BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI        VŨ THỊ HỒNG GIANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG PHÂN LẬP ðƯỢC TRÊN ðÀN LỢN Ở TỈNH THÁI BÌNH LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LAN HÀ NỘI - 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan, mọi việc giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 9 năm 2013 Tác giả luận văn Vũ Thị Hồng Giang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN rong thời gian học tập và rèn luyện tại trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội, tôi ñã trưởng thành và nâng cao về nhân cách, trình ñộ chuyên môn. Tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ, chỉ bảo tận tình của các Thầy, Cô giáo ñặc biệt là các Thầy, Cô Khoa Thú y ñã truyền dạy kiến thức chuyên môn cũng như tư cách ñạo ñức của người Bác sỹ thú y, của một tri thức trẻ trong thời ñại mới. Nhân dịp hoàn thành luận văn tốt nghiệp cao học cho phép tôi ñược bày tỏ hơn nữa lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới các Thầy, Cô giáo. Xin ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Lan - Bộ môn Bệnh Lý, Khoa Thú y - Trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội, người hướng dẫn khoa học - người ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. ðồng thời tôi cũng bày tỏ sự biết ơn ñến các anh chị Phòng thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ sinh học Thú y; các Thầy, Cô trong Bộ môn Bệnh Lý, Khoa Thú y – Trường ðH Nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện ñể tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Xin ñược bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia ñình, bạn bè - những người ñã luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Xin trân trọng cảm ơn ! Hà nội, ngày 09 tháng 09 năm 2013 Tác giả luận văn Vũ Thị Hồng Giang T Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI 3 Ý NGHĨA KHOA HỌC 3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN 3 Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LMLM 4 1.2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU VÀ TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH LMLM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 4 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và tình hình bệnh LMLM trên thế giới 4 1.2.2. Lịch sử nghiên cứu và tình hình bệnh LMLM ở Việt Nam 10 1.3. CĂN BỆNH 13 1.3.1. Hình thái và cấu trúc của virus 13 1.3.2. Phân loại và phân bố các type virus LMLM 14 1.3.3. Sức đề kháng của virus LMLM 17 1.3.4. Đặc tính nuôi cấy 18 1.4. TRUYỀN NHIỄM HỌC 19 1.4.1. Loài vật mắc bệnh 19 1.4.2. Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây 19 1.4.3. Cơ chế sinh bệnh 20 1.5. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH BỆNH LMLM 21 1.5.1. Triệu chứng 21 1.5.2. Bệnh tích 22 1.6. CHẨN ĐOÁN VÀ PHÒNG TRỊ 23 1.6.1. Các phương pháp chẩn đoán 23 1.6.2. Vacxin LMLM phòng bệnh. 25 1.6.3. Kỹ thuật PCR 26 1.6.4. Kỹ thuật giải trình tự gen 26 1.6.5. Xây dựng cây phát sinh chủng loại 28 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29 2.3. ĐỊA ĐIỂM THỰC TẬP 29 2.4. NGUYÊN LIỆU 29 2.4.1. Dụng cụ, máy móc, thiết bị 29 2.4.2. Hóa chất, môi trường 30 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.5.1. Phương pháp thu thập mẫu 30 2.5.2. Phương pháp phân lập virus LMLM 31 2.5.3. Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus 33 2.5.4. Phương pháp RT-PCR 36 2.5.5. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm 37 2.5.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR 38 2.5.7. Phương pháp giải trình tự tự động 39 2.5.8. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự 40 2.5.9. Phương pháp đọc kết quả 41 Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU NGHIÊN CỨU 42 3.2. KẾT QUẢ PHẢN ỨNG RT-PCR 43 3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VIRUS LMLM 45 3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH TYPE VIRUS LMLM 47 3.5. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN VIRUS LMLM 49 3.6. KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOẠI 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT. 57 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả thu thập mẫu từ thực địa 42 Bảng 3.2. Kết quả phản ứng RT-PCR 44 Bảng 3.3. Kết quả phân lập virus LMLM trên lợn 45 Bảng 3.4. Trình tự mồi sử dụng để định type virus LMLM 48 Bảng 3.5. Kết quả định type virus LMLM 49 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc viron của virus LMLM 14 Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc RNA của virus LMLM 14 Hình 1.3. Sự phân bố các type virus LMLM 15 Hình 1.4. Bản đồ dịch tễ dịch bệnh LMLM ở DHMT từ 2003 – 2010 17 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 43 Hình 3.2. Tế bào BHK-21 chưa gây nhiễm 47 Hình 3.3. CPE sau 36h gây nhiễm mẫu bệnh phẩm dịch mụn nước của L1 47 Hình 3.4. Kết quả định type virus LMLM 48 Hình 3.5. Giản đồ giải trình tự tự động nucleotide của chủng virus nghiên cứu 50 Hình 3.6. Trình tự nucleotide của 05 chủng virus LMLM phân lập được 52 Hình 3.7: cây phát sinh chủng loại của 05 chủng virus LMLM phân lập được 1 trên đàn lợn ở tỉnh Thái Bình 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt BHK Baby Hamster Kidney bp Base pair cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium ELISA Enzyme linked immunosorbent Assay KHBT Kết hợp bổ thể FMD Foot and Mouth disease LMLM Lở mồm long móng OIE Tổ chức dịch tễ thế giới ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction UTR Untranslated region WRLFMD World reference laboratory FMD CPE Cytopathic effects DHMT Duyên hải miền Trung Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 MỞ ðẦU ðẶT VẤN ðỀ Ngành Nông nghiệp nước ta chiếm trên 60% tỷ trọng nền kinh tế. Chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi gia súc đã đóng góp lượng thực phẩm lớn cho nhu cầu thịt của toàn dân. Theo Tổng cục Thống kê (GSO) năm 2012, nước ta có tổng đàn trâu 2.627,8 nghìn con, đàn bò 5.194,2 nghìn con, đàn lợn 26,5 triệu con, đàn gia cầm 308,5 triệu con. Đối với đời sống nhân dân, sự phát triển kinh tế của ngành chăn nuôi giữ một vai trò rất quan trọng. Yếu tố ảnh hưởng và luôn đe dọa đến hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi, đến vấn đề môi trường sống và sức khỏe cộng đồng đó chính là dịch bệnh, trong đó phải kể đến dịch bệnh Lở mồm long móng. Bệnh Lở mồm long móng (viết tắt là LMLM) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật móng guốc chẵn như: trâu, bò, lợn, dê, hươu, nai Sự nguy hiểm của bệnh là khả năng lây lan rất nhanh, rất mạnh. Sự lây lan không chỉ do tiếp xúc giữa động vật khoẻ với động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều đường kể cả qua không khí. Vì vậy bệnh thường phát thành đại dịch gây thiệt hại về chăn nuôi, ảnh hưởng đến kinh tế xã hội nhiều nước thuộc nhiều châu lục trên thế giới. Do bệnh không lây sang người nên đôi khi công tác phòng chống dịch bệnh không nhận được sự hưởng ứng và tham gia tích cực của cộng đồng. Bệnh LMLM được xếp vào danh mục các bệnh bắt buộc phải khai báo và Luật Thú y thế giới quy định nước hoặc vùng có bệnh LMLM không được xuất khẩu động vật, sản phẩm động vật và hạn chế xuất khẩu các loại nông sản khác. Mọi quốc gia trên thế giới đều phải quan tâm và có chương trình phòng chống bệnh LMLM. Bệnh thường gây nên những hậu quả nghiêm trọng về các mặt kinh tế, xã hội và bảo vệ môi trường nên được xếp là bệnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 truyền nhiễm nguy hiểm của gia súc, đồng thời cũng được ghi trong các hiệp định buôn bán, vận chuyển động vật và sản phẩm động vật giữa các nước. Bệnh thường gây thiệt hại lớn cho các loài gia súc chăn nuôi cao sản như bò sữa, bò thịt, lợn hướng nạc. Gia súc mắc bệnh thường giảm tăng trọng, giảm sản lượng sữa và là động vật mang trùng vì vậy các nước có nền chăn nuôi, kinh tế phát triển rất quan tâm. Thông thường, bệnh LMLM không làm chết nhiều gia súc, tỷ lệ chết ở gia súc trưởng thành chỉ khoảng 2%, ở gia súc non khoảng 20%. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, tỷ lệ gia súc chết do mắc bệnh rất cao (lên tới 100%). Gia súc khỏi bệnh, cụ thể là trâu bò có thể mang trùng từ 2 đến 3 năm, vì vậy dịch có thể thường xuyên tái phát do khó khăn trong việc quản lý, đánh dấu, cách ly hoặc xử lý gia súc đã mắc bệnh. Việc sử dụng vacxin phòng bệnh được đặt lên hàng đầu sao cho phù hợp với các chủng virus LMLM đang lưu hành ở nước ta. Trong những năm gần đây, được sự quan tâm và chỉ đạo sát sao của Đảng và Nhà nước nên ngành Nông nghiệp nói chung và ngành Chăn nuôi - Thú y nói riêng đã có những bước chuyển biến rõ rệt đặc biệt là trong công tác phòng chống dịch bệnh. Tuy nhiên tình hình dịch bệnh vẫn diễn biến hết sức phức tạp, trong đó có bệnh LMLM vẫn liên tiếp xảy ra ở trong nước cũng như trong khu vực. Do vậy phòng chống dịch bệnh LMLM luôn là chính sách của mỗi Quốc gia trên Thế giới. Virus gây bệnh LMLM là một loại RNA virus, thuộc họ Picornaviridae, giống Apthovirus (Belsham, 1993), có hướng thượng bì. Virus được chia thành 7 serotype: O; A; C; SAT 1; SAT 2; SAT 3 và Asia 1, trong đó mỗi type lại có nhiều subtype khác nhau (Carillo và cs, 2005; Alexandersen và cs, 2002). Trong những năm gần đây ở Việt Nam, ngoài type O đã xuất hiện từ lâu thì các type A, Asia 1 cũng lần lượt xuất hiện tại các ổ dịch LMLM. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 3 Thêm vào đó là hiện tượng virus biến chủng và sự xuất hiện ngày càng nhiều topotype khác nhau. Các serotype này gây bệnh có triệu chứng lâm sàng giống nhau nhưng lại không tạo đáp ứng miễn dịch chéo cho nhau. Chính vì vậy chương trình phòng bệnh bằng vacxin gặp nhiều khó khăn do cấu trúc kháng nguyên khác nhau. Việc xác định chính xác trình tự nucleotide của các chủng virus LMLM, xây dựng thành công cây phát sinh chủng loại để xác định nguồn gốc, mối quan hệ của các chủng virus LMLM gây bệnh tại Việt Nam hiện nay và trước đây là điều kiện quyết định sự thành công để xây dựng chương trình quốc gia phòng chống dịch LMLM và tiến tới thanh toán dịch bệnh bằng vacxin. Xuất phát từ tình hình trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học phân tử của virus Lở mồm long móng phân lập ñược trên ñàn lợn ở tỉnh Thái Bình” MỤC ðÍCH CỦA ðỀ TÀI Nhằm xác định được trình tự nucleotide của virus LMLM phân lập được ở lợn nuôi trên địa bàn tỉnh Thái Bình, từ đó có thể xây dựng được cây phát sinh chủng loại biểu hiện nguồn gốc và mối quan hệ giữa các chủng virus LMLM. Ý NGHĨA KHOA HỌC Nắm được một số đặc tính sinh học phân tử của virus LMLM Làm tài liệu tham khảo, phục vụ các nghiên cứu khoa học khác Ý NGHĨA THỰC TIỄN Nghiên cứu, phát triển, sản xuất và sử dụng hiệu quả vacxin phòng bệnh LMLM [...]... LMLM phân l p ñư c t ñó 2.2 N I DUNG NGHIÊN C U - Thu th p m u nghiên c u, l a ch n m u dương tính v i virus LMLM b ng ph n ng RT-PCR - Phân l p virus LMLM trên môi trư ng t bào BHK21 - ð nh type virus gây b nh b ng ph n ng RT-PCR - Nghiên c u ñ c tính sinh h c phân t c a virus LMLM + Gi i trình t gen c a virus LMLM + So sánh tính tương ñ ng gi a các ch ng virus nghiên c u + Xây d ng cây sinh h c phân. .. dính RNA virus v i m t trong c a capxit ngoài cùng tham gia vào vi c c ñ nh virus trên nh ng t bào, ñóng vai trò quan tr ng nh t trong vi c gây b nh, ñ ng th i là lo i kháng nguyên chính t o ra kháng th ch ng l i b nh LMLM Hình 1.1 C u trúc viron c a virus LMLM Hình 1.2 Sơ ñ c u trúc RNA c a virus LMLM 1.3.2 Phân lo i và phân b các type virus LMLM Virus LMLM thu c h Picornavirideae, gi ng Apthovirus (Belsham,... (Chinsangaram, 2001) phân, nư c ti u, máu, nh ng ch loét hay v i nư c b t trâu, bò, virus có th t n t i t 5-10 ngày sau khi nhi m 180C (Ki u M nh Hùng, 2012) 1.3.4 ð c tính nuôi c y Theo Nguy n Như Thanh và cs (2001) virus LMLM có m t s ñ c tính nuôi c y như sau: - Virus LMLM là m t virus có hư ng thư ng bì, do ñó có th nuôi c y virus trên t ch c da c a thai l n, thai bò còn s ng; trên ñ ng v t thí nghi... a virus LMLM t Châu Á sang Châu Âu, và làm thăng thêm m i lo ng i v ñ i d ch LMLM mang tính toàn c u (Ki u M nh Hùng, 2012) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 28 Chương 2 - ð I TƯ NG, N I DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 ð I TƯ NG NGHIÊN C U Nghiên c u ñư c ti n hành trên ñ i tư ng là l n nghi m c b nh LMLM trên ñ a bàn t nh Thái Bình và các ch ng virus. .. t hi n tr l i trên ñ a bàn t nh Thái Bình Theo Chi c c Thú y Thái Bình, b nh xu t hi n ñ u tiên xã H ng Lý, huy n Vũ Thư (ñư c nghi là “tâm bão” c a d ch LMLM), sau ñó d ch lan ra các xã ðông Kinh huy n ðông Hưng, xã Quỳnh Lâm huy n Quỳnh Ph Trong tháng 2/2012 d ch LMLM ñã x y ra trên ñ a bàn 04 t nh Thái Bình, Hà Giang, Nam ð nh, Hà Nam ð u tháng 02 7 xã thu c 4 huy n c a t nh Thái Bình làm g n 240... gen và ch y máy Bư c 4: phân tích k t qu t các d li u do máy tính cung c p, so sánh k t qu xác ñ nh trình t c 2 m ch ñơn m i, ñ ng th i căn c vào ñ th ñ s a các sai sót và ch n k t qu chính xác nh t 1.6.5 Xây d ng cây phát sinh ch ng lo i Phân lo i virus LMLM d a trên phương pháp cây phát sinh ch ng lo i (phylogentic method) ñang d n thay th các phương pháp truy n th ng d a trên tiêu chu n huy t thanh... 2012) Hình 1.3 S phân b các type virus LMLM Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 15 Virus LMLM type O ñư c chia thành 11 subtype có tính kháng nguyên khác nhau Type A là type có tính kháng nguyên ña d ng nh t, có ñ n 32 subtype ñã ñư c xác ñ nh t ñ u nh ng năm 1970 Các virus type C phân l p Châu Âu, Nam M ñư c chia thành 5 subtype d a trên m i tương quan... NH 1.3.1 Hình thái và c u trúc c a virus Virus LMLM thu c h Picornavirideae, gi ng Apthovirus (Nguy n Vĩnh Phư c, 1978) Virus LMLM là lo i virus nh nh t, không có v b c, có th qua ñư c các máy l c Berkefeld, Chamberland và màng l c Seitz (Nguy n Như Thanh và cs., 2001) Dư i kính hi n vi ñi n t , virus thư ng có hình c u, ñư ng kính 20-28 nm, g m 20 m t ñ i x ng, 30 c nh và 12 ñ nh H t virus ch a 30%... sinh h c phân t th hi n m i quan h di truy n gi a các ch ng virus nghiên c u 2.3 ð A ðI M TH C T P - L y m u l n nghi m c trên ñ a bàn t nh Thái Bình ñ u năm 2012 (tháng 1-3): xã H ng Lý c a huy n Vũ Thư; xã ðông Kinh c a huy n ðông Hưng và xã Quỳnh Lâm c a huy n Quỳnh Ph - Ti n hành phân tích, nghiên c u t i Phòng thí nghi m tr ng ñi m Công ngh sinh h c Thú y – Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i 2.4 NGUYÊN... trình trong nư c nghiên c u v b nh LMLM: Năm 1997, Hoàng M nh Lâm và cs ñã nghiên c u m t s ñ c ñi m d ch t h c b nh LMLM trên trâu bò ðăk Lăk và bi n pháp phòng tr Năm 2000, Nguy n ðăng Kh i và cs ñã s d ng kĩ thu t ELISA ñ ch n ñoán và ñ nh type virus LMLM nư c ta Năm 2003, H ðình Chúc và Ngô Thanh Long ñã s d ng phương pháp 3ABC-ELISA ñ phát hi n kháng th trâu, bò b nhi m virus LMLM, phân bi t v i