ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN    HUỲNH THỊ BÍCH LAN THU NHẬN DEXTRIN, MALTOSE, α-GLUCOSE TỪ TINH BỘT Chuyên ngành: Sinh Hóa Mã số: 60 42 30 1 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2011 Lời cảm ơn Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Trần Linh Thước. Thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em thực hiện đề tài. Thật may mắn cho em khi được Thầy hướng dẫn nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn Thầy. Em xin cám ơn chân thành chị Đặng Thị Phương Thảo. Chị đã truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý giá. Ch ị luôn quan tâm, động viên em mỗi khi gặp khó khăn. Em xin cảm ơn anh Nguyễn Trí Nhân. Người đã tận tình hướng dẫn em từ lúc mới vào Lab. Thời gian được nghiên cứu cùng anh không quá dài, nhưng những kiến thức và sự nhiệt tình giúp đỡ của anh đã giúp em rất nhiều. Em xin cảm ơn chị Dương Xuân Huê, anh Trần Thanh Phong, anh Võ Minh Trí và các bạn ở Phòng thí nghiệm Tin Sinh học – trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. Các anh chị và các bạn đã giúp đỡ và động viên em rất nhiều trong suốt quá trình làm luận văn. Anh cảm ơn Hằng, Hiếu, Dung, Đạt, Hòa, Trinh, Đức và tất cả các bạn ở Lab A. Lab A thật sự là một ngôi nhà hạnh phúc với các thành viên thật dễ thương. Cám ơn các bạn thật nhiều. Và cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ. Ba mẹ luôn bên con, luôn động viên con để con hoàn thành luận văn này. MỤC LỤC Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1 1.1 MỞ ĐẦU 2 1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 4 1.2.1. Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase bằng phương pháp metagenomics từ đất 4 1.2.2. Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase phân lập từ Vườn quốc gia Nam Cát Tiên 5 1.2.3. Nghiên cứu thu nhận các gen mã hóa cellulase từ vi khuẩn C. Thermocellum 5 CHƯƠNG 2: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 7 2.1. CELLULASE 8 2.1.1. Cellulose 8 2.1.2. Phân loại cellulase 8 2.1.3. Các nhóm vi sinh vật có cellulase trong tự nhiên 12 2.2. METAGENOMICS 13 2.2.1 Metagenome và metagenomics 13 2.2.2 Các kỹ thuật trong nghiên cứu metagenomics 13 2.3. XẠ KHUẨN TỔNG HỢP CELLULASE 18 2.3.1. Đại cương về xạ khuẩn 18 2.3.2. Nghiên cứu về xạ khuẩn có khả năng tổ ng hợp enzym cellulase 19 2.4. CELLULASE TỪ CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM 21 2.4.1. Đặc tính cellulase của C. thermocellum 21 2.4.2. Phức hợp cellulosome 22 2.4.3. Các nghiên cứu về gen và enzym cellulase từ C. thermocellum 25 2.4.4. Các cellulase từ C. thermocellum được nghiên cứu trong luận văn 26 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 3.1 VẬT LIỆU 29 3.1.1 Dụng cụ và thiết bị 29 3.1.2. Hóa chất 29 3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 36 3.1.4. Vật liệ u sinh học 39 3.2. PHƯƠNG PHÁP 42 3.2.1. Thu nhận metagenome DNA từ đất 42 3.2.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa cellulase từ metagenome DNA bằng phản ứng PCR 43 3.2.3. Xây dựng thư viện metagenome DNA 50 3.2.4. Sàng lọc dòng có hoạt tính cellulase từ thư viện metagenome DNA 52 3.2.5. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng phân hủy cơ chất CMC 53 3.2.6. Ly trích genome DNA các chủng xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC 54 3.2.7. Thu nhận đoạn gen mã hóa cellulase từ xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC bằng phản ứng PCR 54 3.2.8. Thu nhận các gen mã hóa cellulase celA, celS của vi khuẩn Clostridium thermocellum bằng phản ứng PCR 57 3.2.9. Tạo các dòng E. coli biểu hiện các cellulase CelA, CelS của vi khuẩn C.thermocellum 61 3.2.10. Biểu hiện các gen celA, celS trong tế bào E. coli 64 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 66 4.1. THU NHẬN GEN MÃ HÓA CELLULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP METAGENOMICS 67 4.1.1. Thu nhận metagenome DNA 67 4.1.2. Nhân bản gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR dựa vào các cặp mồi thoái hóa được thiết kế từ vùng bảo tồn trình tự axit amin 68 4.1.3. Nhân bản gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR dựa vào các cặp mồi được thiế t kế từ vùng bảo tồn trình tự nucleotide 69 4.1.4. Xây dựng thư viện metagenome với pBluescript II SK (+) và plasmid pMBD14 trong tế bào chủ E. coli .75 4.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH CELLULASE PHÂN LẬP TỪ VƯỜN QUỐC GIA NAM CÁT TIÊN 79 4.2.1. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC 79 4.2.2. Thu nhận đoạn gen mã hóa cellulase từ xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC bằng phản ứng PCR 80 4.3. T ẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM .87 4.3.1. Thu nhận các gen mã hóa cellulase celA, celS của vi khuẩn Clostridium thermocellum bằng phản ứng PCR 87 4.3.2. Tạo dòng các gen celA, celS trong pBluescript II SK(+) và E. coli DH5α 88 4.3.3. Tạo các dòng E. coli biểu hiện các cellulase CelA, CelS của vi khuẩn C. Thermocellum 90 4.3.4. Biểu hiện các cellulase CelA, CelS của vi khuẩn C. thermocellum trong E.coli 98 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 101 Tài liệu tham khảo 105 DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ BẢNG Trang Bảng 1.1. Bảng so sánh giá trị bổ dưỡng giữa gạo lức và bắp hạt 14 Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chất lượng của maltose tinh thể 21 Bảng 2.1: Các bước tiến hành xây dựng đường chuẩn glucose 29 Bảng 2.2: Các bước tiến hành xây dựng đường chuẩn maltose 32 Bảng 2.3: Mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị OD (phương pháp Heinkel) 33 Bảng 2.4: Tiến hành phản ứ ng thủy phân tinh bột bởi enzyme 33 Bảng 2.5. Các bước tiến hành xác định hoạt độ enzyme GA của dung dịch mẫu 34 Bảng 3.1. Hoạt độ chung của enzyme Termamyl-LS 42 Bảng 3.2. Hoạt độ chung của enzyme Sebamyl-L 42 Bảng 3.3. Hoạt độ chung của enzyme AMG-E 43 Bảng 3.4. Thành phần sinh hóa chủ yếu của bột bắp 43 Bảng 3.5. Thành phần sinh hóa chủ yếu của bột gạo 44 Bảng 3.6. Thành phần sinh hóa chủ yếu của bột năng 44 Bảng 3.7. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng acid HCl trên cơ chất bột gạo, tương ứng với chỉ số DE 45 Bảng 3.8. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng acid HCl trên cơ chất bột bắp, tương ứng với chỉ số DE 46 Bảng 3.9. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng acid HCl trên cơ chất bột năng, tương ứng với chỉ số DE 47 Bảng 3.10. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng acid HCl trên cơ chất tinh bột tan tương ứng với chỉ số DE 48 Bảng 3.11. So sánh lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột bằng tác nhân acid HCl trên các nguồn cơ chất khác nhau 50 Bảng 3.12. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Termamyl trên cơ chất bột gạo và giá trị DE 51 Bảng 3.13. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Termamyl trên cơ chất bột bắp và giá trị DE 52 Bảng 3.14. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Termamyl trên cơ chất bột năng và giá trị DE 53 Bảng 3.15. Lượng dextrin thu được 54 Bảng 3.16. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa bằng enzyme Termamyl trên các nguồn cơ chấ t khác nhau 56 Bảng 3.17. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl-L trên bột gạo và giá trị DE 57 Bảng 3.18. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl-L trên bột bắp và giá trị DE 58 Bảng 3.19. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl-L trên bột năng và giá trị DE 59 Bảng 3.20. Lượng maltose thu đượ c 60 Bảng 3.21. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình dịch hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 61 Bảng 3.22. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột gạo và giá trị DE 62 Bảng 3.23. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột bắp và giá trị DE 63 Bảng 3.24. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột năng và giá trị DE 64 Bảng 3.25. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình dịch hóa bằng enzyme AMG-E trên các nguồn cơ chất khác nhau 65 Bảng 3.26. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột gạo và giá trị DE 66 Bảng 3.27. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột bắp và giá trị DE 67 Bảng 3.28. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột năng và giá trị DE 68 Bảng 3.29. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 69 Bảng 3.30. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân b ằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột gạo và giá trị DE 70 Bảng 3.31. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột bắp và giá trị DE 71 Bảng 3.32. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột năng và giá trị DE 72 Bảng 3.33. So sánh lượng đường khử t ạo thành trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme AMG trên các nguồn cơ chất khác nhau 73 SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1. Quy trình sản xuất dextrin 18 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ sản xuất dịch xirô glucose xirô maltose bằng enzyme amylase 40 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ sản xuất dịch xirô glucose xirô maltose bằng phương pháp kết hợp axit và enzyme amylase. 41 DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ HÌNH Trang Hình 1.1. Các enzyme thủy phân tinh bột 4 Hình 1.2. Cấu trúc của amylose và amylopectin 11 Hình 1.3. Cấu tạo Maltose 19 Hình 1.4. Công thức cấu tạo glucose (dạng mạch hở và 2 dạng mạch vòng α-glucose, β-glucose) 21 Hình 1.5. Máy HPLC 24 Hình 1.6. Mô hình hệ thống HPLC điển hình 24 Hình 3.1. Dung dịch thu được: trước (trái) và sau (phải) khi ly tâm và xử lý bằng than hoạt tính. (Tương ứng ống 1: bột bắp, ống 2: bột gạo, ống 3: b ột năng) 74 BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1. So sánh lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột bằng tác nhân acid HCl trên các nguồn cơ chất khác nhau 50 Biểu đồ 3.2. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa bằng enzyme Termamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 56 Biểu đồ 3.3. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 61  Biểu đồ 3.4. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình đường hóa bằng enzyme AMG-E trên các nguồn cơ chất khác nhau 65 Biểu đồ 3.5. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 70 Biểu đồ 3.6. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme AMG trên [...]... bột để cải thiện chức năng của tinh bột và thu các sản phẩm có giá trị là một việc hết sức cần thiết Công nghệ biến đổi tinh bột thông thường được thực hiện bằng phương pháp hóa học và phương pháp sinh học, thông qua phản ứng cắt, oxy hóa hay chuyển gốc hóa học nhằm thu các sản phẩm có giá trị theo ý muốn 1.1.1 Sự thủy phân tinh bột bằng phương pháp hóa học [2] Dưới tác động của các tác nhân hóa học,... (GA) chiếm 26% và α-amylase bền nhiệt chiếm 24% Cho đến nay việc nghiên cứu cấu trúc gen mã hóa, tính chất và cấu trúc của enzyme amylase, cũng như các loại amylase khác nhau, sản xuất và tinh sạch amylase cũng đã đư ợc tiến hành nhiều Amylase thu c nhóm hydrolase; đây là enzyme có vai trò quan tr ọng trong công nghiệp thực phẩm Thu nhận dextrin, maltose, α-glucose từ tinh bột Huỳnh Thị Bích Lan 4... tinh bột bị biến tính bằng hóa chất thành hai loại: tinh bột cắt và tinh bột bị thay thế Nhóm tinh bột cắt thường có độ nhớt thấp, mạch tinh bột bị cắt bằng tác nhân acid, hay chất oxy hóa, hay một vài loại muối,… Kết quả là trong phân tử tinh bột xảy ra hiện tượng đứt gãy các liên kết glucoside và các liên kết khác, giảm trọng lượng, xuất hiện một số liên kết mới trong và giữa các phân tử Cấu trúc... bởi các chất oxy hóa, hoạt độ GA giảm tỷ lệ thu n với lượng hydrate carbon bị oxy hóa GA nói chung hoạt động trong vùng acid, pHopt 4.5-5.0, t0opt 40-600C Tuy nhiên cũng có m ột vài ngoại lệ GA I và GA II là 2 isoform từ nấm mốc ưu nhiệt Humicola lanuginose có pHopt là 4.9 và 6.6, và GA II có thể chịu được pH tới 11.0 GA của Corticum rolfsii có 5 isoform, giữ được hoạt tính ở pH 9.0 và có khả năng thủy... Để sản xuất British gum Thu nhận dextrin, maltose, α-glucose từ tinh bột Huỳnh Thị Bích Lan 18 nhiệt độ được sử dụng là 170-1950C và thời gian chuyển hóa là 7 giờ hoặc lâu hơn Trong quá trình chuyển hóa này, sự tăng nhiệt độ và độ ẩm phải luôn được kiểm soát chặt chẽ để có được mức độ chuyển hóa theo yêu cầu Sau đó dextrin được đưa đến một thiết bị trộn khác để tránh sự chuyển hóa quá mức (overconversion)... dưới nhiều dạng: dạng bột có màu sắc thay đổi từ trắng tới vàng hoặc nâu, dạng hạt và dạng hồ (paste) Thông thường dextrin được Thu nhận dextrin, maltose, α-glucose từ tinh bột Huỳnh Thị Bích Lan 17 chia thành dextrin trắng, Canary dextrin và gum British Các sản phẩm trên nhận được trong các điều kiện sản xuất khác nhau, có những tính chất và ứng dụng khác nhau [1]  Dextrin trắng được sản xuất bằng... amylase: Taka amylase (TAA), glucoamylase (GA), và α-glucosidase (AGL), được mã hóa bởi các gen tương ứng là amyB, glaA và agdA Các enzyme này được tạo ra bằng cảm ứng với tinh bột và các oligosaccharide như maltose, maltotriose, và isomaltose Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme amylase có thể tăng lên nhờ thay đổi điều kiện nuôi và thành phần dinh dưỡng của môi trường Phương pháp SSF cũng thường được sử... biến tính bằng hóa chất của hãng Vedan nh tinh b ột acetyl hóa, tinh bột ư cationic, tinh bột oxy hóa và tinh bột biến tính kép Ngoài ra còn có các sản phẩm bánh kẹo ngọt của các công ty như Bánh kẹo Hải Hà, Bánh kẹo Kinh đô, công ty Thực phẩm Sài Gòn, Bên cạnh đó, tác giả Hoàng Kim Anh cùng các cộng sự cũng đã có nhiều nghiên cứu tương đối chi tiết về cấu trúc cũng như các đặc tính hóa, lý của tinh... phòng thí Thu nhận dextrin, maltose, α-glucose từ tinh bột Huỳnh Thị Bích Lan 2 nghiệm Trong công nghiệp thực phẩm, tinh bột loại này dùng để tạo cấu trúc gel trong khi sản xuất bánh kẹo [2] Dưới tác động của tác nhân oxy hóa như KMnO4 trong môi trường acid, tinh bột bị oxy hóa được sử dụng thay thế agar, pectin trong sản xuất bánh kẹo, kem, các sản phẩm sữa và đồ hộp Các sản phẩm bị oxy hóa yếu được... isoform và các tính chất đặc biệt của các isoform này [29] α-Amylase từ nấm men – So với α-amylase từ nấm mốc và vi khuẩn thì các nghiên cứu về α-amylase từ nấm men còn rất ít ỏi α-Amylase bền nhiệt, có khả năng thủy phân hạt tinh bột sống từ nấm men Crytococcus sp đã được tinh sạch 1.2.2 β - Amylase [17, 22] β-Amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2) các tên gọi khác saccharogen amylase; glycogenase; . glucoside tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Hình 1.1. Các enzyme thủy phân tinh bột [24] Enzymes thủy phân tinh bột 5 Thu nhận dextrin, maltose, α-glucose từ tinh bột. Thu nhận dextrin, maltose, α-glucose từ tinh bột Huỳnh Thị Bích Lan Ngoài ra khi xử lý tinh bột với acid acetic, ta nhận được tinh bột acetate. Hàm lượng nhóm acetate có thể chiếm từ 3-6%. trọng của nhóm tinh bột cắt là tinh bột tan dùng trong phòng thí 2 Thu nhận dextrin, maltose, α-glucose từ tinh bột Huỳnh Thị Bích Lan nghiệm. Trong công nghiệp thực phẩm, tinh bột loại này