BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI    TRẦN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ EMS ðẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG ALKALOID TỔNG SỐ CỦA CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS G.DON) NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI    TRẦN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ EMS ðẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG ALKALOID TỔNG SỐ CỦA CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS G.DON) NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH HÀ NỘI – 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành ñược bản luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự chia sẻ và giúp ñỡ. Qua ñây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: - PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã tận tình hướng dẫn, tạo ñiều kiện, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh luận văn. - Tập thể các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học- Khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong quá trình thực tập. - Tập thể cán bộ Viện nghiên cứu Sinh học Nông Nghiệp – Trường ðại học Nông nghiệp ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt ñề tài tốt nghiệp. - Cảm ơn gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Tác giả luận văn Trần Thị Hiền Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv MỤC LỤC Lời cam ñoan 0 Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình x Tóm tắt xii MỞ ðẦU 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Giới thiệu chung về cây Dừa cạn 4 1.1.1 Tên gọi 4 1.1.2 Nguồn gốc, phân bố 4 1.1.3 Phân loại 4 1.1.4 ðặc ñiểm thực vật học 5 1.1.5 Trồng trọt và thu hoạch 5 1.2 Các alkaloid – thành phần hóa học quan trọng nhất của Dừa cạn 6 1.2.1 Khái niệm 6 1.2.2 Một số hợp chất alkaloid chính có trong cây Dừa cạn 7 1.3 Tác dụng dược lý của cây Dừa cạn 11 1.3.1 Tác dụng trong dân gian. 11 1.3.2 Tác dụng chống ung thư của alkaloid từ Dừa cạn 11 1.3.3 Ứng dụng các alkaloid của Dừa cạn trong ñiều trị bệnh 13 1.4 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 14 1.4.1 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn trên thế giới 14 1.4.2 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn ở Việt Nam. 17 1.5 ðột biến di truyền và phương pháp xử lý ñột biến bằng EMS 18 1.5.1 ðột biến di truyền 18 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 1.5.2 Ethyl methane sulphonate (EMS) – Tác nhân gây ñột biến hóa học 21 2.6 Các nghiên cứu về xử lý EMS trong công tác chọn giống 22 Chương 2 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 ðối tượng, vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu 24 2.2 Nội dung nghiên cứu: Bao gồm 3 nội dung chính 24 2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 24 2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển và sự biến dị của các dòng Dừa cạn sau xử lý EMS in vitro 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 29 3.2.2 Phương pháp tiến hành 30 2.3.3 Cách tính các chỉ tiêu 31 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 34 3.1.1 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự phát sinh hình thái từ mô Dừa cạn in vitro. 34 3.1.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 1,0 mg/l α-NAA ñến sự sinh trưởng phát triển và hệ số nhân chồi của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro. 45 3.1.3 Ảnh hưởng của một số chất ñiều tiết sinh trưởng ñến khả năng tạo cây hoàn chỉnh in vitro 47 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phổ ánh sáng và cường ñộ chiếu sáng ñến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Dừa cạn in vitro 53 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển của cây Dừa cạn in vitro. 55 3.2.1 Nghiên cứu xử lý ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn trong dung dịch có bổ sung EMS 57 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi 3.2.2 Nghiên cứu xử lý nuôi cấy ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn trong môi trường có bổ sung EMS. 60 3.2.3 Nghiên cứu xử lý nuôi ñoạn thân không mang mắt ngủ Dừa cạn trong môi trường có bổ sung EMS. 63 3.2.4 Phân tích hàm lượng alkaloid của dòng Dừa cạn ñã xử lý EMS in vitro và cây Dừa cạn không xử lý EMS. 65 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 67 1 Kết luận 67 2 ðề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 71 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA : Benzyl adenin CT : Công thức CTTD : Chỉ tiêu theo dõi CTTN : Công thức thí nghiệm CV (%) : Sai số thí nghiệm ðC : ðối chứng ðTST : ðiều tiết sinh trưởng EMS : Ethyl methane sulphonate HSN : Hệ số nhân IBA : Axit β – indol butyric Ki : Kinetin LSD 0,05 : ðộ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% M : Mẫu MS : Môi trường Murashige and Skoog NXB : Nhà xuất bản TB : Trung bình α – NAA : Axit α – naphtyl axetic Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Ảnh hưởng của auxin ñến tỷ lệ phát sinh hình thái từ mô Dừa cạn in vitro 35 3.2 Ảnh hưởng của cytokinin ñến tỷ lệ phát sinh hình thái từ mô Dừa cạn in vitro 37 3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp 2.4D và Kinetin ñến sự phát sinh hình thái từ mô Dừa cạn in vitro 41 3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp α-NAA và BA ñến sự phát sinh hình thái từ mô Dừa cạn in vitro 43 3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA ñến sự sinh trưởng phát triển của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro 45 3.6 Ảnh hưởng của α - NAA và than hoạt tính ñến sự tạo rễ của chồi Dừa cạn in vitro 48 3.7 Ảnh hưởng IBA ñến sự tạo rễ của chồi Dừa cạn in vitro 50 3.8 Ảnh hưởng tổ hợp α - NAA và IBA ñến sự tạo rễ của chồi Dừa cạn in vitro 51 3.9 Ảnh hưởng của phổ ánh sáng và cường ñộ chiếu sáng ñến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Dừa cạn in vitro sau 4 tuần nuôi cấy. 54 3.10 Tỷ lệ sống, bật chồi và biến dị của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa ñược xử lý trong dung dịch bổ sung EMS với thời gian và nồng ñộ khác nhau. 57 3.11 Ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển của ñoạn thân mang mắt ngủ Dừa cạn ñược xử lý trong dung dịch bổ sung EMS với thời gian và nồng ñộ khác nhau. 59 3.12 Tỷ lệ sống, bật chồi và biến dị của ñoạn thân mang mắt ngủ ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung EMS trong 4 tuần 61 3.13 Ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển cùa ñoạn thân mang mắt ngủ ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung EMS 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix 3.14 Ảnh hưởng của EMS ñến tỷ lệ sống, tạo callus, tạo chồi và biến dị của ñoạn thân không mang mắt ngủ ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung EMS (sau 6 tuần theo dõi) 63 3.15 Hàm lượng alkaloid tổng số của 6 mẫu ñem phân tích 65 [...]... giá sinh trư ng, phát tri n và hàm lư ng alkaloid t ng s ñư c tích lũy trong cây D a c n ñã ñư c x lý EMS in vitro Vì v y chúng tôi ti n hành ñ tài nghiên c u: “ Nghiên c u nh hư ng c a x lý EMS ñ n sinh trư ng phát tri n và hàm lư ng alkaloid t ng s c a cây D a c n nuôi c y in vitro (Catharanthus roseus G Don) N i dung báo cáo g m 2 ph n chính là: Nuôi c y in vitro cây D a c n và nh hư ng c a x lý EMS. .. o gi ng ñ t bi n và chuy n gen nâng cao hàm lư ng aklaoid sau này, ñ ng th i theo dõi, ñánh giá sinh trư ng, phát tri n và hàm lư ng alkaloid t ng s ñư c tích lũy trong cây D a c n ñã ñư c x lý EMS in vitro Vì v y chúng tôi ti n hành ñ tài nghiên c u: Nghiên c u nh hư ng c a x lý EMS ñ n sinh trư ng phát tri n và hàm lư ng alkaloid t ng s c a cây D a c n(Catharanthus roseu G Don) nuôi c y in vitro ... ánh sáng phù h p nh t cho cây D a c n in vitro sinh trư ng phát tri n là 3 bóng tương ñương 60( mol/m2/s); x lý ño n thân mang m t ng D a c n in vitro trong dung d ch EMS cây có s c sinh trư ng t t nh t và n ng ñ 0,05%-1h thì n ng ñ 0.15% -2h thì t o ra t l bi n d cao nh t; x lý nuôi c y ño n thân mang m t ng D a c n in vitro trong môi trư ng có b sung 0,005% EMS thì m u c y sinh trư ng và phát tri... phát sinh hình thái c a mô lá và ño n thân không mang m t ng D a c n in vitro - Xác ñ nh ñư c môi trư ng t i ưu cho s sinh trư ng phát tri n c a ño n thân mang m t ng D a c n in vitro - Xác ñ nh ñư c môi trư ng t i ưu cho t o r cây D a c n in vitro - ðánh giá kh năng sinh trư ng và s bi n d c a các dòng D a c n sau x lý EMS in vitro - ðánh giá ñư c hàm lư ng alkaloid t ng s c a D a c n in vitro và cây. .. c n in vitro ñã ñư c x lý EMS 2.2 Ý nghĩa th c ti n và khoa h c c a ñ tài Xây d ng ñư c quy trình nuôi c y in vitro cây D a c n và xác ñ nh ñư c nh hư ng c a các n ng ñ EMS x lý ñ n sinh trư ng phát tri n và hàm lư ng alkaloid c a cây D a c n T ñó, xác ñ nh ñư c n ng ñ x lý EMS thích h p t o ti n ñ cho công tác ch n t o gi ng cây D a c n b ng phương pháp x lý ñ t bi n b ng hóa ch t EMS K t qu nghiên. .. trong môi trư ng MS (Murashige và Skoog) l ng có b sung các ch t ñi u hòa tăng trư ng th c v t khác nhau g m có auxin và cytokinin n ng ñ 1 mg/l α-NAA và 0,5 mg/l kinetin thu nh n ñư c sinh kh i và alkaloid toàn ph n cao nh t trong khi cũng môi trư ng này nhưng thay th α-NAA b ng 2,4-D cùng n ng ñ thu ñư c sinh kh i và alkaloid toàn ph n th p Kh o sát nh hư ng c a n ng ñ ñư ng sacharose ñ n vi c nuôi. .. không ph i vinblastine 1.2.1.1 Vindoline Vindoline (C25H32N2O6) ñư c Kamat và c ng s phân l p t năm 1958, Gorman và c ng s xác ñinh c u trúc năm 1962, ñư c nghiên c u là có tác d ng h ñư ng huy t (Tr n Nguyên H u và c ng s , 2003) Các nghiên c u ti p theo cho th y Vindoline là m t dihyroindol có th dùng làm nguyên li u ñ sinh t ng h p và t ng h p hóa h c t o các dimer alkaloid Vindoline có nhi u trong... vi c s d ng nh ng ch t ñi u hòa sinh trư ng th c v t như kinetin và β-indolylacetic acid (IAA) và ñư c th c hi n b i Abou- Mandour và c ng s (1979) Alen và c ng s (1995) ñã ñ xư ng vi c nhân gi ng in vitro d a c n b ng cách nuôi dư ng mô phân sinh ng n và ch i nách t nh ng cây ñư c nuôi trong nhà kính Các tác gi ñã s d ng môi trư ng MS cơ b n có b sung BA và 2,4-D n ng ñ th p, Nh ng ch i nách này s... th sinh trư ng phát tri n t t Do ñó, vi c nuôi c y thu sinh kh i l n D a c n in vitro và c i thi n hàm lư ng alkaloid là hư ng ñi m i ñư c các nhà khoa h c r t quan tâm Trên th gi i và Vi t Nam ñã có nh ng công b v nh hư ng c a ch t ñi u ti t sinh trư ng giúp c i thi n hàm lư ng alkaloid ch a trong mô cơ quan D a c n in vitro nhưng chưa có nghiên c u nào v nh hư ng c a hóa ch t g y ñ t bi n t i s sinh. .. ch c Nông nghi p qu c t và t ch c Năng lư ng nguyên t qu c t (FAO, IAEA) ñã cho bi t tính ñ n năm 1996, s lư ng các gi ng ñ t bi n thu ñư c là 1737 gi ng t hơn 50 nư c trên th gi i Các gi ng này ñư c t o ra t 154 loài th c v t Trong ñó cây tr ng chi m 1257 gi ng, 187 gi ng hoa cúc, 35 gi ng cây c nh, 34 gi ng hoa phong lan, 30 gi ng xương r ng và r t nhi u loài khác (Nguy n H u ð ng và c ng s , 1997) . NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ EMS ðẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG ALKALOID TỔNG SỐ CỦA CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS G. DON) NUÔI CẤY IN VITRO CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH. sáng và cường ñộ chiếu sáng ñến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Dừa cạn in vitro 53 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của EMS ñến sự sinh trưởng phát triển của cây Dừa cạn in vitro. 55 3.2.1 Nghiên. cạn in vitro. - ðánh giá khả năng sinh trưởng và sự biến dị của các dòng Dừa cạn sau xử lý EMS in vitro - ðánh giá ñược hàm lượng alkaloid tổng số của Dừa cạn in vitro và cây Dừa cạn in vitro