i ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM THỊ KIM ANH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ ĐẶC TÍNH PHÂN HỦY PHÂN TỬ TÍN HIỆU ‘‘QUORUM SENSING ’’ VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ (Edwardsiella ictaluri) TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Chuyên ngành: VI SINH Mã số chuyên ngành: 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH Tp.Hồ Chí Minh, 2012 Mục lục Luận văn Thạc sĩ HVCH: Phạm Thị Kim Anh iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt viii Danh mục các bảng ix Danh mục các hình vẽ x Danh mục các đồ thị xi MỞ ĐẦU 1 Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic 4 1.1.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới 4 1.1.2 Tình hình nghiên cứu probiotic t ại Việt Nam 6 1.2 Tình hình dịch bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7 1.2.1 Bệnh gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7 1.2.1.1 Lịch sử phát hiện tác nhân gây bệnh 7 1.2.1.2 Đặc điểm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 8 1.2.1.3 Triệu chứng lâm sàng 8 1.2.1.4 Đường lây truyền 10 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn 10 1.2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn 10 1.2.2.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn 10 1.2.3 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra 12 1.2.3.1 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra 12 Mục lục Luận văn Thạc sĩ HVCH: Phạm Thị Kim Anh iv 1.2.3.2 Các nghiên cứu phòng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra 12 1.3 Giới thiệu về probiotic 13 1.3.1 Định nghĩa probiotic 14 1.3.2 Đặc điểm của probiotic 15 1.3.3 Vai trò của Probiotic 15 1.3.4 Cơ chế tác động của probiotic 16 1.3.4.1 Tác động đối kháng 16 1.3.4.2 Cải thiện chất lượng nước 17 1.3.4.3 Tăng cường hệ miễn dịch 18 1.3.4.4 Ảnh hưởng đến sự sinh tr ưởng 19 1.3.4.5 Sự hình thành quần thể trong ruột (Gut colonization) 20 1.4 Cơ chế hoạt đông của hệ thống “ Quorum sensing” ở vi khuẩn gây bệnh . 21 1.4.1 Định nghĩa quá trình “Quorum sensing” 22 1.4.2 Hệ thống “Quorum sensing” của Edwardsiella spp. 22 1.4.3 Sự phân hủy sinh học quá trình “Quorum sensing” của vi khuẩn gây bệnh 23 1.4.3.1 Enzyme AHL lactonase 23 1.4.3.2 Enzyme AHL acylase 24 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điể m nghiên cứu 26 2.2 Địa điểm thu mẫu 26 2.3 Vật liệu nghiên cứu 27 2.3.1 Nguồn vật liệu cho phân lập 27 2.3.2 Chủng vi khuẩn 29 2.3.3 Môi trường và hóa chất 29 2.4 Phương pháp nghiên cứu 30 2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 30 Mục lục Luận văn Thạc sĩ HVCH: Phạm Thị Kim Anh v 2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử AHL (phân tử tín hiệu “Quorum sensing” ở vi khuẩn Edwardsiella ictaluri) 31 2.4.3 Thử khả năng phân hủy phân tử HHL (N-hexanoyl homoserine lactone) của các chủng vi khuẩn phân lập được ở điều kiện in vitro. 32 2.4.3.1 Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein 32 2.4.3.2 Khảo sát đặc tính phân hủy HHL của các chủng vi khuẩn phân lập ở điều ki ện in vitro 33 2.4.4 Khảo sát đặc tính đối kháng với Edwardsiella ictaluri trong điều kiện in vitro 34 2.4.4.1 Phương pháp đường vuông góc (Cross Streak) 34 2.4.4.2 Phương pháp thạch khuếch tán (modified agar well-diffusion method) 35 2.4.4.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (Disc-diffusion method) 36 2.4.4.4 Phương pháp BLIS (Bacteriocin-like inhibitory substance) 36 2.4.5 Thử khả năng gây bệnh cho người và động vật 37 2.4.6 Thử khả năng đối kháng với một số chủng kiểm định 38 2.4.7 Thử nghiệm các đặc tính sinh học in vitro của các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn 38 2.4.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn 38 2.4.7.2 Ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn 38 2.4.7.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự tăng trưởng c ủa vi khuẩn tuyển chọn 39 2.4.7.4 Khả năng chịu pH dạ dày 39 2.4.7.5 Khả năng chịu muối mật 40 Mục lục Luận văn Thạc sĩ HVCH: Phạm Thị Kim Anh vi 2.4.8 Định danh vi khuẩn sử dụng phương pháp truyền thống và giải trình tự gen 16S rRNA 41 2.4.8.1 Định danh vi khuẩn sử dụng phương pháp truyền thống 41 2.4.8.2 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA 47 2.4.9 Thử khả năng tương thích giữa các chủng vi khuẩn đã được chọn . 48 2.5 Xử lý kết quả . 49 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩ n có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu AHL ở vi khuẩn Edwarsiella ictaluri 50 3.1.1 Số lượng dòng vi khuẩn thu được qua các đợt phân lập 50 3.1.2 Biến động giá trị pH của hỗn dịch vi khuẩn trong quá trình phân lập 51 3.1.3 Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn qua quá trình phân lập 52 3.1.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc sau quá trình phân lập 52 3.2 Khả năng phân hủy phân tử HHL bởi các dòng vi khuẩn đã được chọn lọc 53 3.3 Khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri 54 3.3.1 Phương pháp thạch khuếch tán 54 3.3.2 Các phương pháp khác 56 3.4 Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59 3.5 Kết quả thử khả năng đối kháng với một số chủng vi khuẩn kiểm định 61 3.6 Kết quả thử một số đặc tính sinh h ọc in vitro của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 62 3.6.1 Đường cong tăng trưởng 63 3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 64 3.6.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối 65 3.6.4 Ảnh hưởng của pH 65 Mục lục Luận văn Thạc sĩ HVCH: Phạm Thị Kim Anh vii 3.6.5 Khả năng chịu pH dạ dày 66 3.6.6 Khả năng chịu muối mật 68 3.7 Kết quả định danh 71 3.7.1 Định danh bằng hình thái và các phản ứng sinh hóa 71 3.7.2 Định danh bằng sinh học phân tử 74 3.8 Kết quả thử khả năng tương thích lẫn nhau 74 3.9 Bàn luận 74 Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 80 4.2 Kiến ngh ị 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Danh Mục Luận văn Thac sĩ HVCH: Phạm Thị Kim Anh viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHL N- Acyl Homoserine Lactone BA Blood Agar BHI Brain Heart Infusion BHIA Brain Heart Infusion Agar bp base pair CFU Colony Forming Unit COD Chemical Oxygen Demand ctv. Cộng tác viên ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cữu Long EM Effective Microorganism EMB Eosine Methylen Blue Lactase Agar ESC Enteric Septicaemia of Cashfish FAO Food and Agriculture Organization FCR Food Conversion Ratio HHL N- Hexanoyl- L- Homoserine Lactone MIC Minimum Inhibitory Concentration OD Optical Density Probiotic Chế phẩm sinh học hoặc chế phẩm vi sinh TSA Trytone Soya Agar TNHH Trách Nhiệm Hữu Hạn WHO World Health Organization Danh Mục Luận văn Thac sĩ HVCH: Phạm Thị Kim Anh ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số nghiên cứu phân lập vi khuẩn probiotic đối kháng vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản 5 Bảng 1.2. Ảnh hưởng của probiotic lên sự phát triển của ấu trùng cá biển trong điều kiện in vitro 19 Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic lên sự hình thành quần thể và khả năng bám dính trong ruột cá 21 Bảng 2.1. Số lượng mẫu thu được qua bố n đợt 28 Bảng 3.1. Số lượng dòng vi khuẩn thu được sau khi nuôi cấy trong môi trường chứa hỗn hợp phân tử AHL 50 Bảng 3.2. Khả năng phân hủy HHL của những dòng vi khuẩn đã được phân lập 53 Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp thạch khuếch tán 54 Bảng 3.4. Tỉ lệ % mẫu có khuẩn lạ c đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.55 Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng với Edw. ictaluri bởi các dòng vi khuẩn khảo sát bằng bốn phương pháp 57 Bảng 3.6. Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59 Bảng 3.7. Tổng hợp các đặc tính của các chủng vi khuẩn được sàng lọc: khả năng phân hủy HHL, đối kháng Edw. ictaluri và sinh hemolysin 60 Bảng 3.8. Kế t quả kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp đường vuông góc. 62 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra khả năng đối kháng bằng phương pháp thạch khuếch tán 62 Bảng 3.10. Kết quả nhuộm gram 71 Bảng 3.11. Kết quả định danh 4 chủng vi khuẩn gram âm bằng Kit API 20E 72 Bảng 3.12. Kết quả định danh 2 chủng vi khuẩn gram dương bằng Kit API 50 CHL 73 Bảng 3.13. Kết quả định danh bằng sinh học phân tử 74 Bảng 3.14. Thử khả năng tương thích lẫn nhau giữa các chủng vi khuẩn tuyển chọn . 74 Danh Mục Luận văn Thac sĩ HVCH: Phạm Thị Kim Anh x DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ Edwardsiella ictaluri 8 Hình 1.2. Cá bệnh ESC cấp tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng (A), Cá bệnh ESC cấp tính với những đốm xuất huyết màu đỏ ở phần đầu và bụng (B) và Cá bị bệnh ESC mãn tính (C) 9 Hình 1.3. Cá tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A), cá tra bị bệnh mủ ở gan thận với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B) 9 Hình 1.4. Cơ chế phân hủy phân tử AHL của enzyme AHL-lactonase và AHL- acylase 25 Hình 2.1. Dụng cụ thu mẫu nước hình (a), mẫu bùn (b) 27 Sơ đồ 2.1. Qui trình nghiên cứu của đề tài 30 Sơ đồ 2.2. Qui trình phân lập vi khuẩn phân hủy phân t ử AHL 31 Hình 2.2. Các vòng sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện của phân tử HHL 33 Hình 2.3. Phương pháp đường vuông góc 35 Hình 2. 4. Cách làm chết vi khuẩn bằng chloroform 37 Hình 2.5. Thử khả năng tương thích bằng phương pháp thạch khuếch tán 49 Hình 3.1. Hình thái các khuẩn lạc phân lập từ mẫu nước ở cuối chu kỳ 4 (a) và mẫu bùn ở cuối chu kỳ 4 (b) trên môi trường BHIA 53 Hình 3.2. Thử khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn khảo sát bằng phương pháp đường vuông góc (a), thạch khuếch tán (b), đĩa giấy khuếch tán (c), BLIS (d) . 56 Hình 3.3. Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 59 Hình 3.4. Thử khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc 61 Hình 3.5. Kết quả nhuộm gram T1DT101 (a), T1DT103(b), G1DT102(c), G2VL1.2(d), B4TAG19A(e), N4TAG22a1(f) 71 Danh Mục Luận văn Thac sĩ HVCH: Phạm Thị Kim Anh xi DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Biến động giá trị pH của hệ vi sinh từ các mẫu phân lập khác nhau qua bốn chu kỳ 51 Đồ thị 3.2. Biến động mật độ quang của các hỗn hợp vi khuẩn trong các hỗn hợp vi sinh vật từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước và bùn ao nuôi cá tra qua bốn chu kỳ 52 Đồ thị 3.3. Đường cong tăng trưởng chủng T1DT101 (a), T1DT103 (b), G1DT102 (c), G2VL1.2 (d), B4TAG19A (e), N4TAG22a1(f) 63 Đồ thị 3.4. Ảnh hưở ng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 64 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 65 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 66 Đồ thị 3.7. Tỉ l ệ sống (%) của các chủng vi khuẩn khảo sát theo thời gian ở pH3(a), pH2(b) 67 Đồ thị 3.8. Tỉ lệ sống (%) của các chủng vi khuẩn khảo sát theo thời gian ở nồng độ muối mật 0,5% (a), 1% (b), 2% (c) 69 [...]... những đặc tính ưu vi t, làm nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học ứng dụng cho các ao nuôi cá tra nhằm giảm thiểu dịch bệnh gây rủi ro cho người nuôi Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ ĐẶC TÍNH PHÂN HỦY PHÂN TỬ TÍN HIỆU ‘ QUORUM SENSING VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ (Edwardsiella ictaluri) TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon. .. (Pangasianodon hypophthalmus) ” Mục tiêu: Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ nước và bùn đáy ao nuôi cá tra có đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu ‘ Quorum sensing và đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri) trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) HVCH: Phạm Thị Kim Anh 2 Mở đầu Luận văn Thac sĩ Nội dung nghiên cứu Sàng lọc những chủng vi. .. vi khuẩn từ các mẫu hệ tiêu hóa cá tra thịt và cá tra giống; nước và bùn ở đáy các ao nuôi cá tra ở một vài tỉnh thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu Quorum sensing ở Edwardsiella ictaluri và cũng đối kháng với vi khuẩn này Thử khả năng gây bệnh cho người, động vật và khả năng đối kháng với một số chủng kiểm định Khảo sát một số đặc tính sinh học của những chủng vi khuẩn. .. nghiên cứu về các vi khuẩn probiotic có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản (Bảng 1.1) Sàng lọc những HVCH: Phạm Thị Kim Anh 4 Chương 1: Tổng quan tài liệu Luận văn thạc sĩ vi khuẩn có đặc tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh dựa vào phương pháp xác định hoạt tính ức chế in vitro [40], [79], [133] là cách tiếp cận được sử dụng chủ yếu trong vi c phân lập vi khuẩn probiotic... đợi và trở thành công cụ phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh vật gây bệnh Đặc biệt là các vi sinh vật có lợi có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu Quorum sensing của các vi khuẩn gây bệnh và có khả năng làm giảm độc lực của chúng Trong nghiên cứu này, cách tiếp cận của đề tài là phân lập, tuyển chọn những chủng. .. thể giao tiếp với nhau và sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học do chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này Vi c phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm soát vi c biểu hiện gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào Quá trình này gọi là Quorum sensing , cho... một chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn khác ở điều kiện in vitro, không nhất thiết sẽ thể hiện đặc tính đối kháng đó khi có sự hiện diện của vật chủ Bảng 1.1 Một số nghiên cứu phân lập vi khuẩn probiotic đối kháng vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản [150] Động vật thử nghiệm Cá tuyết Đại Tây Dương Cá hồi Đại Tây Dương Loài vi khuẩn probiotic phân lập Carnobacterium divergens Đối kháng vi khuẩn. .. chủng vi khuẩn từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, từ nước và bùn đáy ao nuôi cá tra, có khả năng đối kháng và phân hủy phân tử tín hiệu Quorum sensing của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Đây là cách tiếp cận mới hiện nay về nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản nhằm kiểm soát dịch bệnh do vi khuẩn gây nên Đề tài thành công là kết quả bước đầu chọn ra các dòng vi khuẩn có. .. hoạt tính đối kháng rộng chống lại các vi khuẩn gây bệnh trên cá, nhóm giáp xác và nhuyễn thể trong nghiên cứu in vitro [70] Sau đó, trong một nghiên cứu in vitro, Lategan và ctv (2006) đã tìm thấy sự tạo ra một hợp chất ngoại bào có khả năng ức chế và có đặc tính tương tự như các chất được tiết ra từ chủng A199 Hợp chất ức chế này được xác định là indole 2, 3-benzopyrrole có hoạt tính kháng khuẩn và kháng. .. do nhóm nghiên cứu của Vi n Công Nghệ Sinh Học, Công Nghệ Thực Phẩm và Vi n Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III thực hiện Tiêu chí của đề tài là phân lập các chủng vi khuẩn có đặc tính đối kháng với hai chủng vi khuẩn gây bệnh trên tôm (Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus), đồng thời có khả năng cải thiện môi trường ao nuôi tôm Đề tài đã tuyển chọn được năm chủng vi khuẩn để tạo chế phẩm sinh . sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 65 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 66 Đồ thị 3.7. Tỉ l ệ sống (%) của các chủng vi khuẩn khảo sát. số chủng kiểm định 38 2.4.7 Thử nghiệm các đặc tính sinh học in vitro của các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn 38 2.4.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn tuyển chọn. TỰ NHIÊN PHẠM THỊ KIM ANH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ ĐẶC TÍNH PHÂN HỦY PHÂN TỬ TÍN HIỆU ‘‘QUORUM SENSING ’’ VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ (Edwardsiella