng kháng bệnh và côn trùng, hàm lượng chất khô và cải thiện chất lượng sắn ở châu. Lai giống truyền thống khó có khả năng cung cấp giải pháp toàn diện để cải thiện cây trồng cho phù hợp với nhu cầu của người nông dân và sản xuất thương mại khác nhau ở vùng nhiệt đới. Việc áp dụng công nghệ biến đổi gen để đưa những tính trạng nông dân mong muốn vào giống cây trồng tạo ra dòng ưu tú [21]. Trên thực tế, khả năng chuyển vật liệu di truyền mới vào hệ gen cây sắn theo cách này là cần thiết. Sau một thời gian phát triển công nghệ trong 10 những năm 1990 đã có tiến bộ đáng kể ở lĩnh vực tạo cây sắn biến đổi gen để tăng cường giá trị cho người sản xuất và người tiêu dùng. Mọi nỗ lực hướng vào tích hợp những đặc điểm nông dân mong muốn vào giống cây dành cho thương mại trong tương lai. Công nghệ biến đổi gen có đầy đủ tiềm năng đưa cây sắn trở thành cây lương thực và hàng hóa trong thế kỷ 21 [21]. Công nghệ biến đổi gen cho phép những tính trạng có lợi được chuyển từ một giống sắn này tới giống sắn khác và từ họ hàng hoang dại, vượt qua ranh giới loài và các vấn đề về thụ phấn chéo và giao phối cận huyết. Ngoài ra, chuyển vật chất di truyền từ các nguồn ngoại lai như virus cho chiến lược kháng tác nhân gây bệnh, và gene vi khuẩn kháng sâu có thể được phát triển và triển khai mang lại lợi nhuận cho nông dân trồng sắn. Công nghệ chuyển gene ở sắn cũng như các loại cây trồng khác, hệ thống biến đổi gen trong sắn phụ thuộc vào khả năng tạo các tế bào toàn năng và mô của hệ thống nuôi cấy mô. Đây là mục tiêu cho chuyển gene, sau khi chọn lọc thành công tái sinh cây chuyển gene hoàn chỉnh. Ở sắn, không hệ thống tái sinh nào tái sinh được cây từ mô trưởng thành. Tuy nhiên, nghiên cứu ban đầu đã xác định rằng phôi soma có thể được cảm ứng và cây được tạo ra từ mẫu lá chưa hoàn chỉnh trên môi trường Murashige và Skoog (1962) bổ sung auxin. Cây tái sinh theo cách này là dạng vô tính của vật liệu gốc trưởng thành, giữ nguyên tất cả các tính trạng của các tế bào mầm có được. Những cấu trúc phôi đa bào và phôi thứ cấp có thể được tạo ra từ các tế bào mầm [19] đã được sử dụng làm mục tiêu cho chuyển gen khi chương trình kỹ thuật di truyền của sắn được bắt đầu vào đầu những năm 1990. Sau một thời gian thất bại, đã có bằng chứng cho việc tạo phôi và thực vật chuyển gen lần đầu tiên được đưa ra vào năm 1994 [20]. Tiếp theo là bước đột phá trong tái sinh cây từ hệ thống phôi, dẫn đến phục hồi xác nhận cây sắn biến đổi gen biểu hiện uidA và gen chỉ thị luciferine [18]. 1.3.2. Tại Việt Nam [...]... được chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào ADN nhân (hình 5) 15 Hình 5 Cơ chế biến nạp A.tumefaciens vào tế bào thực vật 1.5 Gen ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase) ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) có kích thước 1500bp, là gen quy định việc tổng hợp nên enzyme AGPase có vai trò xúc tác cho quá trình tổng hợp tinh bột trong cây Làm tăng tốc độ luân chuyển tinh bột ở cây chuyển. .. tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus” Kĩ thuật chuyển gen vào thực vật đã được một số tác giả nghiên cứu thành công, cụ thể như: Năm 2008, Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar -gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen Năm 2008, Đỗ Tiến Phát và cộng sự tiến hành nghiên. .. 14: Cây thuốc lá chuyển gen Wt (wild type): Mẫu thuốc lá không chuyển gen * Tỷ lệ chuyển gen của các mảnh lá đƣợc thể hiện qua bảng 6 Bảng 6 Kết quả chuyển gen của các mảnh lá thuốc lá sau phân tích PCR Mẫu tạo chồi tái sinh cây Cây tái sinh mang gen đích Số lượng Tỉ lệ (%) Số lượng Tỉ lệ (%) 2,25 ± 1,0 25,0 ± 1,3 5,0 ± 1,0 35,7 ± 1,0 Như vậy thông qua kết quả phân tích PCR ở các cây thuốc lá chuyển gen, ... cảm ứng tạo cây chuyển gen mang gen là 35,7% Phương pháp nuôi cấy đơn giản, không đòi hỏi nhiều thời gian: Trong khoảng từ 3-4 tuần có thể tạo được các cây chuyển gen ổn định Phương pháp này cũng có thể được sử dụng để thử nghiệm các cấu trúc gen mới biểu hiện trong các tế bào thực vật Trong giới hạn nghiên cứu của đề tài, tiếp tục áp dụng quy trình trên tiến hành tạo cây sắn KM 94 chuyển gen AGPase... thành sắn KM 94 27 - Công thức 4: Biến nạp vi khuẩn mang gen AGPase vào mảnh lá mầm sắn KM 94 Mỗi công thức thí nghiệm thực hiện lặp lại ba lần 2.3.4 Các chỉ tiêu cần xác định - Tỉ lệ mẫu sắn tạo mô sẹo (%): = (Số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu) ×100 - Tỉ lệ mẫu K326 tái sinh cây (%): = (Số mẫu tạo chồi/ tổng số mẫu cảm ứng) × 100 - Tỉ lệ cây thuốc lá mang gen sau phân tích PCR (%): = (Số cây mang gen AGPase/... AGPase/ tổng số cây tạo ra) × 100 - Xác định sự có mặt của gen trên mẫu thuốc lá K326 bằng phương pháp phân tích phân tử: PCR - Xác định khả năng sống sót của mẫu sắn KM 94 chuyển gen trên môi trường chọn lọc sau 3 tuần chuyển bằng cách tính tỉ lệ phần trăm số mẫu sống sót 28 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Biến nạp vi khuẩn mang gen AGPase vào mảnh thuốc lá K326 Sau khi đã nuôi khuẩn mang gen đích, tiến.. .Nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật bắt đầu từ năm 1975 Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS Lê Trần Bình và PTS Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus Một trong những kết quả của đề tài cấ p Viê ̣n KH&CN Viê ̣t Nam đươ ̣c ti ến hành trong 2 năm 20072008: Nghiên cứu. .. chọn lọc mới Bƣớc 6: Tạo cây hoàn chỉnh và xác định hiệu quả chuyển gen ở thuốc lá K326 - Khi chồi mọc cao khoảng 2 – 3cm tiến hành tách các chồi nhỏ này và chuyển sang môi trường ra rễ 24 - Sau 3 tuần các cây in vitro được đưa ra ngoài môi trường Cây non được chuyển sang trồng trong bầu - Thu mẫu và xác định hiệu quả chuyển gen 2.3.2 Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen AGPase bằng phương pháp... quá trình tổng hợp ADP – glucose Uzoma Ihemere và cs giả thiết rằng sự tạo ADP – glucose được tăng cường bởi APGase vi khuẩn với sự điều hoà allosteric đã được biến đổi có thể làm tăng quá trình tạo tinh bột trong củ sắn do khả năng tạo sucrose của cây sắn được tăng cường Nhóm nhà nghiên cứu này đã tạo ra cây chuyển gen biểu hiện gen glgC E.coli đã bị biến đổi (G336D) Các cây này có hoạt tính APGase... pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro - Lựa chọn vật liệu chuyển gen: Lá chưa trưởng thành, đoạn thân non, lá mầm sắn KM 94 và mảnh lá K326 - Cảm ứng vật liệu chuyển gen trước khi gây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens trên môi trường MS bổ sung picloram nồng độ 12mg/l (đối với thuốc lá thì thay picloram bằng BAP nồng độ 1mg/l trong thời gian 2 ngày - Gây nhiễm với vật liệu chuyển gen: . là: “Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen ADP Glucose pyrophosphorylase (AGPase) vào giống sắn KM 94 và cây thuốc lá K326 . 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định sự có mặt của gen ADP Glucose pyrophosphorylase. sắn KM 94 chuyển gen trên môi trường chọn lọc. 4. Đối tƣợng và thời gian nghiên cứu 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu Khả năng mang gen AGPase của cây thuốc lá K326 và cây sắn KM 94 chuyển gen. . 19 giống và trên 100 loài, trong đó có một số giống sắn phổ biến ở Việt Nam như: KM 94, KM 140, KM 98-5, KM 98-1, SM 937-26, KM 419, KM 325 Trong đề tài này chỉ nghiên cứu giống sắn: KM 94