1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Lý chọn đề tài: Theo WHO ước tính, năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2% dân số) [40]; máu chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, phải kể đến chế phẩm huyết như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, antivenom [141],[147],[152] đó, huyết kháng nọc rắn (antivenom) loại chế phẩm quan trọng, đặc biệt điều trị rối loạn đông cầm máu nhiễm độc nọc rắn (họ Vipridae) Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi đất nông nghiệp, bờ biển dài 3000 km, Việt Nam có mơi trường thuận lợi cho rắn độc phát triển Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc môi trường nông nghiệp, rừng núi, hải đảo nguy bị rắn độc cắn cao (> 30.000 người /năm [21]); ngồi tổn thất nhân mạng, chi phí điều trị tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng phải truyền hàng chục lít máu huyết tương để cứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai phải truyền ≈ 46 lít máu chế phẩm để cứu người bệnh [174] Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu huyết tương phải sử dụng điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế quan tâm đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8] Đến nay, có số nghiên cứu thành cơng, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23] Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến thiếu trầm trọng nhiều loại HTKNR; ta có hai loại HTKNR cho rắn hổ đất rắn lục tre [8],[165],[166],[171] Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho quốc gia (khuyến cáo WHO) [141],[20],[6] Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, điều trị rắn độc cắn, cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt HTKNR cho loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; lồi đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% loài rắn độc họ rắn hổ (Elapidae) Việt Nam, lồi rắn độc có độc tính cực mạnh, gây tử vong cao (> 80% không cấp cứu điều trị kịp thời) [14] Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn Việt Nam từ trước đến cho thấy: nước ta có hai lồi rắn cạp nia thường gặp, chủ yếu rắn cạp nia nam (Bungrarus candidus) rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus) Đây hai lồi rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” giống nhau, thống nhìn khó phân biệt Hai lồi rắn khác độc tính nọc biểu lâm sàng, chẩn đoán dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu khơng có tác dụng chéo chưa có VDK để chẩn đốn xác định [15] Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho hai loài rắn độc nguy hiểm giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp nia cắn nước Để tăng tính an tồn HTKNR, dạng F(ab’) tối ưu Đồng thời, việc hồn thiện quy trình sản xuất, tiêu chuẩn hóa sản phẩm cần thiết Mục tiêu đề tài: (1) Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’) từ huyết tương ngựa đáp ứng Tiêu chuẩn Việt Nam (Dược điển Việt Nam) (2) Đánh giá chất lượng chế phẩm phòng thí nghiệm Ý nghĩa đề tài đóng góp mới: 3.1 Lần Việt Nam giới sản xuất chế phẩm HTKN-RCN đa giá chống lại nọc độc hai loài RCN thường gặp, nguy hiểm Việt Nam, loài rắn độc vào hàng bậc giới 3.2 Lần hồn thiện chuẩn hóa tồn cơng đoạn quy trình sản xuất, cho sản phẩm HTKNR đạt Tiêu chuẩn Quốc gia huyết kháng nọc rắn điều trị cho người Sản phẩm đạt 9/10 tiêu WHO chất lượng 3.3 Đã sản xuất tinh thành công HTKN-RCN đa giá dạng F(ab’) dạng chế phẩm tiên tiến, hiệu nay, loại bỏ Fc phân tử IgG, giải tận gốc vấn đề an toàn miễn dịch điều trị 3.4 Vấn đề hiệu lực kháng nọc rắn chế phẩm: giải thành công với giải pháp đồng bộ: chọn lựa chủng loại rắn, lấy nọc có chất lượng, làm độc lực nọc giữ tính KN; đảm bảo lịch trình miễn dịch, liều lượng KN + tá dược; theo dõi chăm sóc để ngựa sinh KT tốt nhất, huyết tương có hiệu giá KT cao; theo dõi hình thành KT đặc hiệu; đảm bảo lấy máu vô trùng; tinh chế mảnh F(ab’) giữ tính hoạt động sinh học; tinh F(ab’)2 có nồng độ cao Bố cục luận án: Luận án gồm 128 trang, phần đặt vấn đề kết luận, luận án có chương chính: - Đặt vấn đề: trang - Chương 1: Tổng quan (38 trang) - Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (18 trang) - Chương 3: Kết nghiên cứu (31 trang) - Chương 4: Bàn luận (37 trang) - Kết luận & Kiến nghị: trang Luận án có: 29 bảng, biểu đồ sơ đồ, 63 ảnh hình vẽ (48 ảnh phụ lục), 175 tài liệu tham khảo (40 Tiếng Việt, 114 Tiếng Anh, 21 website), phụ lục Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Máu huyết tương: 1.2 Các loại chế phẩm máu chế phẩm huyết tương: 1.3 Phương pháp tách chiết thành phần huyết tương: 1.3.1 Phương pháp tủa lạnh ethanol 1.3.2 Phương pháp tủa muối 1.3.3 Phương pháp sắc ký 1.3.4 Phương pháp miễn dịch hấp thụ 1.3.5 Phương pháp lọc qua màng ma trận với chất rắn 1.4 Huyết kháng nọc rắn: 1.4.1 Khái niệm 1.4.2 Lịch sử phát minh 1.4.3 Cơ sở miễn dịch học - Kháng nguyên nọc rắn - Kháng thể chống nọc rắn 1.4.4 Các giai đoạn quy trình sản xuất HTKNR 1.5 Tai nạn RCN tình hình NC sản xuất HTKN-RCN 1.5.1 Tình hình tai nạn RCN Việt Nam 1.5.2 Chi rắn cạp nia (Bungarus) Việt Nam 1.5.3 Đặc điểm nọc rắn cạp nia chế bệnh sinh 1.5.4 Tình hình NC, sản xuất HTKN-RCN Việt Nam & Thế giới Chương 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng & vật liệu nghiên cứu: - Đối tượng NC: Nghiên cứu động vật thí nghiệm: rắn cạp nia bắc rắn cạp nia nam, ngựa, thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng - Vật liệu NC: nọc RCN bắc nọc RCN nam đông khô: 3,1 gam 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: NC labo + thực nghiệm động vật 2.2.2 Tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm cần đạt: Bảng 2.1: Tiêu chuẩn Quốc gia (Dược điển Việt Nam IV, 2009) TT Tên tiêu Tiêu chuẩn cần đạt An tồn chung Vơ khuẩn Chí nhiệt tố Hiệu giá KT/lọ pH Đạt an tồn chung Khơng có vi khuẩn, vi nấm Khơng có chất gây sốt Đạt > 100 LD50/lọ (5ml) 6-7 7 Merthiolat Sodium chlorid Nitơ toàn phần ≤ 0,01% 0,85 % - 0,9% ≤ 15 % Bảng 2.2: Tiêu chuẩn cần đạt theo WHO guidelines, 2008 TT 10 Tên tiêu An toàn chung Vơ khuẩn Chí nhiệt tố Hiệu giá KT/lọ pH Hàm lượng chất bảo quản Sodium chlorid Nitơ toàn phần Albumin Globulin Tiêu chuẩn cần đạt Đạt an tồn chung Khơng có vi khuẩn, vi nấm Khơng có chất gây sốt Đạt tiêu chuẩn đăng ký 6–7 Phenol < 2,5 g/l Cresols < 3,5 g/l 0,85 % - 0,9% ≤ 100 g/l ≤1% > 90% 2.2.3 Nội dung nghiên cứu: 2.2.3.1 Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 - Chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực - Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu - Lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu - Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, xác định mức độ tinh sản phẩm 2.2.3.2 Đánh giá chất lượng HTKN-RCN phòng thí nghiệm: - Kiểm định sở, đánh giá tính an toàn hiệu lực chế phẩm - Kiểm định quốc gia, đánh giá an toàn, hiệu lực, đặc điểm lý hóa - Sơ tính giá thành sản xuất, đánh giá hiệu kinh tế, xã hội 2.2.4 Các phương pháp kỹ thuật nghiên cứu: - Tuyển chọn RCN, lấy nọc, bảo quản nọc theo phương pháp Trần Kiên, David Warell [21],[23],[24] - Chế tạo KN đánh giá chất lượng theo phương pháp Trịnh Xuân Kiếm, khuyến cáo WHO, 2008 [151] & Dược điển VN - Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu thử nghiệm Ouchterlony điện di miễn dịch huyết với nọc RCN - Lấy huyết tương theo phương pháp plasmaferesis - Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab')2 theo phương pháp cắt Fc γ- globulin pepsin, tủa phân đoạn với ammonium sulphate, thẩm tích với nước cất, lọc Seize (WHO, 2008 [151]) - Kiểm định sở: đánh giá thử nghiệm an tồn chung, chí nhiệt tố, cấy khuẩn, cấy nấm, xác định LD50 hiệu giá (ED50) - Sau đạt chất lượng kiểm định sở, đóng lọ vô khuẩn 5ml/lọ yêu cầu Kiểm định Quốc gia - Kiểm định sở gồm: thử nghiệm an toàn chung (Safety test), thử nghiệm chất gây sốt (Pyrogens test), thử nghiệm vô khuẩn (Sterility test), thử nghiệm công hiệu (Potency test) Thử công hiệu gồm bước: xác định LD50 nọc RCN theo cơng thức Karber, sau xác định ED50 HTKN-RCN sản xuất - Kiểm định Quốc gia: theo quy trình Viện KĐQGVX&SPYT, gồm: Thử nghiệm an tồn chung Thử nghiệm vơ khuẩn Thử nghiệm chí nhiệt tố Thử nghiệm cơng hiệu (hiệu giá) Nồng độ Protein tồn phần pH Nồng độ NaCl Nồng độ chất bảo quản (Merthiolat) 2.3.5 Thời gian, địa điểm nghiên cứu: - Thời gian nghiên cứu: 6/2008 – 11/2011 - Địa điểm tiến hành: Đơn vị nghiên cứu HTKN, Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai, Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm y tế, Trung tâm nghiên cứu dã ngoại thực nghiệm HVQY, Viện HHTMTW, Bệnh viện 103, Bệnh viện Bạch Mai số địa điểm nghiên cứu Thư Phú, Lệ Mật (Hà Nội), Vũng Tàu 10 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HTKN - RCN ĐA GIÁ F(ab’)2: 3.1.1 Chế tạo KN, đánh giá chất lượngKN Bảng 3.1: Kết tuyển chọn lấy nọc RCN Số rắn lấy nọc (con) Lần 1(114) Lần (185) Lần (122) Cộng (421) SL rắn (con) 84 130 62 276 Cạp nia bắc SL nọc SLNTB (gam) 0,5 5,9 0,6 4,6 0,5 8,0 1,6 5,79 SL rắn (con) 30 55 60 145 Cạp nia nam SL nọc SLNTB (gam) 0,3 10 0,5 9,0 0,7 11,6 1,5 10,3 * Chú thích: SLNTB:số lượng nọc trung bình rắn/lần lấy nọc Bảng 3.2: Đánh giá sơ mức độ thường gặp chi RCN VN Loài rắn Bungarus fasciatus Vùng Miền Bắc Miền Nam (++) (+) Bungarus candidus (-) (+++) Bungarus multicinctu s (+++) (-) Bungarus slowinskii Bungarus flaviceps (+) (-) (-) (-) * Chú thích: Khơng gặp: (-); Gặp số lượng ít: (+) 17 hao hụt (ml) Lô 190 165 25 (13,1%) Lô 510 485 25 (5,2%) 700 650 50 (7,7%) ∑ lần Bảng 3.15 : Số lượng HTKN-RCN F(ab’)2 sản xuất 500 ml Thể tích (ml) 650 Số lượng (lọ) ml 650 130 Tên sản phẩm Đơn vị HTKN-RCN bán thành phẩm HTKN-RCN F(ab’)2 3.1.4.3 Xác định độ tinh HTKN-RCN bán thành phẩm: Bảng 3.17: Định lượng protein, albumin, globulin, IgG, IgG, IgM, tỷ lệ A/G huyết ngựa HTKNRCN F(ab’)2 Xét nghiệm Huyết ngựa HTKN-RCN F(ab’)2 Số lượng Tỷ lệ 18 Protein (g/l) 87,1 49,8 100 % Albumin (g/l) 28,7 1,4 Globulin (g/l) 58,4 IgG (mg/dl) 865 48,4 203 2,141 g/l 2,8 % 100% 97,2 % IgM (mg/dl) 67,8 8,6 IgA (mg/dl) 6,3 2,5 Tỷ lệ A/G 0,49 ≈ 4,4% 0,03 Hình 3.6 So sánh hình ảnh điện di protein huyết ngựa (trái) điện di protein huyết HTKN- 19 RCN F(ab’)2 (phải): (Hình ảnh hai đỉnh rõ rệt albumin, globulin khơng cịn điện di HTKN-RCN, cịn lại hình ảnh đỉnh tương ứng với dải phân bố albumin - định lượng albumin lượng nhỏ 2,8% Điều cho thấy F(ab’)2 chiếm tỷ lệ cao gần tuyệt đối) 3.2 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM: 3.2.1 Kiểm định chất lượng sở: Bảng 3.18: Thử nghiệm an toàn chuột lang TT Trọng lượng (gam) HTKN (ml) Theo dõi chuột thí nghiệm Trọng lượng 320 325 Tuần 340 343 350 355 +25 358 363 370 +20 Tuần Tuần 310 3,1 330 3,3 350 3,5 Rụng lông Tăng trọng lượng (gam) +30 Bảng 3.19: Tìm chất gây sốt HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 20 TT Trọng Thể tích lượng HTKN Nhiệt độ thỏ trước/sau tiêm HTKN RCN (oC) Chênh lệch Trước Sau h Sau h Sau h 2,8 2,8 39,3 39,6 39,8 39,3 + 0,5 2,8 2,8 39,4 39,7 39,8 39,4 + 0,4 3,0 3,0 39,6 39,8 39,9 39,6 + 0,3 Bảng 3.20: Kiểm tra mức độ vô khuẩn HTKN-RCN Lô HTKNRCN Lô I Lô II Môi trường Sabouraud Ngày Âm tính Âm tính Ngày Âm tính Âm tính Ngày 14 Âm tính Âm tính Mơi trường Thioglycolate Ngày Ngày Ngày Âm Âm Âm tính tính tính Âm Âm Âm tính tính tính Bảng 3.21: Xác định liều chết 50% (LD50) nọc RCN Việt Nam TT Nồng độ nọc Số nọc/ chuột Theo dõi chuột thí nghiệm Tỷ lệ chuột chết 21 Chết Sống Tổng số 22,50 4,5 8 100,00 15,00 3,00 87,50 10,00 2,00 4 50,00 6,66 1,33 12,50 4,44 0,88 8 0,00 0 8 0,00 Bảng 3.22: Xác định Hiệu lực (công hiệu) HTKN rắn cạp nia Tình trạng chuột NC Chết Sống + Lô HTKN -RCN (ml) Đệm BPS Nọc RCN 40 LD50 (ml) Số LD50/ chuột 0.000 2.000 0.000 0 8 0.000 1.000 1.000 8 0.060 0.940 1.000 0.070 0.930 1.000 4 22 0.080 0.920 1.000 8 3.2.2 Kết kiểm định quốc gia chất lượng HTKN-RCN: Bảng 3.23: Kết Kiểm định Quốc gia chất lượng HTKN-RCN TT Tên thử nghiệm Kết An toàn chung Đạt yêu cầu chất gây sốt Đạt yêu cầu Vô khuẩn Đạt yêu cầu Hiệu giá 267,5 LD50/lọ NaCl 0,87% pH 7.012 Nồng độ Protein 7,43 mg/ml Nồng độ Merthiolate g% Chương 4: BÀN LUẬN 4.1 BÀN VỀ SẢN XUẤT HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 THEO TIÊU CHUẨN VIỆT NAM, DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM IV, 2009: 4.1.1 Chế tạo KN: 23 - Tuyển chọn rắn, lấy nọc: tuyển chọn rắn, lấy nọc công đoạn quan trọng quy trình sản xuất Nọc rắn lồi RCN dự định chế tạo HTKN-RCN đa giá phải có chất lượng tốt, đại diện cho quần thể loài RCN Việt Nam Sau lần tiến hành thu gom lấy đủ số lượng nọc cần thiết lồi RCN bắc nam Nọc RCN ít, khó lấy nguy hiểm (bảng 3.1) - Xác định loại rắn khoang thường gặp Việt Nam: Việt Nam có nhiều lồi rắn khoang “khúc đen, khúc trắng”, dễ nhầm lẫn với (bảng 3.2) B candidus, B multicinctus Rắn khoang sông Hồng (B slowinskii), RCN nam RCN bắc lồi thường gặp, có số lượng nhiều tự nhiên, cần sản xuất antivenom phục vụ điều trị, loài khác gặp - Kết chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá, giảm độc lực: Sử dụng g nọc nguyên chất loài RCN, chế tạo 272,8 ml dung dịch KN nọc RCN giảm độc lực Đã phân chia số lượng KN loại thể tích khác vào liều KN miễn dịch lịch trình dự kiến trọng lượng ngựa nghiên cứu Đóng lọ theo nhóm tích từ 0,1 ml đến ml, chia bậc cho tháng gây mẫn cảm cho ngựa Số lượng KN chế tạo đủ dùng nghiên cứu, phịng tình ngựa chết, nghiên cứu thất bại lưu trữ phục vụ kiểm tra chất lượng HTKNR (bảng 3.3) - Kiểm tra chất lượng KN: bảng 3.4, 3.5, 3.6 cho thấy: chất lượng KN đạt yêu cầu an tồn chung, vơ khuẩn, khơng có chất gây sốt gây mẫn cảm cho động vật thí nghiệm Với loại độc tố có độc lực mạnh 24 với sinap thần kinh – nọc RCN, chế tạo KN để gây mẫn cảm không đảm bảo, gây chết động vật Khử độc tính nọc rắn, giữ lại tính KN độc tố mục đích chế tạo KN Q trình khử độc với glutheraldehyde, vi khuẩn bị tiêu diệt phần lớn; vi khuẩn, vi nấm bị loại bỏ lọc qua màng lọc Ø 0,2 µm Trong q trình chế tạo KN (lấy nọc, khử độc nọc, tiến hành ly tâm, bỏ cặn, thu dung dịch KN, lọc vô trùng, chiết vào lọ nhỏ, đóng nắp lọ, ), yêu cầu vô khuẩn, loại trừ chất gây sốt tuân thủ nghiêm túc (bảng 3.5, 3.6) 4.1.2 Quy trình gây mẫn cảm ngựa, theo dõi đáp ứng miễn dịch: - Lịch trình miễn dịch ngựa, liều lượng KN tá dược: Cách tháng/lần khoảng thời gian bảo đảm an toàn cho ngựa sau miễn dịch (liền vết loét, mệt, yếu, ) đồng thời khoảng thời gian cần thiết cho trình đáp ứng miễn dịch xảy (theo WHO, cần từ 3-8 tuần) Liều KN gây mẫn cảm tăng dần, kết hợp với tá dược Freund gây kích thích đáp ứng miễn dịch thứ phát hệ miễn dịch ngựa Tá dược Freund sử dụng gồm loại: CFA IFA Đây huyền dịch KN nhũ hóa (emulsify) dầu khoáng, để tăng cường độ đáp ứng miễn dịch (immunopotentiator) Nhiều tác giả sử dụng phương pháp kết hợp KN CFA để tăng mạnh hiệu giá KT cho thấy hiệu rõ rệt Pratanaphon R cộng (1997), trộn lẫn KN nọc rắn hổ đất Thái Lan với tá dược khác như: CFA đơn (50% CFA + 50% KN), CFA với tỷ lệ 25% (75% KN 25% CFA), KN + vắc xin 25 nội độc tố uốn ván (tetanus toxoid), KN + vắc xin nội độc tố bạch hầu (diphtheria toxoid ) với tỷ lệ khác nhau, thu kết tốt, hiệu giá KT tăng cao mạnh mẽ thời gian ngắn so với nhóm chứng dùng KN tá dược bentonite gel - Theo dõi sức khỏe ngựa sau lần miễn dịch: Tiêm KN tá dược CFA lần thứ ngựa thấy ngựa mệt mỏi, bỏ ăn, yếu bại, nằm chỗ lười vận động; chỗ tiêm bình thường Lần tiêm thứ nhắc lại sau tháng, thấy ngựa bỏ ăn ăn kém, chỗ tiêm xuất vết loét, đường kính 3-7 cm Những lần tiêm với tá dược IFA, không xảy lt chỗ tiêm; biểu tồn thân bình thường, ngựa lại, ăn uống tốt, dáng điệu khỏe mạnh Hiện tượng loét da xảy sau miễn dịch ngựa tá dược CFA lần thứ 2,3 không loét lần gây mẫn cảm với tá dược IFA (bảng 3.8) (có thể CFA có BCG chết?) Theo WHO, tiêm lần CFA hạn chế tiêm điểm số lượng lớn KN + tá dược, nhiên nhóm nghiên cứu khơng tn thủ điều này; ngựa sống đáp ứng miễn dịch xảy bình thường, song việc chăm sóc vất vả hơn; không chứng minh hiệu đáp ứng miễn dịch cao so với hướng dẫn WHO - Theo dõi hiệu giá KT sau miễn dịch: Sau miễn dịch lần, hiệu giá KT đặc hiệu với KN nọc RCN tăng lên mức 2048 ngựa ổn định sau lần miễn dịch thứ Như vậy, lấy máu sớm sau lần miễn dịch KN nọc RCN tá dược Kết bảng 3.9 cho thấy, với ngựa khỏe, có cân nặng 26 tương đương nuôi địa điểm khác nnhau, liệu trình miễn dịch với liều lượng nhau, cho kết hiệu giá KT khác Điều gợi ý: chế độ chăm sóc dinh dưỡng đóng vai trị quan trọng đáp ứng miễn dịch ngựa - Xác định tính đặc hiệu KT ngựa với KN nọc: Dùng thử nghiệm Ouchterlony kiểm tra sau gây mẫn cảm, thấy xuất vết tủa KN - KT thạch, chứng tỏ máu ngựa hình thành KT chống KN nọc RCN Pha huyết với nồng độ khác để xem xét mức độ hình thành KT Khi sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, làm điện di miễn dịch với KN nọc RCN, thấy xuất rõ vết tủa KN-KT thạch, điều khẳng định hiệu lực sinh KT đặc hiệu KN tốt (hình 3.4, 3.5) 4.1.3 Lấy máu, tách huyết tương, truyền trả khối hồng cầu: - Lấy máu vô trùng, máu không bị đông, không vỡ HC, ngựa lấy máu đảm bảo an toàn; máu lấy xong tách huyết tương để truyền trả lại khối HC cho ngựa (bảng 3.10) - Khi thu huyết tương cần ý lượng máu lấy sức khỏe ngựa; máu lấy đủ để sản xuất ngựa bình thường Theo bảng 3.11, lấy máu 3,5 lít, ngựa khơng có biểu Khi lấy 3,6 > 5,4 lít máu, tùy theo ngựa, khả chịu đựng khác nhau, mức độ phản ứng với lấy máu khác Trong khoảng khối lượng máu lấy trên, có biểu bất thường, xử lý dừng lấy máu kịp thời, ngựa an tồn, khơng nguy hiểm Mức độ lấy máu nhiều 5,5 lít/ngựa, khơng ý xảy an toàn 27 cho ngựa shock máu 4.1.4 Để tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đạt chất lượng cao: - Cắt Fc, tủa phần protein KT kháng nọc RCN, lọc bỏ tủa, thu dịch lọc chứa nhiều F(ab’)2: Phân tử KT IgG nguyên vẹn có mảnh Fc, nguyên nhân phản ứng không mong muốn lâm sàng, shock phản vệ Fc mang thụ thể gắn tế bào mastocyte, bạch cầu ưa kiềm kho chứa chất trung gian hóa học histamin, serotonin, bradykinin gây phản vệ, loại phản ứng nguy hiểm kháng huyết trị liệu Chúng sử dụng Pepsin để cắt bỏ Fc, giữ lại phần F(ab’) Tỷ lệ thu lại huyết tương giàu F(ab’)2 với lần tinh chế 80,4% (bảng 3.12) Như vậy, ~ 20% lượng tủa huyết tương chứa thành phần khơng có KT F(ab’)2 Đây cần thiết cho tinh sản phẩm Tủa ammonium sulfate có lợi điểm: giữ ngun tính chất phân tử KT, F(ab’) 2, song hiệu xuất thu lại KT so với kỹ thuật tinh chế khác sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange chromatography) sắc ký lực (Affinity chromatography) Ammonium sulfate có khả hòa tan cao tới nồng độ 4M, nồng độ 3,2M, hầu hết loại protein bị tủa Chỉ sau 30-60 phút hòa tan ammonium sulfate theo nồng độ chọn lọc, toàn protein tương ứng bị tủa Khi tái hòa tan hạt protein kết tủa đệm mới, cấu trúc phân tử hoạt tính sinh học protein giữ nguyên Một số muối tủa theo protein, loại bỏ thẩm tích Như vậy, dung dịch protein thành phẩm (thí dụ: HTKNR) vừa tinh 28 vừa cô đặc, giữ nguyên chức sinh học KT Tất nhiên, nồng độ tính chất ammonium sulfate ra, tủa protein cịn phụ thuộc vào pH nhiệt độ dung môi Ở pH = 4,2 nhiệt độ 20oC, với nồng độ ammonium sulfate = 14%, thành phần protein KT, kể Fc lipid bị tủa, loại bỏ giấy lọc Whatman; dịch lọc chứa F(ab') thu lại - Tủa F(ab’)2 với ammonium sulfate, lọc thu tủa giấy lọc Whatman, thẩm tích lọc vô trùng tạo HTKN-RCN F(ab’)2 Khi điều chỉnh pH dịch lọc lên 6.8/20oC, thêm ammonium sulfate tới 36%, trộn đều, sau 60 phút tủa toàn F(ab')2 với muối ammonium sulfate (bảng 3.13) Thẩm tích loại bỏ ammonium sulfate khỏi tủa giàu F(ab’)2 Lọc vơ trùng màng lọc cellulose acetatae có kích thước lỗ lọc 0.2 µm, tạo HTKN-RCN F(ab')2 dạng bán thành phẩm Bảng 3.14 cho thấy: lọc nhiều huyết tương lần tiết kiệm Ở đây, lần lọc giảm 25 ml HTKN-RCN dạng F(ab’) 2, tương đương lọ, lọ có giá sản xuất chừng 70 USD (bảng 3.24), giảm khoản chi phí đáng kể (do dùng máy lọc Seiz, kiểu cũ; lọc với máy mới, chất lượng tốt hơn, thời gian lọc nhanh hơn, tiết kiệm nhiều HTKNR hơn) Bảng 3.15 số hóa chất sử dụng tinh chế HTKN-RCN Kết hợp với bảng 3.24, thấy số lượng kinh phí cho cơng đoạn tinh chế không lớn Đây kỹ thuật dễ thực hiện, đơn giản, quy mô nhỏ, phục vụ nhu cầu đối tượng BN không lớn Bảng 3.16 cho thấy tinh chế 650 ml HTKN-RCN F(ab’) dạng bán 29 thành phẩm sau kiểm định sở đạt yêu cầu, đóng lọ ml, 130 lọ HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 thành phẩm - Xác định độ tinh HTKN-RCN đa giá F(ab’)2: Theo tiêu chuẩn Việt Nam chất lượng HTKNR, yêu cầu số protein toàn phần phải < 150 g/l (tiêu chuẩn WHO < 100g/l) (bảng 2.1, 2.2) Sản phẩm HTKNR sản xuất có lượng protein 49,8g/l (bảng 3.17), đạt tiêu chuẩn Việt Nam WHO Lượng F(ab’)2 đặc hiệu chống nọc RCN chiếm 95,6% (= 46,26 g/l) tổng số lượng protein 49,8 g/l cho thấy kết tinh chế hiệu quả, HTKN-RCN chế tạo có độ tinh cao; lượng albumin chiếm 1,4 g/l (= 2,8%) (bảng 3.17) đạt tiêu chuẩn Việt Nam chưa đạt tiêu chuẩn WHO 4.2 BÀN VỀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM: 4.2.1 Kiểm định sở & vấn đề kiểm sốt chất lượng: 4.2.1.1 Tính “An tồn” chế phẩm: Kết thử nghiệm an toàn chuột lang Cobay (bảng 3.18), thử nghiệm chí nhiệt tố (bảng 3.19) thỏ, kết cấy khuẩn (bảng 3.20) cho thấy HTKN-RCN nghiên cứu sản xuất đạt tiêu chuẩn an tồn, vơ khuẩn khơng có chất gây sốt 4.2.1.2 Hiệu lực chế phẩm nghiên cứu: 30 - Xác định LD50: theo bảng 3.21, xác định liều chết trung bình nọc RCN Việt Nam (gồm loài RCN bắc RCN nam) 2,17 µg/chuột nhắt trắng (18 - 20g) Việc tính tốn theo công thức Karber lựa chọn dễ sử dụng, dễ tính tốn so với cơng thức tính LD50 khác mà đảm bảo độ xác - Xác định ED50: Xác định hiệu lực trung hòa nọc 50% (ED 50) HTKNR tiêu chuẩn so sánh HTKNR lô sở sản xuất với sở khác Chuột nhắt trắng nên dùng nhóm 5-6 con, trọng lượng 18-20 g/con Dung dịch nọc cố định trộn với HTKNR (tăng dần) Theo dõi số lượng chuột sống 50% sau tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nọc - LD 50 HTKNR/24 để xác định khả bảo vệ (hay hiệu lực) HTKNR Bảng 3.22 cho thấy, liều hiệu lực trung hịa, có khả giải độc cứu người HTKN cạp nia (ED50)= 57.14 LD50/ml = 124.2 µg/ml Kết phù hợp với “Phiếu trả lời kết kiểm định số: 00610/SPĐT-NC (bảng 3.23) Viện Kiểm định quốc gia Vắc xin Sinh phẩm y tế, Bộ y tế 4.2.2 Kiểm định chất lượng cấp Quốc gia: Kết bảng 3.23 cho thấy: HTKN-RCN đa giá F(ab’) đề tài nghiên cứu đạt toàn tiêu chuẩn chất lượng Việt Nam, theo Dược điển Việt Nam IV, 2009 mục tiêu nghiên cứu đề Tham khảo đối chiếu với Tiêu chuẩn chất lượng HTKNR WHO, 2008 (bảng 2.2), thấy: HTKN-RCN đề tài đạt 9/10 tiêu chuẩn quan trọng theo tiêu chuẩn WHO (bảng 2.2 bảng 3.17) 31 KẾT LUẬN Đã xác lập quy trình sản xuất sản xuất thành công lần Việt Nam giới HTKNRCN đa giá F(ab’)2 hai loài RCN Bungarus multicinctus Bungarus candidus Sản phẩm chuẩn hóa theo Tiêu chuẩn quốc gia, Dược điển Việt Nam IV, 2009 HTKNR dùng cho người theo Khuyến cáo WHO, (Guidelines, 2008) Phương pháp tinh chế có hiệu cao tập trung cô đặc tinh mảnh F(ab’)2, yếu tố cần thiết để trung hòa độc tố nọc RCN, với mức độ đặc globulin đạt 97,2%; F(ab’)2 chiếm 95,6%; lượng albumin loại bỏ gần hồn tồn (chỉ cịn 2,8%) HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ ngựa khẳng định tính “An tồn” “Hiệu lực” phịng thí nghiệm qua Kiểm định chất lượng cấp sở Kiểm định quốc gia Sản phẩm xác nhận đạt tất tiêu (8/8) tính an tồn (an tồn chung, chí nhiệt tố, vơ khuẩn tiêu chuẩn lý hóa: pH, nồng độ merthiolat, nồng độ NaCl, hàm lượng protein) có hiệu giá 267,5 LD50/lọ (5ml), trung hịa 620 µg nọc rắn cạp nia ... dung nghiên cứu: 2.2.3.1 Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 - Chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực 8 - Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu - Lấy máu, thu huyết tương, ... hồng cầu - Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, xác định mức độ tinh sản phẩm 2.2.3.2 Đánh giá chất lượng HTKN-RCN phịng thí nghiệm: - Kiểm định sở, đánh giá tính an tồn hiệu lực chế phẩm - Kiểm định... với chất rắn 1.4 Huyết kháng nọc rắn: 1.4.1 Khái niệm 1.4.2 Lịch sử phát minh 1.4.3 Cơ sở miễn dịch học - Kháng nguyên nọc rắn - Kháng thể chống nọc rắn 1.4.4 Các giai đoạn quy trình sản xuất