ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN VĂN KHOA BIỂU HIỆN PROTEIN HEMAGGLUTININ CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN HỆ THỐNG BACULOVIRUS/TẾ BÀO CÔN TRÙNG Chuyên ngành: Sinh lý Động vật Mã số chuyên ngành: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS CAO THỊ BẢO VÂN Tp Hồ Chí Minh-Năm 2011 LỜI CÁM ƠN Em xin chân thành cám ơn cô TS Cao Thị Bảo Vân tận tình quan tâm, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian em làm luận văn Em xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô môn Sinh lý Động vật, khoa Sinh học truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học tạo sở vững giúp em hoàn thành luận văn Chân thành cám ơn anh, chị bạn Phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur Tp.HCM hỗ trợ giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tp HCM, ngày 13 tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Văn Khoa Danh mục chữ viết tắt    DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT aa: axít amin (amino acid) bp: cặp bazơ (base pair) cDNA: DNA bổ sung (complementary DNA) cm: centimeter dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate DNA: Deoxyribonucleic acid E.coli: Escherichia coli EDTA: Ethylene-Di-amine-Tera-acetic acid g: gram HPAI: virus cúm gia cầm độc lực cao (highly pathogenic avian Influenza) LPAI: virus cúm gia cầm độc lực thấp (low pathogenic avian Influenza) kb: kilobasepairs (1000 bazơ) ml: mililiter mM: milimolar mRNA: RNA thông tin (messenger RNA) nm: nanometer OD: mật độ quang (optical density) PCR: Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase Chain Reaction) pfu: đơn vị hình thành vệt hòa tan (plaque forming unit) RNA: Ribonucleic acid RNP: Ribonucleoprotein UV: tia cực tím (ultraviolet) Luận văn thạc sĩ    iv  Danh mục chữ viết tắt    v/v: tỉ lệ phần trăm theo thể tích (v/v) vRNA: RNA virus (viral RNA ) WHO: Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) μg: microgram μl: microliter μM: micromolar Luận văn thạc sĩ    v  Mục lục    MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cám ơn Mục lục i Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng hình vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1 1.1.1 Tình hình giới 1.1.2 Tình hình nước 1.2 Đại cương virus cúm A/H5N1 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A/H5N1 1.2.3 Bộ gen virus cúm A/H5N1 1.2.4 Kháng nguyên hemagglutinin 1.2.5 Chu trình sinh sản virus cúm A/H5N1 tế bào chủ 13 1.2.5.1 Bám dính, xâm nhập tháo vỏ virus tế bào chủ 13 1.2.5.2 Sinh tổng hợp mRNA chép RNA virus 13 1.2.5.3 Q trình đóng gói nẩy chồi 14 1.3 Hệ thống baculovirus/tế bào côn trùng 15 CHƯƠNG – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Hóa chất 19 2.1.2 Bộ tách chiết sử dụng 20 2.1.3 Các plasmid 20 2.1.4 Tế bào 20 Luận văn thạc sĩ      i  Mục lục    2.1.5 Thiết bị 20 2.1.6 Các vật liệu khác 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Thu nhận plasmid pFastBac1 tái tổ hợp chứa gen H5 21 2.2.1.1 Thu nhận sản phẩm khuếch đại chứa gen H5 21 2.2.1.2 Tinh sản phẩm khuếch đại 22 2.2.1.3 Định lượng sản phẩm khuếch đại 22 2.2.1.4 Chuyển gen H5 vào plasmid pFastBac1 22 2.2.1.5 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 23 2.2.1.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 23 2.2.1.7 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 24 2.2.2 Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5 25 2.2.2.1 Tạo dòng bacmid-H5 tái tổ hợp 25 2.2.2.2 Tách chiết bacmid-H5 tái tổ hợp 25 2.2.2.3 Kiểm tra bacmid-H5 tái tổ hợp 26 2.2.3 Biểu protein hemagglutinin 26 2.2.3.1 Chuyển nhiễm bacmid-H5 tái tổ hợp vào tế bào côn trùng Sf9 26 2.2.3.2 Thu nhận bảo quản baculovirus tái tổ hợp 27 2.2.3.3 Nhân baculovirus tái tổ hợp 27 2.2.3.4 Biểu protein hemagglutinin 28 2.2.3.5 Thu nhận protein hemagglutinin 28 2.2.3.6 Phản ứng ngưng kết hồng cầu 28 2.2.3.7 Điện di SDS-PAGE 30 CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thu nhận plasmid pFastBac1 tái tổ hợp mang gen H5 32 3.1.1 Thu nhận sản phẩm khuếch đại mang gen H5 32 3.1.2 Tạo dòng plasmid pFastBac1 tái tổ hợp 33 3.1.3 Kiểm tra plasmid pFastBac1 tái tổ hợp 35 Luận văn thạc sĩ      ii  Mục lục    3.2 Thu nhận bacmid tái tổ hợp mang gen H5 38 3.3 Kiểm tra bacmid tái tổ hợp 40 3.4 Biểu protein hemagglutinin 41 3.4.1 Biểu baculovirus tái tổ hợp mang gen H5 41 3.4.2 Nhân baculovirus tái tổ hợp 44 3.4.3 Biểu protein hemagglutinin 46 3.4.4 Xác định kiểm tra hoạt tính protein hemagglutinin 48 3.4.5 Xác định vị trí protein hemagglutinin 50 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 53 4.2 Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 62 Luận văn thạc sĩ      iii  Danh mục bảng hình     DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các phân đoạn gen virus cúm A protein mã hóa Bảng 3.1 Hình thái tế bào trùng bị baculovirus xâm nhiễm 47 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Số trường hợp nhiễm tử vong cúm A/H5N1 giới Hình 1.2 Số trường hợp nhiễm tử vong cúm A/H5N1 Việt Nam Hình 1.3 Cấu trúc hạt virus cúm A Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc sơ cấp protein hemagglutinin 10 Hình 1.5 Sơ đồ protein hemagglutinin (H5) dạng trimer monomer 12 Hình 1.6 Chu trình chép virus cúm A 14 Hình 1.7 Sơ đồ tạo baculovirus tái tổ hợp dùng BacPAK6 16 Hình 1.8 Sơ đồ mơ tả hệ thống Bac-to-Bac® Baculovirus Expression 18 Hình 2.1 Nguyên tắc phản ứng ngưng kết hồng cầu 29 Hình 2.2 Hình minh họa phương pháp điện di SDS-PAGE 31 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm khuếch đại từ plasmid tái tổ hợp pHW2000-7BTV(H5) 32 Hình 3.2 Sơ đồ plasmid tái tổi hợp pFastBac1-7BTV(H5) 33 Hình 3.3 Các khuẩn lạc E.coli TOP10 môi trường sàng lọc 34 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm khuếch đại từ plasmid thu nhận 35 Hình 3.5 Kết giải trình tự plasmid thu nhận 37 Hình 3.6 Khuẩn lạc E.coli DH10Bac môi trường sàng lọc 49 Hình 3.7 Sơ đồ chuyển vị pFastBac1 tái tổ hợp vào bacmid 40 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm khuếch đại từ bacmid thu nhận 41 Hình 3.9 Tế bào Sf9 chuyển nhiễm 43 Luận văn thạc sĩ   vi Danh mục bảng hình     Hình 3.10 Tế bào Sf9 trước 96 sau bị baculovirus xâm nhiễm 45 Hình 3.11 Phản ứng ngưng kết hồng cầu 59 Hình 3.12 Kết điện di SDS-PAGE tế bào Sf9 51 Luận văn thạc sĩ   vii Lời mở đầu    LỜI MỞ ĐẦU Virus cúm gia cầm H5N1 gây bệnh, làm từ vong người động vật mối quan tâm, lo ngại giới Năm 1997, Hồng Kông, virus cúm gia cầm H5N1 lần lây truyền sang người làm tử vong người 18 trường hợp dương tính [2], [26] Cuối năm 2003, virus cúm H5N1 phát triển thành đại dịch gia cầm nước Đơng Nam Á, sau lan sang quốc gia châu Âu châu Phi Theo báo cáo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tính đến ngày 22/06/2011, tổng số người tử vong giới 329 562 trường hợp dương tính với virus cúm H5N1 Riêng Việt Nam, số ca tử vong 59 119 trường hợp dương tính H5N1, đứng thứ hai giới sau Indonesia [46] Do đó, việc nghiên cứu, phịng ngừa ngăn chặn virus H5N1 công việc cấp thiết Trong số 11 12 protein virus cúm A/H5N1 [7], [45], hemagglutinin hai protein bề mặt quan trọng mang yếu tố định kháng nguyên Đến nay, nhiều cơng trình nghiên cứu biểu protein hemagglutinin hệ thống khác công bố như: hệ thống E.coli [11] , nấm men [43] , thực vật[39], côn trùng [26] động vật [19] Trong đề tài này, biểu protein hemagglutinin chủng virus cúm A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008(H5N1) hệ thống baculovirus/tế bào trùng Sf9 chúng có ưu điểm biểu nhanh chóng protein có hoạt tính sinh học Protein hemagglutinin ứng dụng cho nghiên cứu sâu như: tạo kháng đơn dòng, tạo Kit chẩn đoán hay phát triển vaccine Luận văn thạc sĩ   Kết Bàn luận    Tế bào sau thu nhận bị phá vỡ sóng siêu âm Phần cặn (pellet) gồm mảnh vỡ tế bào phần dịch tế bào chất (supernatant) thu nhận bảo quản 40C 3.4.4 Xác định kiểm tra hoạt tính sinh học protein hemagglutinin Nhiều phương pháp khác sử dụng để kiểm tra hoạt tính sinh học hemagglutinin kiểm tra khả ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin Assay), khả kháng phân cắt trypsin (trypsin digest assay), cấu trúc giống hoa thị (rosette-like structure) hemagglutinin quan sát kính hiển vi điện tử phản ứng hấp thụ hồng cầu (hemadsorption assay) tế bào côn trùng biểu hemagglutinin [13] Protein hemagglutinin có khả ngưng kết hồng cầu HA1 có khả gắn với thụ thể tế bào hồng cầu Do vậy, để kiểm tra biểu hoạt tính sinh học chúng, chọn phương pháp ngưng kết hồng cầu để kiểm tra Dịch tế bào chất Sf9 môi trường nuôi cấy tế bào thu nhận để thực phản ứng ngưng kết hồng cầu Kết kiểm tra phản ứng ngưng kết hồng cầu cho thấy tế bào Sf9 biểu protein hemagglutinin (H5) thành cơng protein cịn giữ ngun hoạt tính sinh học Kết từ quan sát giếng H (chứa môi trường nuôi cấy tế bào Sf9 bị xâm nhiễm) cho thấy dịch ni cấy khơng có khả ngưng kết hồng cầu Điều protein không tiết vào môi trường nuôi cấy tiết với lượng thấp Theo báo cáo Nitar Nwe biểu protein HA1 tế bào Sf9, protein chủ yếu nằm tế bào tiết vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, không loại trừ khả số tế bào chết bị ly giải giải phóng lượng nhỏ protein HA1 nội bào vào môi trường nuôi cấy [26] Yang Jing-lin biểu protein H5 tế bào HEK293 nhận thấy rằng, protein tiết vào môi trường ni Tuy nhiên, xóa vùng xuyên màng H5, protein H5 tiết đáng kể vào môi trường nuôi [19] Ngược lại, Nitar Nwe biểu protein HA1 không chứa vùng xuyên màng protein chủ yếu nằm tế bào côn trùng Sf9 Luận văn thạc sĩ   [26] Như vậy, dịng tế bào đóng vai trị quan 48 Kết Bàn luận    trọng biểu protein Kết từ giếng A, B, C, D cho thấy hồn tồn phù hợp với dự đốn Protein H5 biểu nằm tế bào trùng dạng hịa tan dịch tế bào   Hình 3.11 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (A) Dịch tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm 0.5 pfu/tế bào (B) Dịch tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm pfu/tế bào (C) Dịch tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm pfu/tế bào (D) Dịch tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm pfu/tế bào (E) Dịch tế bào Sf9 (chứng âm) (F) Chứng dương HA (G) Dung dịch đệm PBS (pH 7.2) (H) Môi trường nuôi cấy tế bào Sf9 với liều xâm nhiễm pfu/tế bào Ngồi ra, protein hemagglutinin thu có hoạt tính sinh học Yang Jing-lin biểu protein H5 tế bào HEK293 kiểm tra chúng có hoạt tính sinh học [19] Đây ưu biểu protein tế bào côn trùng so với biểu tế bào vi khuẩn Thật vậy, Fang-Feng Chiu biểu protein H5HA1 virus cúm H5N1 tế bào E.coli Sau đó, protein H5 phải tái gấp cuộn cột chứa dung dịch đệm GSH/GSSG L-arginine nhằm phục hồi cấu trúc không Luận văn thạc sĩ   49 Kết Bàn luận    gian protein [11] Ngoài ra, Q M Xie biểu protein H5 tế bào E Coli BL21 protein phải chaperon hỗ trợ gấp cuộn [47] Từ kết phản ứng ngưng kết hồng cầu cho thấy hiệu giá protein H5 đạt 23, 24, 25 26 đơn vị HA/106 tế bào liều gây nhiễm 0.5, 1, pfu/tế bào Từ cho thấy, sau 72 thu nhận với số lượng tế bào Sf9, liều gây nhiễm khác dẫn đến mức độ biểu protein khác Trong trường hợp này, tế bào gây nhiễm với MOI cho kết cao (26 đơn vị HA/106 tế bào) Ngược lại, tế bào gây nhiễm với MOI 0.5, thời điểm protein H5 chưa biểu mạnh Possee thu nhận hemagglutinin màng tế bào côn trùng hiệu giá HA đạt 650 đơn vị HA/106 tế bào đánh giá lúc baculovirus xâm nhiễm tối đa tế bào côn trùng Nitar Nwe thu 77µg protein HA từ tế bào chất 106 tế bào [26] So với nhiều nghiên cứu biểu HA tế bào côn trùng, lượng protein H5 thí nghiệm chúng tơi chưa cao Ngun nhân điều kiện trình thực chưa tối ưu như: phát triển tế bào, liều xâm nhiễm, nuôi cấy tế bào Sf9 lớp đơn, thời gian thu nhận protein H5 3.4.5 Xác định vị trí protein hemagglutinin Một phương pháp khác để xác định protein H5 phương pháp điện di SDS-PAGE Trong thí nghiệm chúng tơi, protein H5 chạy điện di SDSPAGE điều kiện biến tính Protein H5 có cấu trúc thứ cấp gồm ba chuỗi polypeptide, chuỗi gồm hai tiểu phần HA1 HA2 Trọng lượng phân tử tiểu phần khoảng 63 kDa tính tốn phần mềm Genamics Expression Dưới điều kiện biến tính, cấu trúc thứ cấp protein H5 chuyển thành chuỗi polypeptide có trọng lượng phân tử khoảng 63 kDa Kết từ điện di cho thấy, giếng 2, 4, có xuất vạch tương ứng với trọng lượng phân tử khoảng 63 kDa Một lần xác nhận protein H5 biểu thành công Luận văn thạc sĩ   50 Kết K B luận  Bàn   Tron thí ngh ng hiệm này, c th nhận ph dịch tế bào phần cặn tế hu hần ế ế bà để điện di SDS-PA AGE Trên điện di, cá giếng 2, 4, chứa phần dịch n d ác a h tế bào có xu vạ tương ứng trọng lượng phâ tử 63 k ế uất ạch ân kDa, gi iếng 3, 5,7 cũ xuất hi vạc (vệt mờ điện di tương ứng trọng lượn phân tử ũng iện ch t b g ng 63 kDa) Đi cho thấy prot iều o tein H5 tồn dạn hòa tan dịch tế bào n ng h khơng hịa tan tro cặn tế bào Trong báo cáo c Nitar N có kết luận ạng ong g Nwe c n tư ương tự [26] ] Protein H thu đượ từ cặn t bào có t gắn trê màng tế H5 ợc tế thể ên ế bà chủ nằm lưới nội c g chất Golgi M b Manon M.J.Cox thu nhận g n pr rotein hem magglutinin từ màng t bào côn trùng Sf9 với lượng đáng kể n tế n g [13] Ngoài i kết từ điện di ch thấy pro a, n ho otein H5 vẫ bả tồn, không bị phân ẫn ảo n cắ thành H HA1 HA enzyme tế bào chủ gen mã hóa protein H5 A2 n p nà trìn tự mã hó vùng độc lực HA1 H ày nh óa HA2 Hình 3.12 K điện di SDS-P H Kết PAGE tế bà Sf9 Giến 1: thang chuẩn (Bio ng orad) Giếng g 3: lần lư dịch tế bào chấ mảnh vỡ tế bào t từ tế bào Sf9 xâm ượt ất thu m nh hiêm với M Giếng 5: dịc tế bào ch mảnh vỡ tế bào thu từ MOI g n ch hất h t tế bào Sf9 đư xâm nh ế ược hiêm với MO Giếng 7: dịc tế bào ch mảnh OI g n ch hất h vỡ tế bào thu từ tế bào Sf9 đ ỡ u ế xâm nh hiêm với M 0.5 Giế 9: MOI ếng dị tế bào c ịch chất mản vỡ tế bào thu từ tế bào S (chứng âm) không biểu nh Sf9 g u hi protein H iện H5 Luận văn th sĩ hạc   51 Kết Bàn luận    Như vậy, protein H5 biểu tế bào trùng Sf9 có trọng lượng phân tử 63 kDa, với dự đoán dạng chưa phân cắt Bên cạnh đó, protein HA chủ yếu nằm tế bào dạng hịa tan lẫn khơng hòa tan   Luận văn thạc sĩ     52 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ  Kết Bàn luận    4.1 Kết luận: Từ nghiên cứu ban đầu cho thấy thu số thành công định Đoạn DNA mang gen H5 chủng virus cúm A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008 (H5N1) khuếch đại từ plasmid tái tổ hợp pHW2000H5(7BTV) chèn thành công vào plasmid pFastBac1 Sau đó, plasmid tái tổ hợp pFastBac1-H5 biến nạp vào E.coli DH10Bac nhằm chuyển vị gen H5 promoter polyhedrin vào bacmid Bacmid tái tổ hợp sau chuyển nhiễm vào tế bào trùng Sf9 dạng nuôi cấy lớp đơn nhằm biểu baculovirus tái tổ hợp Kết cho thấy biểu thành công baculovirus tái tổ hợp Tiếp theo, baculovirus tái tổ hợp tái xâm nhiễm vào tế bào côn trùng Sf9 nuôi cấy lớp đơn nhằm biểu protein hemagglutinin Phản ứng ngưng kết hồng cầu cho thấy protein hemagglutinin dịch tế bào biểu có hoạt tính sinh học Bên cạnh đó, protein hemagglutinin xác định chủ yếu nằm tế bào trùng Sf9 dạng hịa tan lẫn khơng hịa tan 4.2 Đề nghị: Kết đạt biểu protein hemagglutinin có hoạt tính sinh học Do đó, chúng tơi đề nghị tiếp tục chuẩn hóa điều kiện biểu protein tế bào côn trùng Sf9 như: xác định nồng độ baculovirus, liều xâm nhiễm, thời gian thu nhận tế bào biểu nhằm tối ưu lượng protein hemagglutinin Ngoài ra, phương pháp tinh protein cần thiết liên quan đến chất lượng số lượng protein thu Bên cạnh đó, kiểm tra tính kháng nguyên protein hemagglutinin biểu tế bào côn trùng bước quan trọng cho ứng dụng sâu tạo kháng thể đơn dịng, tạo Kit chẩn đốn phát triển vaccine   Luận văn thạc sĩ     53 Tài liệu tham khảo    TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIẾT [1] Nguyễn Chung Chỉnh (2010), Ứng dụng kỹ thuất di truyền ngược tạo virus cúm A/H5N1 Việt Nam giảm độc lực, luận văn thạc sĩ-chuyên ngành di truyền, trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM [2] C T B Vân, V H H Hải, N T Long, L H T Dương (2005), “Độc tính virút cúm A H5N1 gây bệnh người gia cầm qua vụ dịch từ 12/2003 tới tháng 4/2005 tỉnh phía Nam”, Tạp chí y học dự phịng Việt nam, tập XV, số (77), trang 5-10 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [3] Adwan, G M (2009), “Highly pathogenic influenza a virus (H5N1)”, Microbiology, Medical Journal of Islamic World Academy of Sciences, 17(1), pp 5-16 [4] Beckman Coulter (1999), CEQ™2000 Dye Terminator Cycle Sequencing Chemistry Protocol [5] Behrens, G., et a (2006), Influenza Report 2006, Flying Publisher, Paris, Cagliari, Wuppertal, Sevilla [6] Booms, E R., Guo, Y., Wang, J., et al (2009), “Comparative analysis between a low pathogenic and a high pathogenic influenza H5 hemagglutinin in cell entry”, Virology Journal, 6(76) [7] Bouvier, N M., Palese, P (2008), “The biology of influenza viruses” Vaccine, 26S, D49–D53 [8] Bragstad, K., Jørgensen, P H., Handberg, K., et al (2007), “First introduction of highly pathogenic H5N1 avian influenza A viruses in wild and domestic birds in Denmark, Northern Europe”, Virology Journal, 4, pp 43 Luận văn thạc sĩ   54 Tài liệu tham khảo    [9] Charmaine, W H K (2006), Viral determinants of influenza A (H5N1) associated TNF-α hyper-induction in human primary monocyte-derived macrophages, for the Degree of Master of Philosophy at The University of Hong Kong in August 2006 [10] Cherry, J L., Lipman, D J., Nikolskaya, A and Wolf, Y I (2009), “Evolutionary Dynamics of N-Glycosylation Sites of Influenza Virus Hemagglutinin”, PLoS Cur, 1: RRN100 [11] Chiu, F.F, Venkatesan, N., Wua, C R et al (2009) “Immunological study of HA1 domain of hemagglutinin of influenza H5N1 virus” Biochemical and Biophysical Research Communications, 383, pp 27–31 [12] Cohen, F S.and Melikyan, G B (2001), “Implications of a fusion peptide structure”, Nature Structural Biology, 8(8) [13] Cox, M.M.J (2009), Development of an influenza virus vaccine using the baculovirus-insect cell expression system, Thesis, Wageningen University, Wageningen [14] Cox, N J., Neumann, G., Donis, R O and Kawaoka, Y (2010), Orthomyxoviruses: influenza [15] Cox, R J., Brokstad, K A and Ogra, P (2003), “Influenza Virus: Immunity and Vaccination Strategies Comparison of the Immune Response to Inactivated and Live, Attenuated Influenza Vaccines”, Scandinavian Journal of Immunology, 59, pp 1–15 [16] Debi, P N, Hui, E K W., Barman, S., et al (2004), “Assembly and budding of influenza virus”, Virus Research, 106, pp 147–165 [17] Duan, L., Bahl, J., Smitha, G.J.D., et al (2008), “The development and genetic diversity of H5N1 influenza virus in China”, Virology, 380(2), pp 243-254 [18] Emily, R.B, Guo, Y., Wang,Y., Caffrey, M and Rong, L (2009), “Comparative analysis between a low pathogenic and a high pathogenic influenza H5 hemagglutinin in cell entry”, Virology Journal, 6(76) Luận văn thạc sĩ   55 Tài liệu tham khảo    [19] FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) (2011), “H5N1 HPAI Global overview – April /June 2011”, Empres /FAO-GLE, 28 [20] FAO animal production and health, “Approaches to controlling, preventing and eliminating H5N1 highly pathogenic avian influenza in endemic countries”, ISBN 978-92-5-106837-3 [21] Fusaro, A., Nelson, M I., Joannis, T., et al (2010), “Evolutionary Dynamics of Multiple Sublineages of H5N1 Influenza Viruses in Nigeria from 2006 to 2008”, Journal Of Virology, pp.3239–3247 [22] Guan, Y., Smith, G.J.D., Webby, R and Webster, R.G (2009), “Molecular epidemiology of H5N1 avian influenza” Rev sci tech Off int Epiz., 28 (1), pp 39-47 [3] Gutiérrez, R A., Naughtin, M J., Horm, S V., et al (2009), “A(H5N1) Virus Evolution in South East Asia”, Viruses , 1, pp 335-361 [4] Ha, Y., Stevens, D J., Skehel, J J and Wiley, D C (2002), “H5 avian and H9 swine influenza virus haemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes”, The EMBO Journal, 21(5), pp 865-875 [5] Han, X., Steinhauer, D A., Wharton, S A and Tamm, L K (1999), “Interaction of Mutant Influenza Virus Hemagglutinin Fusion Peptides with Lipid Bilayers: Probing the Role of Hydrophobic Residue Size in the Central Region of the Fusion Peptide”, Biochemistry, 38, pp.15052-15059 [6] Hitchman, R., King, L (2008), “Baculovirus protein expression technology”, Innovations in Pharmaceutical technology [7] Invitrogen (2002), Guide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniques [8] Invitrogen (2010), Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System An efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high-level expression of recombinant proteins, Catalog nos 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024, Version F 04, 10359 Luận văn thạc sĩ   56 Tài liệu tham khảo    [9] Jiang, S., Li, R., Du, L., Liu, S (2010), “Roles of the hemagglutinin of influenza A virus in viral entry and development of antiviral therapeutics and vaccines”, Protein Cell, 1(4), pp 342-354 [10] Jinn, T R., Nguyen, T K., Wu, T Y (2010), “Production of H5N1 Hemagglutinin in Trichoplusia ni Larvae by a Novel Bi-cistronic Baculovirus Expression Vector”, World Academy of Science, Engineering and Technology, 65 [11] Kaverin, N V., Rudneva, I A., Govorkova, E A., et al (2007), “Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of a Highly Pathogenic H5N1 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibodies”, Journal Of Virology, 81(23), pp 12911-12917 [12] Kaverin, N V., Rudneva, I A., Ilyushina, N A., et al (2002) “Structure of antigenic sites on the haemagglutinin molecule of H5 avian influenza virus and phenotypic variation of escape mutants”, Journal of General Virology, 83, pp 2497-2505 [13] Kilpatrick, M., Chmura, A A., Gibbons, D W., et al (2006),“Predicting the global spread of H5N1 avian influenza”, PNAS, 103(51), pp 19368– 19373 [14] Kitts, P A., Ayres, M D and Possee, R D (1990), “Linearization of baculovirus DNA enhances the recovery of recombinant virus expression vectors”, Nucleic Acids Research, 18(19), pp 5667 [15] Kost, T A., Condreay, J P and Jarvis, D L (2005), “Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells”, Nature biotechnology, 23(5) [16] Lal, S K., Chowb, V T K (2007), “Avian Influenza H5N1 Virus: An Emerging Global Pandemic, Emerging Viral Diseases of Southeast Asia”, Issues Infect Dis Basel, Karger, 4, pp 59-77 Luận văn thạc sĩ   57 Tài liệu tham khảo    [17] Lee, C.W, Suarez, D L., Tumpey, T M., et al (2005), “Characterization of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from South Korea”, Journal Of Virology, 79(6), pp 3692-3702 [18] Lin, Y J., Deng, M C., Wu, S H., et al (2008), “Baculovirus-Derived Hemagglutinin Vaccine Protects Chickens from Lethal Homologous Virus H5N1 Challenge”, J Vet Med Sci 70(11), pp 1147-1152 [19] Lin, Y J., Liang, W H., Xin, W S., et al (2010), “High-level expression, purification and characterization of codon-optimized recombinant hemagglutinin proteins in mammalian cells” Chinese Medical Journal, 123(8), pp 1073-1077 [20] Liu, J P (2005), “Avian Influenza-A pandemic waiting to happen?”, Microbiol Immunol Infect, 39, pp 4-10 [21] Magalhăes, R J S., Pfeiffer, D U and Otte, J (2010), “Evaluating the control of HPAIV H5N1 in Vietnam: virus transmission within infected flocks reported before and after vaccination”, BMC Veterinary Research, 6(31) [22] Módena, P J L., Macedo, I S and Arruda, E (2007), “H5N1 Avian Influenza Virus: An Overview”, The Brazilian Journal of Infectious Diseases, 11(1), pp 125-133 [23] Mueller, M., Renzullo, S., Brooks, R., et al (2010), “Antigenic Characterization of Recombinant Hemagglutinin Proteins Derived from Different Avian Influenza Virus Subtypes”, PLoS ONE, 5(2) [24] Nguyen, T D., Nguyen, T.V, Vijaykrishna, D., et al (2008), “multiple sublineages of influenza a virus (H5N1), vietnam, 2005−2007”, Emerging Infectious Diseases, 14(4) [25] Nidom, C A., Takano, R., Yamada, S., et al (2010), “Influenza A (H5N1) Viruses from Pigs, Indonesia”, Emerg Infect Dis [26] Nwe, N., He, Q., Damrongwatanapokin, S., et al (2006), “Expression of hemagglutinin protein from the avian influenza virus H5N1 in a Luận văn thạc sĩ   58 Tài liệu tham khảo    baculovirus/insect cell system significantly enhanced by suspension culture” BMC Microbiology, 6, pp 16 [27] Pan, Y S., Wei, H J., Chang, C C., et al (2010), “Construction and Characterization of Insect Cell-Derived Influenza VLP: Cell Binding, Fusion, and EGFP Incorporation”, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010 [28] Peiris, J S M., Jong, M D D., and Guan, Y (2007), “Avian Influenza Virus (H5N1): a Threat to Human Health”, Clinical Microbiology Reviews, 20(2), pp 243–267 [29] Poovorawan, Y (2007), “Molecular Epidemiology of Avian Influenza H5N1 in Thailand” ScienceAsia, 33(1), pp 87-90 [30] Pourmand, N., Diamond, L., Garten, R., et al (2006), “Rapid and Highly Informative Diagnostic Assay for H5N1 Influenza Viruses”, PLoS ONE, 1(1) [31] Qi, X., Li, , Rider, P., et al (2009), “Molecular Characterization of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from Raccoon Dogs in China” PLoS ONE, 4(3) [32] QIAGEN (2005), QIAfilter Plasmid Purification Handbook [33] QIAGEN (2006), QIAprep® Miniprep Handbook [34] QIAGEN (2008), QIAquick® Spin Handbook [35] QIAGEN Influenza A virus Replication Cycle https://www.qiagen.com/geneglobe/pathwayview.aspx?pathwayID =247 [36] Ramirez, K M S., Ellis, T., Bousfield, B., et al (2004), “Reemerging H5N1 Influenza Viruses in Hong Kong in 2002: Are Highly Pathogenic to Ducks”, Journal Of Virology, 78(9), pp 4892–4901 [37] Revell, P A (2007), “Avian Influenza A (H5N1): Pandemic Potential and the Role of the Clinical Microbiology Laboratory”, Labmedicine, 38(12) Luận văn thạc sĩ   59 Tài liệu tham khảo    [38] SDS-Page Gel Electrophoresis http://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/bCourse_Inform ation/4581/techniques/gel_elect/page_protein.html [39] Shoji, Y., Bi, H., Musiychuk, K (2009), “Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza”, Vaccine, 27(7), pp.1087-92 [40] Stevens, J., Blixt, O., Tumpey, T M., Taubenberger, J K., Paulson, J C., Wilson, I A (2006), “Structure and Receptor Specificity of the Hemagglutinin from an H5N1 Influenza Virus”, Science, 312 [41] Torres, M J S., Morton, H., Zhang, B., et al (2003), “Purification and characterisation of functional early pregnancy factor expressed in Sf9 insect cells and in Escherichia coli”, Protein Expression and Purification, 32(2003), pp 276–287 [42] Vijaykrishna, D., Bah, J., Riley, S., et al (2008), “Evolutionary Dynamics and Emergence of Panzootic H5N1 Influenza Viruses”, PLoS Pathogen, 4(9) [43] Wasilenko, J L, Sarmento, L., Spatz, S., Jackwood, M P (2010),” Cell Surface Display of Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Hemagglutinin on the Surface of Pichia pastoris Cells Using a-Agglutinin for Production of Oral Vaccines”, Biotechnol Prog.,20(2) [44] WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev [45] Wise, H M., X, Foeglein, A., Sun, J., et al (2009) “A Complicated Message: Identification of a Novel PB1-Related Protein Translated from Influenza A Virus Segment mRNA”, Journal Of Virology, 83(16), pp 8021-8031 [46] World Health Organization (WHO) (2011), “Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO” Luận văn thạc sĩ   60 Tài liệu tham khảo    [47] Xie , Q M., Ji, J., Du, L Q., et al (2009), “Preparation and immune activity analysis of H5N1 subtype avian influenza virus recombinant protein-based vaccine” Poultry Science, 88, pp 1608–1615 [48] Yen, H L., Aldridgea, J R., Boona, A C M., et al (2008), “Changes in H5N1 influenza virus hemagglutinin receptor binding domain affect systemic spread”, PNAS, 106(1), pp 286-291 Luận văn thạc sĩ   61 ... giải phóng virus khỏi tế bào [7] Thời gian từ virus xâm nhập vào tế bào đến lúc tạo virus trung bình khoảng [6] 1.3 Hệ thống baculovirus /tế bào côn trùng Hệ thống baculovirus /tế bào côn trùng cơng... vào tế bào côn trùng để biểu baculovirus tái tổ hợp Hệ thống Bac-To-Bac thương mại hóa dựa phương pháp [15] Cho đến nay, hệ thống baculovirus /tế bào côn trùng ứng dụng nhằm biểu protein hemagglutinin. .. sinh học protein phức tạp Tuy nhiên, hình thành nhóm đường phức tạp xảy tế bào côn trùng Sau baculovirus xâm nhiễm vào tế bào côn trùng, tế bào thực chép DNA gen biểu protein baculovirus tế bào chết