ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2013 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 1. Lê Đình Chắc, Lã Thị Huyền, Lê Quang Huấn (2008) “Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên ung thư phổi, Cyfra21.1”, Tạp chí Sinh học, tập 30 (3), trang 165-168. 2. Lê Đình Chắc, Lê Quang Huấn, Nguyễn Tài Lương (2012) “Cyfra21.1 – chỉ thị đặc hiệu chẩn đoán ung thư phổi”, Tạp chí Sinh học, tập 34 (1) trang 123-126. 3. Lê Đình Chắc, Nguyễn Thị Thủy, Lê Quang Huấn (2011) “Kết quả gây miễn dịch động vật thí nghiệm bằng epitope kháng nguyên Cyfra21-1”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, tập 85 (2) trang 17-19. 4. Lê Đình Chắc, Nguyễn Thị Thu Thủy, Lê Quang Huấn (2010) “Tạo kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên Cyfra21-1”, Tạp chí Y học Việt Nam, tập 372 (2), trang 163-167. 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ung thư phổi (UTP) là một trong những căn bệnh hiểm nghèo do sự tăng sinh không bình thường của tế bào, thường gặp ở nam giới, chủ yếu là lứa tuổi 50-70, đặc biệt là những người đã hoặc đang hút thuốc lá. Đồng thời, UTP cũng là một trong những căn bệnh có tỉ lệ tử vong lớn thường gặp ở người. Th ực tế, trong y học đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để chẩn đoán UTP (sinh thiết phổi, nội soi phổi, thử đờm chọc nước màng phổi, chụp quang tuyến cắt lớp…) và một số phương pháp điều trị UTP (hoá trị liệu, phẫu thuật, xạ trị …). Tuy nhiên, khi phát hiện UTP thì thường đã muộn hoặc quá muộn, vì một số các căn bệnh khác (viêm phế quản, viêm phổi, lao,…) cũng có những triệu chứng tương tự UTP. Do vậy, việc tìm kiếm các phương pháp hữu hiệu có độ chính xác cao để chẩn đoán sớm được UTP đang là vấn đề cần thiết và cấp bách của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Nghiên cứu tế bào ung thư cũng như nguồn gốc và sự phát triển của tế bào ung thư, người ta nhận thấy ung thư có liên quan chặt chẽ vớ i sự xuất hiện hàm lượng các kháng nguyên đặc trưng ung thư trong dịch cơ thể. Điều này đã mở ra hướng nghiên cứu mới trong chẩn đoán, điều trị ung thư trên thế giới và trong nước. Một trong những hướng nghiên cứu đó chính là phương pháp sử dụng các chỉ thị kháng nguyên để xác định, chẩn đoán và định hướng điều trị ung thư nói chung, UTP nói riêng. Trong thực tế , nhiều chỉ thị kháng nguyên được biết đến và có thể sử dụng để phát hiện ung thư (CEA, NES, CA125, CYFRA21-1, HER-2/neu…), trong đó, CYFRA21-1 là một chỉ thị điển hình cho UTP dạng không phải tế bào nhỏ (non small cell lung carcinomar - NSCLC) được đặc trưng bởi sự tăng hàm lượng nhanh chóng của CYFRA21-1 khi tế bào biểu mô phổi tăng sinh bất thường. Vì vậy, nếu phát hiện được sự tăng sinh hàm lượng khác thường của CYFRA21-1 trong dịch cơ thể sẽ góp phần chẩn đoán sớm được UTP. Do đó, việc nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên UTP CYFRA21-1 là một trong những hướng nghiên cứu mới để chẩn đoán sớm và định hướng điều trị kịp thời bệnh UTP dạng NSCLC, góp phần vào những thành tựu đáng kể trong y học và sinh học. Từ những lý do trên, chúng tôi chọn thực hiện đề tài luận án “Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 nhằm phát triển KIT chẩn đoán ung thư phổi”. 2 2. Mục tiêu của đề tài Tạo được kháng thể scFv kháng kháng nguyên CYFRA21-1 biểu lộ trên phage để phát triển KIT chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC. 3. Nội dung nghiên cứu - Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 từ bệnh phẩm UTP. - Thu nhận, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1. - Gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm bằng kháng nguyên tái tổ hợp thu nhận được. - Tạo dòng phage biểu lộ kháng thể scFv kháng CYFRA21-1. - Sàng lọc kháng thể scFv biểu lộ trên phage. - Sử dụng kháng thể tái tổ hợp thu được bước đầu tạo KIT chẩn đoán UTP. 4. Những đóng góp mới của luận án 4.1. Tách dòng thành công đoạn gen mã hoá kháng nguyên UTP CYFRA21-1 và tạo được kháng thể tái tổ hợp kháng kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật phage display. 4.2. Tạo được phage mang gen mã hóa kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên UTP CYFRA21-1. 4.3. Sử dụng kháng thể tái tổ hợp (kháng thể biểu lộ trên phage) để bước đầu tạo bộ được sinh phẩm định lượng kháng nguyên CYFRA21- 1 trong máu toàn phần bằng kỹ thuật Immuno RT-PCR. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ung thư 1.1.1. Nguồn gốc ung thư Ung thư là mộ t thuật ngữ dùng để chỉ hơn 200 loại bệnh khác nhau gây ra bởi sự tăng sinh quá mức của tế bào một cách không bình thường, sự tăng sinh này không tuân theo mọi cơ chế kiểm soát của cơ thể. Đây là kết quả của hàng loạt các biến đổi bất thường trong cơ chế sinh sản của tế bào, thường được bắt đầu bằng những đột biến của gen tiề n ung thư và gen áp chế ung thư. Như vậy, sinh ung thư là quá trình rối loạn tốc độ phân chia tế bào do tổn thương của DNA, do đó ung thư là một bệnh lý về gen. 1.1.2. Đặc điểm của tế bào ung thư Đặc điểm quan trọng nhất của tế bào ung thư là tránh được sự chết theo chương trình, khả năng di căn và không nhạy cảm với các yếu tố 3 chống tăng sinh. Đây là một trong những nguyên nhân mà ung thư trở nên nguy hiểm hơn các bệnh khác. 1.1.3. Ung thư phổi UTP thường được gọi là ung thư biểu mô phế quản. Tuỳ thuộc vào hình dạng tế bào dưới kính hiển vi, UTP được chia làm hai loại chính: UTP tế bào nhỏ (small cell lung carcinoma - SCLC) chiếm khoảng 20%, loại ung thư này lây lan nhanh, thời gian tử vong nhanh và UTP không phải tế bào nhỏ (non small cell lung carcinoma - NSCLC) chiếm khoảng 80%, loại ung thư này lây lan chậm hơn, thời gian t ử vong chậm hơn. 1.2. Kháng nguyên CYFRA21-1 1.2.1. Cytokeratin Cytokeratin là một trong những tổ chức sợi protein của bộ xương tế bào có liên quan đến một số quá trình phân chia tế bào. Trong đó, Cytokeratin19 có quan hệ mật thiết với sự tăng sinh bất thường của tế bào biểu mô phế quản. Bình thường, hàm lượng mảnh Cytokeratin19 xuất hiện với nồng độ thấp, khi có sự bất thường trong quá trình tăng sinh tế bào biểu mô phế quả n, hàm lượng này tăng lên nhanh chóng. 1.2.2. Biểu hiện của Cytokeratin Trong lúc giải phóng từ các tế bào khối u, có thể nhận ra Cytokeratin với một số lượng lớn trong dịch cơ thể gồm máu, nước tiểu, dịch tế bào và dịch màng phổi. Thông thường, trong các cơ thể khỏe mạnh, nồng độ Cytokeratin lưu thông là rất thấp. Nồng độ tăng một cách bất thường trong những người có bệnh ung thư biểu mô. Giá tr ị của việc nhận biết sự thay đổi về hàm lượng của các mảnh Cytokeratin trong dịch cơ thể chính là cơ sở cho việc phát hiện sớm và đánh giá nhanh hiệu quả điều trị đối với các khối u biểu mô ác tính. 1.2.3. Kháng nguyên CYFRA21-1 CYFRA21-1 là một phân đoạn của Cytokeratin19 xuất hiện trong dịch cơ thể với hàm lượng đặc trưng cho tế bào UTP dạng NSCLC. Do đó, kháng nguyên CYFRA21-1 được xem nh ư là một chỉ thị hữu ích cho UTP dạng NSCLC. Về cấu trúc, gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 nằm trên nhiễm sắc thể số 17 có chiều dài khoảng hơn 1000 bp, gen này hoạt động mạnh khi có sự tăng sinh bất thường của tế bào biểu mô phổi. 1.3. Kháng thể 1.3.1. Cấu trúc 4 Về cấu trúc, phân tử kháng thể nhìn giống chữ Y được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide cơ bản, gồm hai chuỗi nặng (H), hai chuỗi nhẹ (L). Có hai loại chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda), do đó hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tử Ig chỉ có thể cùng là κ hoặc cùng là λ. 1.3.2. Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu, thực tiễn hiện nay 1.3.2.1. Kháng thể đơn dòng có ngu ồn gốc từ chuột 1.3.2.2. Kháng thể lai và kháng thể nhân hóa 1.3.2.3. Kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ người 1.3.2.4. Kháng thể đơn chuỗi 1.3.2.5. Kháng thể phage-scFv Kháng thể phage-scFv là một thực khuẩn thể hình sợi mang các mảnh kháng thể ở một đầu của nó, hiện nay thực khuẩn thể được dùng nhiều nhất để biểu lộ kháng thể là M13. Kháng thể phage-scFv được tạo ra nhờ công nghệ phage display. Đây là kháng thể hiệ n nay đang được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học trong và ngoài nước và cũng là kháng thể có nhiều triển vọng trong ứng dụng chẩn đoán và điều trị bệnh. 1.3.3. Các nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 Trên thế giới Kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 được biết đến từ những năm cuối của thế kỷ XX, cho tới nay trên thế giới có rất nhiều các loại kháng thể đặ c hiệu CYFRA21-1 đã được tạo ra. Tuy nhiên, trên thế giới đến nay, một số kháng thể đơn dòng chuột như MABXC42; B974M … đã được thương mại hóa trên thị trường với giá tương đối cao khoảng từ 480 - 1000 USD/1mg để sử dụng trong nghiên cứu và chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC. Điều này đẫ gây ảnh hưởng lớn đến quá trình chẩn đoán và điều trị bệnh. Tại Việt Nam Thực tế cho thấy, nghiên cứu tạo kháng thể kháng CYFRA21-1 trong UTP đang được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học, đây là một trong những hướng nghiên cứu mới đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán và điều trị. Các công trình nghiên cứu của Lê Quang Huấn và cộng sự (2009) cho thấy những ưu điểm của các kháng thể đơn dòng chuột, kháng thể dạng ghép, kháng thể nhân hóa, … đặc hiệu CYFRA21-1. Tuy nhiên, đ ây là vấn đề chưa thực sự được nghiên cứu nhiều ở nước ta. 5 1.4. Công nghệ phage display Công nghệ phage display cho phép tạo và chọn lọc ra các kháng thể, các protein, các peptyde kháng lại hầu hết các kháng nguyên đã biết từ trước đến nay. Đồng thời, kỹ thuật phage display được áp dụng cho việc chọn lọc kháng thể hoàn toàn in vitro, nhằm tạo được kháng thể phage-scFv được sử dụng như các công cụ hữu hiệu dùng trong nghiên cứu, chẩn đoán và tạo thuốc điều trị các căn bệnh hiể m nghèo. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu bệnh phẩm Mẫu huyết thanh, mẫu máu của các bệnh nhân được cung cấp bởi khoa Ung bướu, bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Trung ương Quân đội 108. 2.1.2 Sinh phẩm và hóa chất Sinh phẩm: Các sinh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu đều do các hãng có uy tín trên thế giới (Invitrogen, BioLabs …) cung cấp. Hóa chất: Hóa chất và enzym dùng để thực hiện đề tài được cung cấp bởi các hãng uy tín trên thế giới. 2.1.3. Thiết bị: Thiết bị hiện đại đang được sử dụng tại phòng thí nghiệm trọng điểm Viện Công nghệ Sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.1.4. Phần mềm máy tính Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các phần mềm máy tính trong nghiên cứu sinh học phân tử. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Các phương pháp thao tác với DNA Chủ yếu thực hiện theo Sambrook và cộng s ự (1989), một số phương pháp được tiến hành theo các KIT và hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.2.1.1. Tách chiết RNA từ bệnh phẩm 2.2.1.2. Phản ứng RT-PCR nhân đoạn gen mã hóa cho CYFRA21-1 2.2.1.3. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vecter pCR TM 2.1-TOPO 2.2.1.4. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli 2.2.1.5. Phương pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. Coli 6 2.2.1.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 2.2.1.7. Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose 2.2.1.8. Phương pháp tich sạch DNA 2.2.1.9. Phương pháp cắt, gắn DNA 2.2.1.10. Phương pháp nhân gen bằng PCR 2.2.1.11. Phương pháp xác định trình tự nucleotide 2.2.2. Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp Được sử dụng để biểu hiện gen trong E. coli, điện di protein trên gel polyacrylamide, tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni 2+ … 2.2.3. Các kỹ thuật phage display Được sử dụng để tạo dòng phage biểu lộ kháng thể scFv kháng kháng nguyên CYFRA21-1 với mục đích định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong dịch cơ thể bằng phương pháp phage display immuno real time-PCR và sản xuất kháng thể scFv tự do. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 3.1.1. Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi Mẫu máu của bệnh nhân đã chẩn đoán m ắc bệnh UTP dạng NSCLC do bệnh viện Trung ương Quân đội 108 cung cấp được sử dụng làm nguyên liệu tách chiết RNA tổng số theo KIT tách RNA “S.N.A.P” của hãng Invitrogen. Sau khi tách chiết thành công RNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm thu về, chúng tôi tiến hành nhân bản cDNA đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 bằng kỹ thuật RT-PCR làm cơ sở cho việc nhân bản đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1. 3.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21-1 Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cặp mồi CYFRAF/R được thiế t kế cho đoạn gen mã hóa protein CYFRA21-1 để tiến hành nhân bản cDNA đoạn gen mã hoá CYFRA21-1 từ mRNA có trong RNA tổng số thu được ở trên thông qua phản ứng RT-PCR, làm cơ sở cho việc nhân bản đoạn gen mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 để tiếp tục thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Việc nhân bản cDNA đoạn gen mã hoá CYFRA21-1 được thực hiện theo KIT “RT-PCR one step” của hãng Invitrogen. 7 Sản phẩm phản ứng RT-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.1). Kết quả điện di trên hình 3.1 cho thấy, trên làn chạy thứ nhất xuất hiện một băng sáng đậm, so với thang DNA chuẩn thì băng này có kích thước khoảng trên 400 bp. Kết quả này không mâu thuẫn với tính toán về độ dài của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1. Như vậy, chúng tôi cho rằng đoạn gen cDNA mã hoá cho kháng nguyên CYFRA21-1 đã được nhân bản thành công, làm cơ sở cho việc tách dòng và xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 để thực hiện các nghiên c ứu tiếp theo. 3.1.3. Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 Sau khi nhân bản thành công đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21- 1 bằng phản ứng RT-PCR, để khẳng định kết quả RT-PCR là độ dài của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1, chúng tôi tiến hành tách dòng và xác định trình tự đoạn gen đã được nhân bản, sau đó so sánh với trình tự gen mã hóa CYFRA21-1 đã công bố trong Ngân hàng giữ liệu gen Quốc tế. Quy trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm phản ứng RT-PCR vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen) Sản phẩm phản ứng RT-PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen). Sau đó vector tách dòng sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng TOP10. Sản phẩm biến nạp được kiểm tra gel agarose 1% (Hình 3.2). Sản phẩm RT-PCR ≈ 400 b p 500 bp 250 bp M 1 Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose Làn chạy số 1: Sản phẩm RT-PCR Làn chạy M: Thang DNA marker 1 kb 8 Làn chạy M: Marker DNA 1 kb (Fermentas) Làn chạy số 1, số 2: DNA plasmid chứa đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 Trên ảnh điện di (Hình 3.2) cho thấy, các plasmid chứa đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 trên làn chạy số 1 và số 2 của băng điện di đều tương đối sạch, hàm lượng cao và có kích thước vào khoảng hơn 4,3 kb so với thang DNA chuẩn. Với kích thước của các plasmid chứa đoạn gen CYFRA21-1 ở làn chạy số 1 và số 2 cho thấy các plasmid nói trên có đủ đ iều kiện đảm bảo cho việc thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.4. Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 Việc xác định trình tự gen tách dòng được tiến hành phản ứng bằng KIT “Big Dye Terminator sequencing KIT” (ABI, Mỹ), chạy trên máy ABI PRISM ® 3100-Avant Gentic Analyzer và theo phương pháp của Sanger và cộng sự (1981), (Hình 3.3). AATTCGCCCTTGAAGGATGCTGAAGCCTGGTTCACCAGCCGGACTGAAGAATTGAACCGGGAGGTCGCTGGC 72 N S P L K D A E A W F T S R T E E L N R E V A G CACACGGAGCAGCTCCAGATGAGCAGGTCCGAGGTTACTGACCTGCGGCGCACCCTTCAGGGTCTTGAGATT 144 H T E Q L Q M S R S E V T D L R R T L Q G L E I GAGCTGCAGTCACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGAAGACACACTGGCAGAAACGGAGGCGCGCTTTGGA 216 E L Q S Q L S M K A A L E D T L A E T E A R F G GCCCAGCTGGCGCATATCCAGGCGCTGATCAGCGGTATTGAAGCCCAGCTGGGCGATGTGCGAGCTGATAGT 288 A Q L A H I Q A L I S G I E A Q L G D V R A D S GAGCGGCAGAATCAGGAGTACCAGCGGCTCATGGACATCAAGTCGCGGCTGGAGCAGGAGATTGCCACCTAC 360 E R Q N Q E Y Q R L M D I K S R L E Q E I A T Y CGCAGCCTGCTCGAGGGACAGGAAGATCACTACAACAATTTGTCTGCCTCCAAGGTCCTCTGAGGCAGCAGG 423 R S L L E G Q E D H Y N N L S A S K V L * Hình 3.3. Trình tự nucleotide của đoạn gen cDNA và amino acid suy diễn mã hóa CYFRA21-1 Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách dòng đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 1 kb 2 kb 4 kb M 1 2 4,3 kb [...]... có khả năng liên kết đặc hiệu với epitope của kháng nguyên CYFRA21-1 ở cả 2 dạng: tái tổ hợp và tự nhiên 5 Bước đầu tạo được KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật Real time PCR trong dịch cơ thể làm tiền đề cho việc phát triển KIT chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC KIẾN NGHỊ 1 Hoàn thiện bộ KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong dịch cơ thể, thiết lập quy trình chẩn đoán UTP dạng NSCLC 2... biểu lộ scFv của kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 2 Gắn kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 lên các giếng khay thử 3 Bổ sung các phage biểu lộ scFv đặc hiệu CYFRA21-1 để tạo phức hợp kháng thể -kháng nguyên- scFv trên phage 4 Thủy giải các DNA-phage để làm khuôn để định lượng bằng real-time PCR Để tiến hành phân tích định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong các mẫu mà chúng tôi thu về, trong nghiên cứu này, chúng... thanh người bình thư ng 3: Giếng phủ PBS Kết quả ELISA trên hình 3.17 có thể khẳng định, kháng thể phage mà chúng tôi nhận được có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên CYFRA21-1 trong tự nhiên 3.5 Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu được để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong ung thư phổi được thực hiện gồm: 1 Tạo các phage biểu... nhận kháng thể phage đặc hiệu có khả năng nhận biết và gắn kết với quyết định kháng nguyên, cần tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA 3.4.4 Kết quả chọn dòng kháng thể phage - scFv đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 Để thu được kháng thể từ thư viện phage-scFv gắn đặc hiệu với kháng nguyên CYFRA21-1, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ELISA tiến hành sàng lọc 4 vòng để xác định ái lực riêng của từng dòng với kháng. .. BL21/pET-21a(+) /Cyfra21-1 có khả năng sinh tổng hợp protein CYFRA21-1, đã tinh sạch được protein nói trênvà khẳng định bằng phân tích khối phổ 3 Gây miễn dịch thành công ở gà bằng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 là cơ sở cho việc tạo kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 vận dụng vào việc xây dựng KIT định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong dịch cơ thể 4 Đã thu nhận được dòng phage biểu hiện kháng thể. .. tiến hành nhân bản đoạn gen mã hóa kháng thể của gà kháng CYFRA21-1 16 3.4.2 Nhân bản đoạn gen mã hóa vùng biến đổi của kháng thể gà đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1 Kết quả nhân bản các đoạn gen cDNA mã hoá vùng biến đổi của kháng thể gà đặc hiệu epitope kháng nguyên tái tổ hợp CYFRA21-1 bằng kỹ thuật RT-PCR được trình bày trên hình 3.13 M 1 2 500 bp 250 bp Sản phẩm RT-PCR Hình 3.13 Hình ảnh điện... xác định ái lực riêng của từng dòng với kháng nguyên CYFRA21-1 Kết quả sàng lọc một số dòng tế bào biểu lộ kháng thể phage được trình bày trên hình 3.15 và bảng 3.4 18 Bảng 3.4 Kết quả sàng lọc để lựa chọn các dòng biểu lộ kháng thể đặc hiệu quyết định kháng nguyên CYFRA21-1 Các dòng biểu Các dòng biểu OD (450-650) OD (450-650) hiện kháng thể hiện kháng thể Clone1 0.073 Clone13 0.078 Clone2 0.065 Clone14... scFv kháng thể đặc hiệu epitope kháng nguyên Cyfra 21-1 Để kiểm tra khả năng nhận biết và liên kết với kháng nguyên tự nhiên của dòng phage số 10, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên mẫu huyết thanh của bệnh nhân đã được chẩn đoán là ung thư phổi Kết quả bằng kỹ thuật ELISA được thể hiện trên hình 3.17 20 Hình 3.17 Kết quả đánh giá liên kết của dòng phage 10 với huyết thanh UTP và huyết thanh bình thư ng... thư c khoảng 250 bp Kích thư c này phù hợp với tính toán về đoạn gen chứa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 Như vậy, chúng tôi cho rằng đoạn gen mã hóa cho vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 đã được nhân bản thành công với cặp mồi ExpcyF/R 3.2.2 Tách dòng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 Quá trình chọn dòng đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên CYFRA21-1 được tiến hành... peptide) được nhận diện trùng lặp hoàn toàn với tính toán lý thuyết Như vậy, sản phẩm gen tái tổ hợp được biểu hiện và tinh sạch chính là epitope kháng nguyên CYFRA21-1 14 3.3 Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CYFRA21-1 Quy trình gây miễn dịch ở gà được tiến hành theo phương pháp của Nader S và William A.F., (1998) với kháng nguyên tái tổ hợp CYFRA21-1 Kết quả được trình bày trên bảng 3.2, hình 3.11; . luận án Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 nhằm phát triển KIT chẩn đoán ung thư phổi . 2 2. Mục tiêu của đề tài Tạo được kháng thể scFv kháng kháng nguyên. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI . thể tái tổ hợp kháng kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật phage display. 4.2. Tạo được phage mang gen mã hóa kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên UTP CYFRA21-1. 4.3. Sử dụng kháng thể