xác định trình tự gen e6 và l1 của hpv và gen ebna-1 của ebv để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng

85 807 1
xác định trình tự gen e6 và l1 của hpv và gen ebna-1 của ebv để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG VĂN MẠNH XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN E6 VÀ L1 CỦA HPV VÀ GEN EBNA-1 CỦA EBV ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHUẨN ĐOÁN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ VÒM MŨI HỌNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. Lê Thanh Hoà Thái Nguyên - 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ala Alanine bp Base pair BL Burkitt’s Lymphoma CTC Cổ tử cung E Early region EBV Epstein-Barr Virus Gly Glycine gs-PCR Group-specific PCR HPV Human papilloma virus HP6 Hải Phòng 6 (ký hiệu mẫu) L Late region LCL Lymphoblastoid LCR Long control region LMP Latent membrane protein MHC Major Histocompatibility Complex MT7 Miền trung 7 (ký hiệu mẫu) NPC Nasopharyngeal carcinoma p53 Protein 53 PV Papilloma virus RB Retinoblast TR Terminal repeat ts-PCR Type- specific PCR UICC Universal Integrated Circuit Card UTBM Carcinoma VCA Viral capsid antigen VMH Vòm mũi họng WHO World Health Organization Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng trong luận văn Trang Bảng 1.1 Tình hình ung thư CTC trên thế giới (không tính Châu Phi) 5 Bảng 2.1 Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng multiplex-PCR HPV-16/HPV-18 38 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt độ trong phản ứng multiplex-PCR HPV16/HPV18 39 Bảng 2.3 Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản ứng PCR gen E6 cua HPV-16 39 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR của gen EBNA-1 40 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng (pCR2.1TOPO) 43 Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằ ng enzym EcoRI 47 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng to DNA sợi đơn 49 Bảng 2.8 Chu trì nh nhiệ t củ a phả n ứ ng giả i trì nh tự 49 Bảng 3.1 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen E6 của mẫu PK12 56 Bảng 3.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen L1 của mẫu PS16 57 Bảng 3.3 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi nucleotide gen EBNA-1 của EB17, EB18, EB19 và EB20 64 Bảng 3.4 Kết quả xác định phân týp của các chủng EBV qua phân tích acid amin ti vị trí 487 của EBNA-1 66 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình trong luận văn Trang Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả năng nhiễm ung thư cổ tử cung của các châu lục 4 Hình 1.2 Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) trong ung thư cổ tử cung 9 Hình 1.3 Mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc của 101 Papillomavirus dựa trên so sánh chuỗi nucleotid của gene capsid L1 11 Hình 1.4 Human Papillomavirus chụp dưới kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của hệ gene HPV -16. 13 Hình 1.6 Quá trình nhân lên của HPV 15 Hình 1.7 Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV trong cơ thể bị nhiễm 27 Hình 1.8 Cấu trúc hệ gene EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a) và dạng mạch thẳng (b) 29 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu phân tích gene EBNA-1 của virus EBV và E6 của virus HPV16 và L1 của HPV18 34 Hình 2.2 Cấ u trú c vector pCR2.1-TOPO® (Invitrogen) 43 Hình 3.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51 Hình 3.2 Kiểm tra sản phẩm multiplex-PCR sử dụng cùng lúc 2 cặp mồi (E6F-E6R và HP18F-HP18R) với khuôn DNA tổng số của các mẫu PS16, PK12, PK11, PK10. 52 Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm tách dòng đoạn gen E6 của mẫu PK12 (bản A) và đoạn gen L1 của mẫu PS16 (bản B). 53 Hình 3.4 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen E6 của mẫu PK12 (HPV-16). 54 Hình 3.5 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen L1 của mẫu PS16 (HPV18). 54 Hình 3.6 Trình bày chuỗi gen E6 của typ HPV-16. 55 Hình 3.7 Trình bày chuỗi gen L1 của typ HPV-18 55 Hình 3.8 Kết quả bước đầu phát hiện HPV16/HPV18 bằng phương pháp đa mồi multiplex-PCR. 59 Hình 3.9 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm EBV 61 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gen EBNA-1 61 Hình 3.11 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen EBNA-1 63 Hình 3.12 Kết quả chuỗi gen EBNA-1 của EB17 được thu nhận sau giải trình tự 63 Hình 3.13 So sánh một phần trình tự acid amin EBNA-1 của 13 chủng nghiên cứu 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. UNG THƢ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 4 1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung 4 1.1.1.1. Trên thế giới 4 1.1.1.2. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 6 1.1.1.3. Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thư CTC 6 1.1.1.4. Human papilloma virus và bệnh ung thư cổ tử cung 6 1.1.2. Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus 9 1.1.2.1. Phân loại Papilloma virus 9 1.1.2.2. Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus 12 1.1.2.3. Quá trình nhân lên của HPV 14 1.1.2.4. Cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV 16 1.1.3. Chẩn đoán ung thư CTC 17 1.1.3.1. Chẩn đoán tế bào học 17 1.1.3.2. Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA 19 1.1.3.3. Định týp HPV bằng sinh học phân tử 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.4. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 21 1.2. UNG THƢ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) 22 1.2.1. Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng 22 1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 22 1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 23 1.2.2. Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus (EBV) 24 1.2.2.1. Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thư VMH 24 1.2.2.2. Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV 25 1.2.2.3. Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của EBV… 26 1.2.2.4. Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gene của EBV 28 1.2.2.5. Gene và sản phẩm của gene EBNA-1 29 1.2.3. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam 30 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 33 2.2. Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu 33 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị 33 2.2.2. Hoá chất 33 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.4. Quy trình nghiên cứu 35 2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản 35 2.4.2. Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số 35 2.4.3. Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR 37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.4.3.1. Thiết kế mồi………………………………………………. 37 2.4.3.2. Quy trình phản ứng PCR 38 2.4.3.3. Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR 40 2.4.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR 41 2.4.4. Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR 42 2.4.4.1. Tạo vectơ tái tổ hợp 42 2.4.4.2. Chuyển nạp…………………………………… …………… 43 2.4.4.3. Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp 44 2.4.4.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp 45 2.4.4.5. Kiểm tra DNA tái tổ hợp 47 2.4.5. Giải trình trình tự và xử lý số liệu 48 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1. Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen E6 của HPV-16 và L1 của HPV-18 51 3.1.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51 3.1.2. Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex-PCR phát hiện HPV-16 và HPV-18 52 3.1.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự các sản phẩm HPV-16 và HPV-18 từ các mẫu kiểm tra 53 3.1.4. Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và chuỗi gen L1 của HPV-18 54 3.1.5. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 của HPV16 và L1 của HPV18 56 3.1.6. Kết quả bước đầu phát hiện HPV-16 và HPV-18 bằng phương pháp đa mồi multiplex-PCR 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2. Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen EBNA – 1 của EBV 60 3.2.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 60 3.2.2. Kết quả thực hiện phản ứng PCR 61 3.2.3. Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen EBNA-1 của EBV 62 3.2.4. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1 của EBV 63 3.2.5. Kết quả xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin số 487 của EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng của các chủng Việt Nam và thế giới 64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 4.1. KẾT LUẬN 69 4.2. KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, ung thư (cancer) là một trong những nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao nhất ở người, chiếm khoảng 12% trong tổng số trường hợp tử vong hàng năm trên thế giới, đứng thứ 2 sau tỷ lệ tử vong của các bệnh lí về tim - mạch và ngày càng có xu hướng gia tăng. Bệnh ung thư nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ dẫn đến nguyên nhân gây tử vong, do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu. Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới (nam và nữ) và ở tất cả các mô, các cơ quan trong cơ thể. Đặc biệt, ung thư cổ tử cung (CTC) và ung thư vòm mũi họng (VMH) là hai trong số 5 loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất ở Việt Nam và các quốc gia đang phát triển trong khu vực. Trong đó, ung thư CTC đứng thứ 2 trong số các ung thư và là nguyên nhân gây tử vong cao nhất cho phụ nữ ở Việt Nam [1], [9]. Bên cạnh đó, ung thư VMH cũng là một trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người và là loại hay gặp nhất trong ung thư vùng tai mũi họng ở các nước vùng Đông nam Á và phía nam Trung Quốc [23], [56]. Nguyên nhân gây ra ung thư rất phức tạp, liên quan đến thể địa, tập quán, thói quen và môi trường sống. Trong đó, một số yếu tố đã được coi là liên quan chặt chẽ với việc gây ra ung thư như: yếu tố vật lí (phóng xạ), hóa chất độc, các gốc tự do và đặc biệt ngày nay đã phát hiện ra vai trò của các virus trong tiến triển ung thư. Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh virus là nguyên nhân gây ra hai loại ung thư này ở người. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện diện của HPV (Human papilloma virus) trong hơn 95% các trường hợp ung thư cổ tử cung [62], do đó HPV được coi là nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9]. Các nghiên cứu về mối liên quan giữa Epstein-Barr Virus (EBV) và ung thư VMH cũng đã cho thấy sự biểu hiện của kháng nguyên virus trong các giai đoạn của bệnh, vai trò quan trọng của EBV trong bệnh học cũng như trong quá trình sàng lọc chẩn đoán điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24]. [...]... những công trình nghiên cứu có liên quan, những kết quả mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu về Human papilloma virus (HPV) và Epstein-Barr Virus (EBV) , chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng với mục tiêu nghiên cứu: 1 Thu nhận chuỗi gen E6 của HPV- 16 và chuỗi gen L1 của HPV- 18,... việc chẩn đoán phát hiện sớm HPV, bước đầu định hướng ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong việc chẩn đoán ung thư CTC và xác định týp HPV hay gặp ở nước ta 1.2 UNG THƢ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) 1.2.1 Dịch tễ học ung thƣ vòm mũi họng Ung thư vòm mũi họng NPC (Nasopharyngeal carcinoma) là một khối u ác tính xuất phát từ lớp biểu mô phủ của vùng vòm mũi họng [53] Loại ung thư này... QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƢ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 1.1.1 Dịch tễ học ung thƣ cổ tử cung Ung thư cổ tử cung là bệnh ác tính thư ng gặp thứ hai ở phụ nữ trên toàn thế giới và là một trong số các nguyên nhân tử vong hàng đầu liên quan đến bệnh ung thư cho phụ nữ ở các nước đang phát triển với khoảng 500.000 ca mới và 250.000 ca chết mỗi năm Khoảng 80% số ca ung thư cổ tử cung xảy ra ở các... thƣ cổ tử cung của HPV Khái niệm về cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV Cơ chế HPV gây ung thư CTC đã được Massimi và Banks (1997) giải thích như sau: ở người và động vật, có hai protein điều chỉnh sự phân chia và mức độ phát triển tế bào là RB (retinoblast) và p53 (protein điều hoà khối u) Khi hai gen E6 và E7 của HPV tổng hợp protein, làm cho tự nó tiếp xúc với RB và p53 sẽ gây cản trở quá trình. .. nhiễm tự nhiên HPV (Hình 1.2) Những nghiên cứu ở giai đoạn xâm lấn và giai đoạn trước xâm lấn là cần thiết để dự đoán tác động tương lai của loại vắc-xin HPV- 16 /HPV- 18 và xét nghiệm HPV Phân tích xác định các chủng HPV trong ung thư cổ tử cung giai đoạn xâm lấn (ICC) cho thấy HPV- 16 là phổ biến nhất và HPV- 18 loại thứ hai phổ biến, trong tất cả các châu lục Kết hợp giữa các trường hợp nhiễm HPV1 6 /HPV- 18,... học của Human Papillomavirus Năm 1974 - 1976, bắt đầu có sự nghiên cứu về HPV và chứng minh HPV là nguyên nhân gây ung thư CTC Nhưng đến những năm 1980, sự phát triển ứng dụng các kỹ thuật đã xác định DNA - HPV trong mô bệnh phẩm ung thư CTC [18], [19], [72] Những týp đầu tiên được phân lập là HPV- 16 và HPV- 18, và hệ gen của chúng chính là nguồn gen quan trọng trong nghiên cứu về HPV Virus Papilloma của. .. HPV và khi đã nhiễm thì tiến triển sẽ nhanh và nặng nề Bên cạnh đó, có sự gia tăng nồng độ kháng thể kháng HPV sau khi bị nhiễm tự nhiên, tuy nhiên nồng độ kháng thể này không đủ để gây đáp ứng miễn dịch bảo hộ cơ thể nhiễm Tổn thư ng dị sản hay ung thư cổ tử cung có một thời gian dài phát triển tại biểu mô và tại cổ tử cung Trung bình, khoảng 10- 20 năm cho sự tiến triển từ dị sản đến ung thư cổ tử. .. phân tử protein histon, các vùng gen HPV được định vị trên một sợi DNA Trong đó, L1 là gen mã hoá cho protein vỏ ngoài và cũng chính là thành phần kháng nguyên bề mặt của virus Gen E6 thuộc phân vùng gen thứ 2 (vùng sao chép sớm) của hệ gen HPV, tổng hợp protein E6 và các protein tương ứng, có vai trò quan trọng giúp cho sự nhân lên DNA của virus, tham gia cơ chế hình thành ung thư CTC Protein E6 của HPV. .. vòm mũi họng Các nghiên cứu này đã cho thấy sự biểu lộ của các kháng nguyên virus trong các giai đoạn của bệnh và vai trò quan trọng của virus Epstein-Barr trong bệnh học cũng như trong quá trình sàng lọc chẩn đoán, điều trị, theo dõi và tiên lượng bệnh [24], [30], [37], [40] 1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Ở Việt Nam, ung thư vòm mũi họng ứng hàng đầu trong các ung thư Tai Mũi Họng và Đầu... hiệu theo týp hiện nay được sử dụng nhiều trong nghiên cứu, nhưng rất giới hạn trong sàng lọc bệnh phẩm đại trà, do chi phí còn rất cao 1.1.4 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng phƣơng pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam Bệnh ung thư CTC là một bệnh phổ biến, có tỷ lệ tử vong cao trong các bệnh ung thư nói chung và ung thư đường sinh dục nữ nói riêng, . trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng với mục tiêu nghiên cứu: 1. Thu nhận chuỗi gen E6 của HPV- 16 và chuỗi gen. chuỗi gen E6 của HPV- 16 và chuỗi gen L1 của HPV- 18 54 3.1.5. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 của HPV1 6 và L1 của HPV1 8 56 3.1.6. Kết quả bước đầu phát hiện HPV- 16. phân tử và xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam 21 1.2. UNG THƢ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) 22 1.2.1. Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng

Ngày đăng: 05/10/2014, 06:35

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan