1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nghiên cứu chất tính chống chịu trồng cho thấy tính trạng đa gen Vai trị cụ thể gen riêng rẽ liên quan đến tính chống chịu thực vật (ví dụ P5CS, RD22…) nhiều nghiên cứu tìm hiểu phân tích Dưới tác động yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, không gen riêng rẽ biểu mà hệ thống gen liên quan kích hoạt biểu nhằm đáp ứng với tình trạng bất lợi mà thực vật gặp phải Một số yếu tố kích hoạt hoạt động gen liên quan đến khả chống chịu nhân tố phiên mã (transcription factor – TF) Họ nhân tố phiên mã NAC (NAC transcription factor) họ TF đặc trưng lớn hệ gen thực vật NAC TF có liên quan đến nhiều q trình sinh lý quan trọng thể thực vật Nhiều gen NAC tham gia vào phản ứng với áp lực khác từ mơi trường có hạn hán … Nhiều tác giả nghiên cứu chuyển gen mã hóa NAC TF thành cơng vào số lồi trồng như: lúa, lúa mỳ, thuốc lá…Ở lạc, gen AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn tách dịng thành cơng, AhNAC2 sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc chịu hạn chuyển thành công vào Arabidopsis Lạc nông nghiệp ngắn ngày trồng phổ biến giới Ở nước ta, lạc trồng khắp miền phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác Cây lạc họ đậu, thuộc nhóm chịu hạn Vì vậy, cải thiện khả chống chịu mở rộng diện tích canh tác nâng cao suất trồng Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả chịu hạn lai giống ứng dụng công nghệ tế bào thực vật áp dụng Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo giống lạc có khả chịu khơ hạn cịn chưa nghiên cứu nhiều Từ lí trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L.)” nhằm thử nghiệm khả chuyển gen thị tiến tới chuyển gen chịu hạn để tạo dòng chuyển gen phục vụ chọn giống chịu hạn lạc Ứng dụng thực tiễn nghiên cứu nhằm cải tạo lạc phá vỡ hạn chế khả chống chịu đối tượng trồng Mục tiêu nghiên cứu (1) Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt (2) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 Tạo chuyển gen biểu protein NAC2 thuốc (3) Tạo dòng lạc chuyển gen Phân tích dịng lạc chuyển gen Nội dung nghiên cứu (1) Phân nhóm giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh giá khả chịu hạn giai đoạn mô sẹo non (2) Phân lập, tách dịng giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 liên quan đến tính chịu hạn lạc (3) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2, tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp chuyển vào thuốc mơ hình (4) Xác định có mặt gen chuyển NAC2 thuốc lá, đánh giá khả chịu hạn dịng thuốc chuyển gen thơng qua thay đổi hàm lượng proline Phân tích biểu protein tái tổ hợp NAC2 thuốc chuyển gen (5) Phát triển hệ thống tái sinh lạc chuyển gen thị (GUS) qua mô sẹo phôi soma (6) Chuyển cấu trúc gen NAC2 vào lạc, phân tích dịng lạc chuyển gen Những đóng góp luận án i) Tách dịng thành cơng gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt L12 ii) Thiết kế thành công vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 chuyển vào thuốc lá, kết biểu protein chuyển gen chứng minh cấu trúc thiết kế hoạt động tốt thuốc iii) Thông qua hệ thống tái sinh xây dựng, giống lạc LVT thử nghiệm chuyển gen GUS chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 Biểu GUS thu phơi soma lạc hồn chỉnh Thu dòng lạc hệ T0 mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 qua kiểm tra ban đầu với phản ứng PCR iv) Luận án tối ưu hồn thiện quy trình chuyển gen hồn chỉnh thơng qua mơ sẹo phơi soma lạc nhằm phục vụ tạo lạc chuyển gen theo mục đích cải thiện khả chống chịu với tình trạng thiếu nước từ mơi trường Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học i) Kết nghiên cứu luận án cung cấp dẫn liệu khoa học ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm phục vụ việc cải thiện tính chịu hạn lạc ii) Cung cấp thông tin nhân tố phiên mã NAC gen NAC2 lạc Khả chịu hạn giống lạc nghiên cứu vai trò gen NAC2 đáp ứng với thiếu nước từ môi trường 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đánh giá khả chịu hạn lạc mức độ mô sẹo non sử dụng làm sở để đánh giá ứng dụng biện pháp cải thiện khả chịu hạn lạc Kết thu ban đầu lạc chuyển gen làm để đánh giá mức độ nhằm phục vụ nghiên cứu cải thiện tính chịu hạn lạc Cấu trúc luận án Luận án gồm 103 trang (kể tài liệu tham khảo), chia thành phần: Mở đầu gồm trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 40 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp, 15 trang; Chương 3: Kết thảo luận, 47 trang; Kết luận đề nghị: trang; Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án: trang; Tài liệu tham khảo: 14 trang với 134 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh Luận án có 25 bảng số liệu, 36 hình Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 17 tài liệu nước, 117 tài liệu nước với nội dung liên quan, bao gồm: (1) Hạn tác động hạn đến thực vật; (2) Các nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn thực vật; (3) Nâng cao khả chịu hạn trồng kỹ thuật chuyển gen Với dẫn liệu thu thập được, kết phân tích khẳng định, lạc nông nghiệp ngắn ngày trồng phổ biến giới Xu biến đổi chung khí hậu làm cho hạn hán bất thường xảy nhiều nơi, nguyên nhân làm giảm suất trồng có lạc Những hiểu biết chế chịu hạn giúp hiểu rõ đặc tính chống chịu thực vật lạc để làm sở nghiên cứu khả đáp ứng với tình trạng thiếu nước từ môi trường Cơ chế chịu hạn thực vật phức tạp, khơng liên quan đến đặc điểm hình thái giải phẫu mà liên quan đến thay đổi thành phần hoá sinh tế bào, điều chỉnh hoạt động gen liên quan đến tính chịu hạn thực vật Thành công kỹ thuật chuyển gen cơng bố nhiều lồi trồng nhiều đặc tính liên quan đến khả chịu hạn thực vật cải thiện Hiện có hai xu hướng tìm kiếm gen liên quan đến tính chống chịu trồng điều kiện sinh thái phi sinh học bất lợi Hướng thứ tìm gen liên quan trực tiếp đến khả chịu hạn, chịu lạnh, ngập úng hay phèn mặn Hướng thứ hai nghiên cứu gen chống chịu theo hướng yếu tố điều khiển ví dụ transcription factor (TF) nhằm tiếp cận cách điều hòa tổng thể thực vật gặp điều kiện bất lợi Họ NAC họ TF đặc trưng lớn hệ gen thực vật Nhân tố phiên mã NAC có liên quan chức với nhiều trình khác thể thực vật, q trình phát triển, q trình lão hóa, đáp ứng stress sinh học phi sinh học Nhiều nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tạo dòng phân lập gen liên quan đến hạn hán họ NAC TF như: ANAC019, ANAC055, ANAC072 từ Arabidopsis, BnNAC từ cải bắp, AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3, AhWSI 153, AhWSI 308 từ lạc, GmNAC2, GmNAC3 GmNAC4 đậu tương, ONAC045, SNAC1 lúa, TaNAC2, TaNAC4, TaNAC8 lúa mì… Sau phân lập, gen thiết kế với promoter mạnh, đặc hiệu (CaMV35S promoter, rd29A promoter,…) chuyển thành công vào số loài thực vật nhờ kỹ thuật chuyển gen Một số nghiên cứu công bố thu trồng chuyển gen thành cơng có khả tăng cường chống chịu điều kiện thiếu nước môi trường như: A.thaliana, thuốc , lúa …Các kết thu chứng minh việc tăng khả chống chịu tốt với điều kiện bất lợi từ môi trường nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, nhiệt độ cao, khơ hạn, từ cải thiện sinh trưởng phát triển Đây để chúng tơi tìm hiểu phân tích gen NAC2 lạc Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vậ iệ hực vật Luận án sử dụng hạt 10 giống lạc có khả chịu hạn khác Trung tâm Nghiên cứu Phát triển đậu đỗ - Viện Cây lương thực Cây thực phẩm cung cấp 2.2 Hóa chất thiết bị Các loại hố chất tinh khiết thơng dụng có nguồn gốc từ hãng có uy tín như: Taq-polymerase, buffer PCR, primer đặc hiệu hàng Invitrogen, EDTA, SDS, Tris…Vector tách dòng, kit gel tách plasmid, loại enzyme hạn chế Fermentas Các chất kích thích sinh trưởng hãng Sigma… 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp sinh ý, hố sinh Đánh giá nhanh tính chịu hạn phương pháp thổi khô mô sẹo theo Lê Trần Bình đtg (1998) Đánh giá nhanh khả chịu hạn giai đoạn non theo Lê Trần Bình đtg (1998) Định lượng proline phương pháp Bates đtg (1973) 2.3.2 Các phƣơng pháp sử dụng ni cấy in vitro Tạo dịng thuốc lạc kỹ thuật nuôi cấy in vitro Giống thuốc C91 cung cấp từ phịng Cơng nghệ tế bào thực vật với phát triển 3-4 thật sử dụng để tiến hành thí nghiệm phục vụ cho chuyển gen: tái sinh đa chồi chuyển gen, tạo hoàn chỉnh Phương pháp tái sinh lạc qua mơ sẹo hóa phôi soma tiến hành dựa phương pháp số tác giả công bố Tạo mô sẹo tối 10 ngày, tạo phôi soma tuần, tái sinh tạo hoàn chỉnh Phương pháp chuyển gen thông qua mô sẹo tiến hành dựa nghiên cứu số tác giả 2.3.3 Phƣơng pháp sinh học phân tử Nghiên cứu thông tin gen thiết kế cặp mồi nhân gen: Các bước thao tác: i) thu thập trình tự nucleotit từ ngân hàng gen NCBI; ii) thiết kế cặp mồi; iii) Kiểm tra chất lượng cặp mồi PCR Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp Gawell đtg Tách chiết RNA tổng số Trizon cDNA tổng hợp theo quy trình RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit Phân lập gen kỹ thuật PCR, RT-PCR Tách dòng gen theo phương pháp Sambrook đtg (2001) Xác định trình tự gen máy phân tích trình tự tự động theo phương pháp Sanger Thiết kế cấu trúc chuyển gen: phản ứng cắt, ghép nối tạo vector, tạo vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào A.tumefacien phương pháp xung điện Phân tích biểu gen GUS nhuộm hóa mơ tế bào theo phương pháp nhuộm Jefferson đtg (1987) Đánh giá có mặt protein gen chuyển tạo kỹ thuật lai Western theo phương pháp Sambrook đtg (2001) 2.3.4 Phƣơng pháp ính oán xử lý số liệu Các số liệu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học máy vi tính phần mềm Excel Phân tích gen phần mềm BioEdit DNAstar 2.4 Địa điểm nghiên cứu Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen – Viện Công nghệ Sinh học Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả chịu hạn giống nghiên cứu 3.1.1 Đánh giá khả chịu thổi khô giai đoạn mô sẹo Thổi khô mô sẹo sử dụng biện pháp kĩ thuật để đánh giá tác động nước đến khả chịu khơ hạn, chịu nóng tế bào thực vật Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo giống lúa, giống lạc, nhiều cơng trình nghiên cứu tác giả chọn lọc dịng mơ có khả chịu nhiệt độ cao, chịu tượng khô nước sau bị xử lý điều kiện nuôi cấy 3.1.1.1 Khả tạo mô sẹo giống nghiên cứu Khả tạo mô sẹo thông số phản ánh khả thích ứng mơ với mơi trường nghiên cứu nhằm sử dụng cho thí nghiệm sau việc đánh giá khả chịu hạn giống lạc Chúng sử dụng nguồn mẫu ban đầu từ phơi trục hạt lạc mơi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng 2,4D Kết nghiên cứu cho thấy, tất giống lạc nghiên cứu có khả tạo mơ sẹo Khả tạo mơ sẹo cao quan sát thấy giống L12 L16 (100%), thấp giống LVT (69,56 %) Nguồn mô sẹo thu nhận sử dụng thí nghiệm đánh giá khả chịu hạn giống lạc giai đoạn 3.1.1.2 Khả giữ nước mô sẹo giống nghiên cứu Để xác định độ nước mô sẹo tiến hành xử lí thổi khơ khối mơ sẹo chia tách mô sẹo với tỷ lệ khác (1/2, 1/4, 1/8) luồng khí vơ trùng box cấy Tiến hành thổi khô 3h, 6h, h liên tục, xác định độ nước mô sẹo Kết thí nghiệm cho thấy, độ nước mơ sẹo giống lạc sau xử lý thổi khô thay đổi khác tùy vào giống Tốc độ nước nhanh quan sát thấy sau 3h thổi khô Lượng nước mô sẹo giảm nhanh tất giống Tốc độ nước sau 3h thổi khô để nguyên khối mô sẹo so với mơ sẹo thổi khơ chia tách Trong LVT giống có độ nước cao giống có độ nước thấp L12 sau 3h thổi khô Lượng nước tiếp tục giảm sau 6h thổi khô so với trọng lượng mô sẹo tươi ban đầu 10 3.1.1.3 Tỷ lệ sống sót mơ sẹo giống nghiên cứu Khả giữ nước mô sẹo giống nghiên cứu sau xử lý thổi khô ảnh hưởng đến tỷ lệ sống sót mơ sẹo Từ kết xử lý nước mô sẹo cho thấy, tỷ lệ sống sót mơ sẹo tỷ lệ nghịch với thời gian xử lý thổi khơ Trong L12 giống có tỷ lệ sống sót mơ sẹo lớn hầu hết ngưỡng xử lý (100%, 100%, 89,99%, tương ứng với thời gian thổi khơ 3, 6, 9h) TB25 giống có tỷ lệ sống sót thấp nhất, ngưỡng 9h cịn 40,63% Tỷ lệ sống sót cao quan sát thấy khối mô sẹo chia tách 1/2 Khả phục hồi thấp quan sát thấy khối mô sẹo chia tách 1/4 1/8 Tỷ lệ sống sót thấp 12,50% giống TB25 sau 9h thổi khô (chia tách 1/4) 12,00% giống LVT sau 9h thổi khô (chia tách 1/8) 3.1.2 Đánh giá khả chịu hạn giai đoạn non Tỷ lệ héo, tỷ lệ phục hồi sau hạn nhân tạo Kết thu sau xử lý hạn nhân tạo giai đoạn non cách ngừng tưới nước thời điểm khác q trình thí nghiệm cho thấy, tỷ lệ không héo giảm dần theo thời điểm gây hạn Tỷ lệ phục hồi giảm dần theo thời điểm gây hạn Ở thời điểm hạn ngày đa số giống phục hồi toàn bộ, có giống L08, L15, LVT, TB25 tỷ lệ giảm Khả phục hồi thấp quan sát thấy giống TB25 (55,24%) Sau ngày gây hạn giống có khả phục hồi cao L12 (73,34%) thấp LVT (18,18%) Tỷ lệ phục hồi thấp sau ngày gây hạn, phần héo phục hồi chiếm ưu thế, xanh trở lại Tỷ lệ phục hồi thấp quan sát thấy giống TB25 (2,94%) Giống L12 có khả phục hồi cao (30,38%) 13 Từ kết colony-PCR, lựa chọn dịng khuẩn lạc (1, 2, 3) đem ni l ng để tách chiết plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự 3.2.3 Xác định trình tự gen NAC2 Bảng 3.6 Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen NAC2 so với gen AhNAC2 STT Vị trí AhNAC2 NAC2 195 T C 232 A G 249 A T 264 A G 288 A G 291 T C 297 A G 343 G A 1044 G A Khi chúng tơi tiến hành so sánh trình tự amino acid gen NAC2 với nhân tố phiên mã NAC khác, nhận thấy vị trí amino acid thay đổi 115 gen NAC2 so với gen AhNAC2 lại tương đồng hồn tồn với trình tự amino acid cịn lại họ gen NAC đối tượng thực vật Do chúng tơi kết luận trình tự gen NAC2 thu từ giống lạc L12 có vị trí amino acid thứ 78 thay đổi sau so sánh vùng bảo thủ với trình tự amino acid họ ngân hàng gen quốc tế (Hình 3.9) Khi nghiên cứu trình tự amino acid gen NAC2 thu được, nhận thấy v ng bảo thủ NAC, có khoảng 160 amino acid từ đầu N tương tự gen họ So sánh vùng bảo thủ NAC gen NAC2 vài gen họ NAC thu phân vùng bảo thủ từ A đến E khung đen vùng NAC (hình 3.9) 14 Hình 3.9 Kết phân tích trình tự amino acid suy diễn gen họ NAC phần mềm Clustal W (A – E: phân vùng bảo thủ thuộc vùng NAC) 15 3.2.4 Xây dựng phát sinh chủng loại dựa vào v ng ảo hủ Dựa vào phân nhóm protein thuộc họ NAC đề cập nghiên cứu công bố Chúng tiến hành phân tích so sánh v ng NAC gen NAC2 thu với v ng NAC gen thuộc họ NAC Kết phân tích trình tự tương đồng v ng bảo thủ NAC số lồi thực vật cho thấy, trình tự amino acid suy diễn gen thuộc họ có mức độ tương đồng cao amino acid Khi so sánh với gen AhNAC2 mã số EU755023, nhận thấy gen NAC2 có trình tự tương đồng cao với AhNAC2 gần gũi với GmNAC4 đậu tương Gen NAC2 có đầy đủ vị trí amino acid bảo thủ giống gen họ NAC có v ng NAC nên kết luận gen NAC2 thu thuộc họ gen NAC 3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 chuyển vào thuốc 3.3.1 Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 Dựa trình tự gen AhNAC2 cơng bố ngân hàng gen (No EU755023) thiết kế cặp mồi nhân gen NAC2 giống lạc chịu hạn tốt L12 mang điểm cắt enzyme NcoI/NotI XbaI/SacI Điểm cắt NcoI/NotI sử dụng vector pRTRA7/3, điểm cắt XbaI/SacI sử dụng vector pBI121 Tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3:NAC2 Sau phản ứng ghép nối, vector tái tổ hợp pRTRA7/3:NAC2 kiểm tra phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2NcoI/NAC2NotI phản ứng cắt enzyme NcoI/NotI Hình ảnh điện di sản phẩm cắt hình 3.12-A cho thấy kết 16 thu hai phân đoạn gen có kích thước khoảng 1,1kb 3,5kb, tương ứng với kích thước gen NAC2 (nối thêm đoạn cmyc KDEL) vector pRTRA7/3 Chúng đồng thời thực phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2NcoI/NAC2NotI, kết hình 3.12-B cho thấy, sản phẩm thu phân đoạn gen có kích thước tương ứng với tính tốn theo lý thuyết (1,1kp) A B Hình 3.12 Kết điện di gel agarose 1% (từ vector pTRA7/3:NAC2) A Kết điện di sản phẩm phản ứng cắt vector pRTRA7/3:NAC2 (NotI/NcoI); B Kết điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2NcoI/NAC2NotI từ vector pTRA7/3:NAC2 Tạo vector tái tổ hợp pBI121:NAC2 Để thực trình ghép nối đoạn gen NAC2/c-myc/KDEL từ vector pRTRA7/3 vào vector pBI121 sử dụng cặp mồi NAC2XbaI/NAC2SacI để nhân đoạn gen NAC2/c-myc/KDEL từ vector pRTRA7/3 Sau phản ứng ghép nối, kiểm tra vector tái tổ hợp phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho băng có kích thước 17 khoảng 1,1kb (Hình 3.15-A) Sản phẩm cắt vector XbaI/SacI thu phân đoạn gen khoảng 1,1 11,2kb phù hợp với kích thước tính tốn theo lý thuyết gen NAC2 vector pBI121 (Hình 3.15-B) Như cấu trúc gen NAC2 thiết kế thành công vào vector pBI121 sử dụng chuyển gen thực vật A B H nh 3.15 Kết điện di gel agarose 1% (colony - PCR từ vector pBI121: NAC2 cắt enzyme XbaI/SacI) A Kết điện di sản phẩm colony - PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI từ vector pBI121:NAC2; B Kết điện di sản phẩm cắt vector pBI121:NAC2 XbaI SacI 3.3.2 Tạo thuốc chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 Biến nạp vector pBI121:NAC2 vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens chủng CV58 x ng điện Để kiểm tra hoạt động cấu trúc thiết kế trồng tạo nguyên liệu chuẩn bị cho trình chuyển gen tạo trồng chịu hạn, cấu trúc pBI121:NAC2 biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens chủng CV58 phương pháp xung điện Thực 18 phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI Kết điện di sản phẩm PCR gel thể hình 3.17 cho thấy, dịng khuẩn lạc cho kết dương tính với kích thước tính tốn (khoảng 1,1kb) Điều chứng t biến nạp vector pBI121:NAC2 vào tế bào A.tumefaciens chủng CV58 thành công đạt hiệu cao H nh 3.17 Sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2-XbaI/NAC2-SacI dòng plasmid tách từ Agrobacterium Chuyển cấu trúc gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens CV58 Các dòng thuốc chuyển gen sau khoảng thời gian định sống sót ngồi tự nhiên kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI Kết cho thấy, số dòng thuốc sàng lọc ngẫu nhiên sau kiểm tra cho phản ứng dương tính, giếng điện di xuất băng DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 1,1kb 3.3.3 Đánh giá dòng h ốc chuyển gen mang nhân tố phiên mã NAC2 Các dòng thuốc chuyển gen sau sàng lọc cho kết dương tính với phản ứng PCR chúng tơi tiến hành thí nghiệm gây hạn nhân tạo cách ngừng tưới nước Hàm lượng amino acid 19 proline tiêu phân tích đánh giá thuốc chuyển gen Khi gặp điều kiện khô hạn, proline tổng hợp tăng tế bào Quan sát mặt hình thái trình xử lý hạn cho thấy, sau ngày điều kiện thiếu nước, dòng thuốc chuyển gen sinh trưởng bình thường thuốc khơng chuyển gen bắt đầu có tượng h o Hàm lượng proline dòng chuyển gen tăng so với trước hạn tăng so với đối chứng Đánh giá có mặt protein gen chuyển tạo Nhằm đánh giá trồng sau chuyển gen, tiến hành kỹ thuật lai Western với mong muốn kiểm tra có mặt protein gen chuyển tạo Trước hết protein toàn phần tách chiết từ mẫu thuốc chuyển gen, điện di gel polyacrylamid, thấm truyền lên màng nitrocellulose lai với kháng thể Quá trình hiển thị sản phẩm lai thực thông qua phản ứng tạo màu với phosphatase kiềm Hình 3.21 Phân tích Western blot dịng thuốc chuyển gen M Marker chuẩn, kDa; +: ĐC dương; -: ĐC âm N19, N36, N85, N106, N112, N129: dịng thuốc chuyển gen 20 Gen NAC2/c-myc/KDEL có kích thước khoảng 1,1kb, sau dịch mã, phân tử protein có kích thước tính tốn theo lý thuyết khoảng 39 kDa Kết lai Western cho thấy, dòng thuốc chuyển gen N19 N106 xuất tín hiệu lai có khối lượng phân tử vào khoảng 39 kDa, cịn dịng khơng chuyển gen khơng thấy có tín hiệu lai (Hình 3.21) Kết thí nghiệm khẳng định, protein gen NAC2 mã hóa biểu số dòng thuốc chuyển gen cấu trúc thiết kế hoạt động tốt thuốc 3.4 Tạo dòng lạc chuyển gen mang gen mã hóa NAC2 3.4.1 Hệ thống tái sinh lạc Sau tuần nuôi tối, phôi trục cảm ứng tạo thành khối mơ sẹo có kích thước khoảng 3x3x3 mm, màu vàng xanh, không nhớt trắng xốp Sau tuần ni ngồi sáng khối mơ sẹo màu vàng, khơng nhớt có khả tạo cụm phôi soma Kết tái sinh từ cụm phôi soma cho thấy, bổ sung BAP 2mg l vào môi trường SIM, tỷ lệ mẫu tạo chồi số chồi trung bình thu cao ba giống lạc sau tuần nuôi cấy Trong nồng độ nghiên cứu lựa chọn IBA 0,3 mg/l nồng độ thích hợp cho việc tạo rễ lạc Giá thể (1 đất:1 trấu hun:1 cát vàng) làm nguyên liệu đưa lạc in vitro tự nhiên Sau hai tuần chuyển đất 3.4.2 Chuyển gen thị GUS thông qua vi khuẩn A.tumefaciens Hiệu suất trình chuyển gen không phụ thuộc vào hệ thống tái sinh mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố, có đặc điểm di truyền giống Một số nghiên cứu chuyển gen thành công vào lạc thông qua mô sẹo phôi công bố Chúng lựa chọn giống lạc LVT để tiến hành thí nghiệm chuyển gen thị 21 GUS Các mẫu thí nghiệm chuyển gen GUS có màu xanh chàm từ chất không màu X-gluc Các mẫu phôi soma sau tuần nuôi cấy kiểm tra biểu gen GUS tạm thời phương pháp nhuộm màu với chất X-Gluc (Hình 3.23-A) Sau tuần mơi trường tạo đa chồi SIM1 không chứa chất chọn lọc, cụm chồi chuyển sang môi trường SIM2 chứa BAP với nồng độ 2mg/l Tỷ lệ mẫu sống sót sau tuần môi trường chứa chất chọn lọc thống kê 146 chồi Những cụm chồi sống sót chuyển sang môi trường rễ tiếp tục chọn lọc Cây lạc hoàn chỉnh nhuộm màu với chất X-Gluc Biểu gen GUS lạc chuyển gen mơ tả hình 3.23 – B A B Hình 3.23 Biểu gen GUS phơi soma lạc A Biểu gen GUS phôi soma chuyển gen; B Biểu gen GUS lạc chuyển gen Từ kết trên, chúng tơi trình bày quy trình hồn chỉnh cho việc tái sinh phục vụ chuyển gen lạc qua mơ sẹo hóa phơi soma hình 3.24 22 Hình 3.24 Sơ đồ hồn chỉnh quy trình chuyển gen lạc qua mô sẹo phôi soma 3.4.3 Chuyển cấu trúc gen chịu hạn mang nhân tố phiên mã NAC2 lạc Từ kết nghiên cứu chuyển cấu trúc gen chịu hạn thuốc lá, chuyển gen thị GUS lạc, tiến hành chuyển cấu trúc gen chịu hạn mang nhân tố phiên mã NAC2 vào mô sẹo giống lạc LVT thơng qua vi khuẩn A tumefaciens theo quy trình tối ưu Quá trình chuyển gen tiến hành lơ thí nghiệm với tổng số 935 mẫu sử dụng cho chuyển gen, có 595 mẫu tạo phơi 23 soma, 1416 chồi hình thành, q trình chọn lọc kháng sinh có 189 sống sót giá thể trồng nhà lưới Hình 3.26 Hình ảnh chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 qua A tumefaciens hệ thống tái sinh phôi soma A Đồng nuôi cấy với vi khuẩn A tumefaciens; B Phôi soma chuyển gen sau tuần; C Cụm chồi từ phôi soma chuyển gen môi trường chọn lọc; D Chồi chuyển gen môi trường chọn lọc; E Cây lạc chuyển gen môi trường rễ; F Cây lạc chuyển gen giá thể đất:trấu:cát Để kiểm tra có mặt gen chuyển, sau khoảng tháng, mẫu dòng T0 tiến hành thu để tách chiết DNA tổng số Sử dụng DNA tổng số tách chiết, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy thu dương tính với phản ứng PCR chiếm tỷ lệ 0,43 % số mẫu biến nạp (dòng 24, 49, 52, 89 – hình 3.25) Các dịng tiếp tục trồng để thu hạt đánh giá biểu gen chuyển hệ sau 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kế ận Các giống lạc nghiên cứu xếp thành nhóm khác mức độ chịu hạn giai đoạn mô sẹo non Hai giống L12, L16 thuộc nhóm chịu hạn tốt, bốn giống chịu hạn (L20, MD7, L14, Sen lai) bốn giống chịu hạn (L08, L15, LVT, TB25) Tách dịng xác định trình tự gen NAC2 phân lập từ giống lạc chịu hạn tốt L12 Gen NAC2 có kích thước 1050 nucleotide, mã hóa vùng NAC khoảng 160 amino acid Thiết kế thành cơng vector chuyển gen pBI121:NAC2 Đã tạo 194 dịng thuốc chuyển gen chọn lọc kanamycine Đã xác định 186/194 dòng thuốc chuyển gen dương tính với PCR Các dịng chuyển gen có tỷ lệ tăng hàm lượng proline cao nhiều so với đối chứng Protein tái tổ hợp NAC2 biểu thành cơng hai dịng N19, N106 với kích thước ước tính khoảng 39 kDa Tối ưu quy trình tái sinh chuyển gen thị GUS thơng qua mơ sẹo hóa phơi soma lạc Gen thị GUS biểu giai đoạn phơi soma lạc hồn chỉnh Tạo dòng lạc chuyển gen hệ T0: 24, 49, 52, 89 từ giống lạc chịu hạn LVT Đề nghị - Tiếp tục phân tích dịng lạc chuyển gen chịu hạn phục vụ cho chọn tạo giống lạc theo định hướng nâng cao khả chịu hạn lạc kỹ thuật chuyển gen 25 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN NAC2 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Ngun – 2013 26 Cơng trình hoàn thành Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Lê Trần Bình Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Họp Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên Vào hồi ngày tháng năm 20 : 27 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Thu Ngà, Lê Trần Bình (2011), “Phân nhóm giống lạc theo khả chịu hạn khác nhau”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn, 167, tr 48-54 Nguyễn Thị Thu Ngà, Lê Trần Bình (2012), “Nghiên cứu khả tái sinh biến nạp gen lạc (Arachis hypogaea L.) thông qua mơ sẹo hóa phơi soma“, Tạp chí Sinh học, 34(3), tr 370-376 Nguyễn Thị Thu Ngà, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Bành Thị Mai Anh (2013), “Tách dịng, giải trình tự đặc điểm transcription factor NAC2 lạc (Arachis hypogaea L.)“, Tạp chí Sinh học, 35(2), tr 234-242 Nguyễn Thị Thu Ngà, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2013), “Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 điều khiển tính chống chịu hạn lạc”, Hội nghị khoa học Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2013, tr 935 – 939 Cơng bố 01 trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC (NAC2) Ngân hàng gen quốc tế (1) Nguyen Nga T T., Le Son V., Pham Ngoc B and Le Binh T (2012), Arachis hypogaea mRNA for NAC2 transcription factor (NAC2 gene), cultivar L12, EMBL, GenBank, Accession HF546358 ... đề tài: ? ?Nghiên cứu phân lập chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L.)? ?? nhằm thử nghiệm khả chuyển gen thị tiến tới chuyển gen chịu hạn để tạo dòng chuyển gen phục... khả chịu hạn lạc kỹ thuật chuyển gen 25 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN NAC2 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea. .. trình chuyển gen lạc qua mô sẹo phôi soma 3.4.3 Chuyển cấu trúc gen chịu hạn mang nhân tố phiên mã NAC2 lạc Từ kết nghiên cứu chuyển cấu trúc gen chịu hạn thuốc lá, chuyển gen thị GUS lạc, tiến