BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––––– NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Công trình được hoàn thành tại: Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Bộ môn Di truyền- Sinh học hiện đại, Khoa Sinh – KTNN Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên. Phản biện 1: Phản biện 2: Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Hà GS.TS. Chu Hoàng Mậu 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất ở gia cm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở châu Á, Trung đông, châu Âu và châu Phi.  nước ta, dịch cúm gia cm H5N1 xảy ra từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cm và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và khống chế bệnh là yêu cu thực tiễn đặt ra. Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất trong những phn ăn được như lá, củ, quả và hạt.  Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con người. Với ưu điểm nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển.Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, HA1 của virus cúm A/H5N1; Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc gen HA1 và biểu hiện được protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tương. 2 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA,đoạn gen HA1, nhân dòng gen HA, đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn E.coli và tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1. 3.2. Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1 vào vi khuẩn A.tumefaciens. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA , đoạn gen HA1; 3.3. Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương; 3.4. Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tương. Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tương ĐT12 và DT84; 3.5. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tương và phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tương của thế hệ T 0 3.6. Phân tích dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T 1 bằng kỹ thuật PCR và lai Western blot để xác định sự biểu hiện của protein HA1 ở hạt đậu tương. 4. Những đóng góp mới của luận án 4.1. Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu hiện trong hạt đã được thiết kế thành công và tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA và HA1 của virus cúm A/H5N1. 4.2. Hai giống đậu tương ĐT12 và DT84 đã được thử nghiệm chuyển gen gus. Hiệu suất chuyển gen được kiểm tra ở giai đoạn hạt thu được khoảng 7,8% đối với giống ĐT12 và 4,3 % với giống DT84. 4.3. Chuyển cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương và thu được 8 dòng cây đậu tương ở thế hệ T 0 3 mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HA1. 4.4.  thế hệ T 1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen HA1op và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tương H11. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật. Biểu hiện thành công gen gus ở hạt. Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tương. Với việc lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương đã tổn thương, tạo cây đậu tương chuyển gen và đã biểu hiện thành công gen HA1 của virus H5N1 trong hạt đậu tương. Về thực tiễn: với kết quả protein HA1 đã được biểu hiện thành công trong hạt đậu tương ở thế hệ T1 làm tiền đề cho việc kiểm tra đáp ứng khả năng miễn dịch của gia cm đồng thời làm cơ sở cho việc sản xuất vaccine ăn được ở thực vật. 6. Cấu trúc luận án: Gồm 110 trang, được chia thành các phn: Mở đu: 4 trang, chương 1: tổng quan tài liệu 43 trang, Chương 2: vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 14 trang, Chương 3: kết quả nghiên cứu và thảo luận: 43 trang, Kết luận: 2 trang, các bài báo liên quan đến luận án:1 trang. Với 156 tài liệu tham khảo luận án gồm 37 hình, 16 bảng. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo tài liệu 23 tiếng Việt và 133 tài liệu tiếng Anh,với các nội dung liên quan bao gồm: (1) Bệnh cúm gia cm và virus cúm A/H5N1 (2)Vaccine phòng chống bệnh cúm 4 A/H5N1 (3) Ứng dụng kĩ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực vật. Cúm gia cm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra . Đây là nhóm virus có biên độ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh.Virus cúm A/H5N1 có hệ gen được cấu trúc gồm 8 phân đoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA. Trong đó phân đoạn phân đoạn 4 mã hóa cho protein trên bề mặt capsid của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A đó là hemagglutinin (HA) có thể được coi là một loại protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm và có khả năng kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, là đích bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm,đây chính là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay.Đối với dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cm mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người. Các loại vaccine sử dụng phòng chống bệnh cúm A/H5N1 bao gồm vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen, vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo, vaccine ăn được ở thực vật.  Việt Nam, việc nghiên cứu biểu hiện gen HA đang được tiến hành trên đối tượng thực vật như cây đậu tương và đã thành công trong việc biểu hiện gen HA trên cây thuốc lá.Tạo vaccine thực vật là một 5 hướng đi cn thiết nhưng cho đến nay vẫn chưa có vaccine thực vật mang gen HA được đưa vào sử dụng. Mặc dù kết quả nghiên cứu còn khiêm tốn, nhưng đy hứa hẹn trong tương lai sẽ có nhiều mô hình vaccine thực vật phòng bệnh cho người và vật nuôi sẽ được phát triển ở Việt Nam. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT,THIẾT BỊ Nguyên liu thực vật: Giống đậu tương ĐT12 và DT84 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển cây đậu đỗ, Viện cây lương thực và cây thực phẩm- Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp. Chủng vi khun và các loại vector: Vector pPTN289; pDest-phaso do VUB cung cấp, gen HA của virus A/H5N1 do viện Công nghệ sinh học cung cấp. Các chủng vi khuẩn E. coli DH5 và A.tumefaciens CV58, EHA101 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật-Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Hóa chất,thiết bị: Đề tài sử dụng một số hóa chất và các trang thiết bị của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học. 2.2. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Nhóm phương pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen 2.2.1.1. Phương pháp PCR 2.2.1.2. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel 2.2.1.3. Phản ứng ghép nối :Thực hiện quá trình biến nạp vào E.coli theo phương pháp sốc nhiệt của Cohen(1972) 6 2.2.1.4. Chọn dòng bằng PCR và cắt bằng enzyme hạn chế: Tách chiết plasmid tái tổ hợp được thực hiện theo Sambrook và đtg(2001), phương pháp sử dụng enzym cắt hạn chế thực hiện theo Sambrook và đtg(2001). 2.2.1.5. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway 2.2.1.6. Biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens 2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in vitro 2.2.2.1. Kỹ thuật tái sinh cây thuốc lá 2.2.2.2. Kỹ thuật tái sinh cây đậu tương Kỹ thuật tái sinh cây đậu tương qua đa chồi từ nách lá mm hạt chín được tiến hành dựa trên phương pháp của Olhoft và cộng sự (2001). 2.2.3. Phương pháp phân tch cây chuyển gen 2.2.3.1. Kỹ thuật PCR: DNA hệ gen của các dòng cây được tách nhanh bằng phương pháp của Edwards et al(1991). 2.2.3.2. Tách chit protein t ht Protein tổng số được chạy trên gel 12.5% SDS polyacrylamide theo phương pháp của Laemmli (1970) . 2.2.3.3. Phân tch western blot: Protein tổng số được chạy trên gel 12.5% SDS sau đó được chuyển lên màng nitrocellulose Hybond TM (Amersham). Màng lai đã được rửa bằng TBS và block với 3% BSA trong 1 giờ. Sau đó màng được rửa tiếp và ủ với kháng thể c-myc trong TBS bổ sung 0.5% BSA và 0.05% Tween 20. Sau thời gian 1 giờ, màng được rửa và ủ với kháng thể 2 có gắn ALP hoặc kháng thể IgG của chuột cộng hợp với horseradish peroxidase HRP (Abcam). Sau khi rửa ln cuối màng được ủ trong NBT/BCIP hoặc sử dụng bộ kit EDL TM (Amersham) để phát hiện protein tái tổ hợp. 7 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1 3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA Các tế bào miễn dịch không phản ứng hoặc không nhận diện toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chúng chỉ nhận diện những vị trí nhất định trên phân tử kháng nguyên. Những vị trí đó được gọi là epitope hoặc vị trí quyết định kháng nguyên. Dựa trên công bố của một số công trình nghiên cứu về epitope trên gen HA của H3N1 các trình tự của epitope B và T được xác định các epitope B và T nằm ở các vị trí tương ứng là 91-108 và 307-319. Trình tự HA của A/H5N1 (AJ867074) cho thấy ở các vị trí này trình tự amino acid có độ tương đồng cao với các epitope trên. Vector biểu hiện trong thực vật bao gồm một cấu trúc SLHEP chứa signal peptide (2S2), các epitope B và T của HA, một trình tự có khả năng gây miễn dịch niêm mạc ruột (LTB), trình tự nhận biết protein trong nội chất (KDEL) và các vị trí nhận biết điểm cắt của enzyme. 3.1.1.1. Tổng hợp gen HA chứa mã bộ ba biểu hiện cao trong thực vật Sự biểu hiện protein tái tổ hợp là hướng đi cơ bản của công nghệ sinh học hiện đại. Tuy nhiên các protein rất khó biểu hiện trong cơ thể khác loài. Một số mã bộ ba rất dễ biểu hiện cao trong loài này nhưng không biểu hiện hay biểu hiện thấp trong loài khác. Mục tiêu của nghiên cứu này là biểu hiện gen HA của virus H5N1 ở cơ thể thực vật, do vậy cn thiết phải thay đổi một số mã bộ ba nhằm làm tăng mức độ biểu hiện gen HA trong tế bào chủ.Trên cơ sở trình tự gen HA và 8 protein HA của virus H5N1 chúng tôi đã thiết kế và tổng hợp nhân tạo một gen HA (HAop) có khả năng biểu hiện cao phù hơp với cây trồng. Gen nhân tạo HAop gồm 1695 nucleotide và có sự thay đổi một số mã bộ ba nucleotide nhưng trình tự amino acid không thay đổi 3.1.1.2. Thit k vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HAop Kết quả khuyếch đại gen HA Dựa trên trình tự gen HAop, cặp mồi đặc hiệu XhoI- HA/HindIII-HA đã được thiết kế. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% cùng với thang DNA chuẩn 1kb (Hình 3.3) cho thấy kết quả nhận được một đoạn DNA có kích thước khoảng 1,7 kb phù hợp với kích thước gen HAop theo tính toán lý thuyết Hình 3.3. Hình ảnh đin di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen HAop bằng XhoI-HA/HindIII-HA (M: Thang DNA chun 1kb) Ghép nối đon gen HA vào vector p201-SLHEP Sản phẩm thôi gel được xử lý đồng thời bởi hai enzym XhoI/HindIII và được nối vào vector p201-SLHEP. Trên vector có 2 vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2, đoạn gen cn chuyển sẽ được xen vào giữa 2 vị trí này. Trên vector còn chứa gen kháng kháng sinh 1 M 1,7kb [...]... mầm của hai giống đậu tương (Glycine max L.) ĐT12 và DT84 bằng Agrobacterium”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8( 38): tr 1305-1310 3 Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của virus H5N1 phục vụ sản xuất vaccine thực vật”, Tạp chí khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên, 89(1):tr 123-127 4 “Biểu hiện kháng nguyên của virus H5N1 trong thực vật”,... nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu hiện gen gus trên cây đậu tương chuyển gen A, B: lá mầm hạt non; C, D: mảnh lá; A, C: cây không chuyển gen; B, D: cây chuyển gen; E: cây đậu tương mang gen gus Từ các kết quả nghiên cứu chuyển thành công gen gus ở giống đậu tương ĐT12 và DT84, chúng tôi đã đề xuất quy trình hoàn chỉnh cho việc tái sinh phục vụ chuyển gen đối với cây đậu tương thông qua phương pháp nách... đoán protein tái tổ hợp HA1 biểu hiện trong hạt của dòng đậu tương chuyển gen H11 có hàm lượng thấp, tuy nhiên, chúng tôi chưa định lượng được loại protein tái tổ hợp HA1 này, vì thế cần phải có những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp HA1 trên hạt đậu tương chuyển gen Trong thực tế để có đủ nguồn vật liệu phục vụ đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật... được 32 cây T0 phát triển trên giá thể ( Hình 3.26) Hình 3.26 Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 được trồng trong nhà lưới 21 3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN HA1 3.3.1 Phân tích sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 Sử dụng 3µl sản phẩm DNA đã được tách chiết để tiến hành phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu Kết quả điện di sản phẩm... ảnh protein HA1 hiện phim được phân tích bằng Western blot từ protein tổng số tách chiết từ hạt của dòng đậu tương H11 chuyển gen (M: Thang protein chuẩn; (-): cây không chuyển gen; 1-2: các mẫu hạt thu được của cây đậu tương H11) Kết quả phân tích Western blot ở hình 3.29 cho thấy protein HA1 được phát hiện ở kích thước khoảng 40kDa, tương ứng với kích thước của protein HA1 theo tính toán lý... và 4,3% với giống DT84 1.5 Đã chuyển thành công cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tương và thu được 8 dòng cây đậu tương ở thế hệ T0 mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HA1, dương tính với phản ứng PCR 1.6 Ở thế hệ T1 đã thu được dòng đậu tương H11 chuyển gen mang đoạn gen HA1 và protein tái tổ hợp HA1 được biểu hiện trong hạt của dòng đậu tương chuyển gen này 2 ĐỀ NGHỊ 2.1 Tiếp tục... kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen chuyển HA1 được trình bày ở hình 3.28 1,25kb Hình 3.28 Phân tích sản phẩm PCR bằng cặp mồi đặc hiệu XhoIHA1/ HindIII-HA1 với các dòng cây đậu tương thế hệ T1 (M: Thang DNA chuẩn 1kb, (-) đối chứng âm, (wt) cây không chuyển gen, H4, H11: hai dòng đậu tương phân tích ở thế hệ T1) Kết quả phân tích biểu hiện protein ở hạt của cây đậu tương chuyển gen Từ kết... chuyển gen ở thế hệ T1 Sử dụng lá non của 8 dòng cây đậu tương chuyển gen theo dõi ở thế hệ T1 để tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen HA1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết quả trong 8 dòng cây phân tích ở thế hệ T1 chỉ có 2 dòng cây cho hạt là H11 và H4 (T2) Thu mẫu lá của hai dòng đậu tương chuyển gen H11 và H4 để 22 tách chiết DNA, kiểm tra đoạn gen HA1 bằng PCR với cặp mồi XhoIHA1/HindIII-HA1,... hiện protein HA1 ở hạt của các dòng đậu tương biến nạp ở thế hệ tiếp theo 2.2 Cần kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp HA1 ở gia cầm CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1 “Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên bề mặt cúm A /H5N1 trong thực vật”, Báo cáo khoa học hội nghị Công nghệ sinh học Toàn quốc năm 2009, tr.122-126 2 Nghiên cứu khả năng tái sinh và biến nạp gen. .. thu nhận được 8 cây dương tính với phản ứng PCR nhân bản đoạn gen chuyển HA1, chiếm tỷ lệ 1,2 % tổng mẫu biến nạp (Hình 3.27) Hình 3.27 Phân tích cây đậu tương chuyển gen mang đoạn gen HA1 ở thế hệ T0 (M: Thang DNA chuẩn 1kb;( -): Đối chứng âm; WT: Cây không chuyển gen; 1 – 8: Các dòng T0 được phân tích; (+): Đối chứng dương (plasmid) 3.3.2 Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T1 . NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN. Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế được vector mang cấu trúc gen HA, HA1 của virus. hin gen gus trên cây đậu tương chuyển gen A, B: lá mm hạt non; C, D: mảnh lá; A, C: cây không chuyển gen; B, D: cây chuyển gen; E: cây đậu tương mang gen gus Từ các kết quả nghiên cứu chuyển