Đang tải... (xem toàn văn)
Luận án tiến sĩ sinh học Phạm Văn Phúc Chuyên ngành: Sinh lý Người và Động vật Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM Ung thưvú (UTV) là một bệnh phức tạp. Nhiều nghiên cứu đã tiến hành đểtìm ra nguyên nhân và phương pháp điều trị căn bệnh này. Trong 20 năm qua, tỉlệtửvong do UTV đã giảm nhiều. Sựgiảm này là do sựphát triển các kĩthuật chẩn đoán sớm và các liệu pháp trị liệu hiệu quả, kểcảcác liệu pháp bổtrợ. Tuy nhiên, vẫn có đến 50% khối u vú không đáp ứng thuốc, cũng nhưkháng với các liệu pháp này và có hơn 70% bệnh nhân sẽtái phát sau 5 năm điều trị. Nguyên nhân của tình trạng này là sựtồn tại của tếbào gốc ung thưvú (TBGUTV) trong tất cảcác khối u vú. Những TBGUTV được cho là nguồn gốc của các khối u và đóng góp vào sựdi căn và tái phát trong bệnh nhân UTV. Do đó, liệu pháp tấn công vào TBGUTV được xem là liệu pháp mới và hứa hẹn.
9 Pham PV, Vu NB, Duong TT, Nguyen TT, Truong NH, Phan NLC, Vuong TG, Pham VQ, Nguyen HM, Nguyen KT, Nguyen NT, Nguyen KG, Khat LT, Le DV, Truong KD, Phan NK (2012) “Suppression of human breast tumors in NOD/SCID mice by CD44 shRNA gene therapy combined with doxorubicin treatment” OncoTargets and Therapy 2012(5), pp.77-84 ! ! ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM VĂN PHÚC PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ VÚ NGƯỜI VIỆT NAM VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Sinh lý Người Động vật Mã số: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh năm 2012 Cơng trình hồn thành PTN Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Trương Đình Kiệt TS.BS Lê Văn Đơng Phản biện 1: GS.TS Trần Linh Thước Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Sào Trung Phản biện 3: TS Huỳnh Nghĩa Phản biện độc lập 1: PGS.TS Trần Cát Đông Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Đăng Quân Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp sở đào tạo họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM vào hồi 14 00 ngày 16 tháng 11 năm 2012 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM Thư viện Trường Đại học KHTN, Đại học Quốc gia Tp.HCM DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC Phạm Văn Phúc, Lê Thành Trung, Trương Hải Nhung, Vương Gia Tuệ, Dương Thanh Thủy, Phan Kim Ngọc (2010) “Thu nhận tế bào ung thư từ khối u vú”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 8(4), tr.1775-1783 Phạm Văn Phúc, Chi Jee Hou, Lê Văn Đông, Trương Đình Kiệt, Phan Kim Ngọc (2010) “Biệt hóa in vitro tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người thành tế bào tua”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 8(3B), tr.1111-1120 Pham Van Phuc, Tran Thi Thanh Khuong, Le Van Dong, Truong Dinh Kiet, Tran Tung Giang and Phan Kim Ngoc (2010) “Isolation and characterization of breast cancer stem cells from malignant tumours in Vietnamese women”, Journal of Cell and Animal Biology, 4(12), pp.163–16 Pham Van Phuc, Siah Chia Keng, Nguyen Thi Minh Nguyet, Duong Thanh Thuy, Phan Kim Ngoc (2010) “Isolation and comparison of tumorigenicity of different cell population in MCF-7 breast cancer cell line based on CD44 and CD24 markers”, Journal of Biotechnology, 8(4), pp.13-19 Phuc PV, Lam DH, Ngoc VB, Thu DT, Nguyet NTM, Ngoc PK (2011) “Production of functional dendritic cells from menstrual blood—a new dendritic cell source for immune therapy”, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 47(5-6), pp.368-375 Pham Van Phuc, Chi Jee Hou, Nguyen Thi Minh Nguyet, Duong Thanh Thuy, Le Van Dong, Truong Dinh Kiet and Phan Kim Ngoc (2011) “Effects of breast cancer stem cell extract primed dendritic cell transplantation on breast cancer tumor murine models”, Annual Review & Research in Biology, 1(1), pp.1-13 Phuc PV, Nhan PLC, Nhung TH, Tam NT, Hoang NM, Tue VG, Thuy DT, Ngoc PK (2011) “Downregulation of CD44 reduces doxorubicin resistance of CD44+CD24- breast cancer cells”, OncoTargets and Therapy, 4, pp.71-7 Phuc V Pham, Nhan LC Phan, Nhung T Nguyen, Nhung H Truong, Thuy T Duong, Dong V Le, Kiet D Truong and Ngoc K Phan (2011) “Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy”, Journal of Translational Medicine, 9(1), p.209 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú (UTV) bệnh phức tạp Nhiều nghiên cứu tiến hành để tìm nguyên nhân phương pháp điều trị bệnh Trong 20 năm qua, tỉ lệ tử vong UTV giảm nhiều Sự giảm phát triển kĩ thuật chẩn đoán sớm liệu pháp trị liệu hiệu quả, kể liệu pháp bổ trợ Tuy nhiên, có đến 50% khối u vú khơng đáp ứng thuốc, kháng với liệu pháp có 70% bệnh nhân tái phát sau năm điều trị Nguyên nhân tình trạng tồn tế bào gốc ung thư vú (TBGUTV) tất khối u vú Những TBGUTV cho nguồn gốc khối u đóng góp vào di tái phát bệnh nhân UTV Do đó, liệu pháp công vào TBGUTV xem liệu pháp hứa hẹn Trong 5-10 năm qua, nhiều đặc điểm tế bào gốc ung thư (TBGUT) xác định sử dụng đích cơng số chiến lược trị liệu Vài đích cơng TBGUTV sử dụng thử nghiệm lâm sàng; số có số phát triển trở thành thuốc điều trị thường quy cho UTV Tuy nhiên, phức tạp kiểu hình UTV chủng tộc vùng địa lý, mà hiệu điều trị UTV liệu pháp thấp Mặc dù chưa có số liệu hiệu liệu pháp điều trị UTV bệnh nhân Việt Nam, nhà nghiên cứu nhiều quốc gia cho thấy có đến 50% khối u không đáp ứng với liệu pháp kháng thuốc Vì thế, nghiên cứu đặc điểm TBGUTV phân lập từ khối u người phụ nữ Việt Nam tìm kiếm phương pháp trị liệu nhằm cải thiện hiệu điều trị UTV bệnh nhân Việt Nam cần thiết Từ hiểu biết mình, chúng tơi thấy liệu pháp gen liệu pháp miễn dịch hai hướng điều trị phù hợp sử dụng để cơng TBGUTV Vì thế, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với tên đề tài “Phân lập, xác định đặc điểm tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam bước đầu ứng dụng điều trị thực nghiệm” nhằm phát triển liệu pháp để công TBGUTV dựa vào liệu pháp gen liệu pháp miễn dịch Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu là: - Phân lập nuôi cấy tế bào ung thư vú (TBUTV) từ khối u vú ác tính người Phụ nữ Việt Nam - Phân lập nuôi cấy TBGUTV từ quần thể TBUTV phân lập - Thiết lập số bước liệu pháp gen liệu pháp miễn dịch để công TBGUTV thực nghiệm Vấn đề yếu nghiên cứu thiết lập dòng TBGUTV Việt Nam từ khối u vú ác tính mà ngun liệu quan trọng để tiến hành nghiên cứu để sử dụng liệu pháp gen liệu pháp miễn dịch công TBGUTV để điều trị UTV CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sự tồn TBGUT giúp giải thích làm thay đổi hóa mơ mơ phản ánh cấp độ ác tính khối u Với đặc điểm tương tự tế bào gốc (TBG), TBGUT gây xâm lấn mạnh (bởi tính tự làm mới) gây dị hợp kiểu hình biệt hóa mạnh khối u (bởi khả biệt hóa) (Kakarala & Wicha, 2008; Shay & Wright, 2010) TBG trưởng thành thường tăng sinh chậm tế bào biệt hóa, chúng gia tăng tuổi thọ Vì nguyên nhân này, chúng tiếp xúc với nhiều tác nhân gây đột biến tế bào biệt hóa, chúng tích lũy nhiều đột biến Và đột biến truyền sang hệ cháu (gọi tế bào tăng sinh nhanh hay tế bào khuếch đại chuyển tạm thời) (Dontu et al., 2003) Điều có nghĩa cháu TBG trưởng thành bình thường TBGUT Nghĩa khối u thu nhận TBG bình thường TBGUT TBGUT thừa hưởng nhiều đặc điểm TBG bình thường Thật vậy, số nhà nghiên cứu cho thấy TBGUT chia sẻ số đường truyền tín hiệu với TBG số marker Chẳng hạn, đường truyền tín hiệu Notch biểu mạnh TBGUTV TBG tuyến vú (Farnie and Clarke, 2007) Vấn đề TBGUT khả tạo khối u từ vài tế bào, dễ dàng gây nên tái phát khả kháng mạnh với hóa chất xạ trị Sự tái phát cao tính tự làm khả kháng mạnh với hóa chất tia xạ Bởi đặc tính TBG TBGUT biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác tạo khối u dị hợp kiểu hình (Campbell & Polyak, 2007) Mặc dù tế bào trưởng thành thiếu khả tự làm tiềm tăng sinh thấp (Ginestier et al., 2007), tế bào trưởng thành TBG hình thành TBGUTV (Dontu et al., 2003) Thật vậy, tế bào trưởng thành hay tế bào tiền thân ĐỀ NGHỊ trở thành TBG thơng qua q trình khử biệt hóa – q trình mà Nghiên cứu có số giới hạn Để ứng dụng liệu từ tế bào trưởng thành đạt đặc điểm TBG pháp gen làm giảm biểu CD44 liệu pháp tế bào tua nạp kháng (Cobaleda et al., 2007) nguyên TBGUTV lâm sàng, số thí nghiệm cần Phát TBGUT khối u vú báo cáo tiến hành: vào năm 2003 Al-Hajj cs Họ phát quần thể nhỏ tế Đánh giá tính an tồn cấu trúc vector shRNA CD44, bào có biểu marker bề mặt CD44+CD24-/lowESA+ Lin- nghiên cứu cải tiến để làm giảm độc tính hay (không biểu CD2, CD3, CD10, CD16, CD18, CD31, CD64 thay hệ vector khác phương pháp khác để CD140b) Chỉ với 200 tế bào này, chúng gây khối u tiêm điều hịa giảm biểu CD44 với hiệu tương tự vào chuột NOD/SCID 104 tế bào khơng biểu marker Đánh giá tác động phụ liệu pháp tế bào tua, đặc khơng thể gây khối u (Al-Hajj et al., 2003) Khối u có kiểu hình dị hợp, chứa quần thể tế bào có kiểu hình TBG ban đầu CD44+CD24-/dimLin- tiếp tục gây u cấy vào chuột liên tục nhiều lần (Al-Hajj et al., 2003) sử dụng hiệu người Nghiên cứu biến đổi nhiều đường truyền tín Sau kiểu hình CD44+CD24- sử dụng để xác định tách TBGUT với khả gây u tăng cao Thật vậy, khối cầu (mammosphere) thu từ việc ni TBUTV có kiểu hình CD44+CD24/dim biệt đáp ứng miễn dịch mà gây bệnh tự miễn Đánh giá liều vector lentivirut hay liều tế bào tua hiệu liên quan đến điều hòa giảm biểu CD44 TBGUTV Tối ưu hóa việc đánh giá hiệu điều trị UTV tế gây u mạnh tiêm vào chuột NOD/SCID Tuy nhiên, bào tua mô hình chuột nhân hóa hệ miễn dịch; sử cần tế bào CD44+CD24-/low hình thành nên khối cầu dụng hệ thống quét tín hiệu để đo di kích thích (Ponti et al., 2005) Thật vậy, dòng TBUTV chứa đến 90% khối u thay quan sát khối u mắt thường TBGUTV CD44+CD24-/low có khả gây u khơng cao dịng tế bào mà chứa 5% tế bào có kiểu hình (Fillmore & Kuperwasser, 2008) Điều cho thấy quần thể nhỏ tế bào có kiểu hình CD44+CD24-/low có khả tự làm sinh u Do liệu pháp cơng TBGUTV xem xét liệu pháp tốt để loại bỏ tái phát kháng với hóa xạ trị điều trị UTV 21 doxorubicin, trọng lượng khối u giảm đáng kể đến 4,38 lần so với nhóm đối chứng CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phân lập TBUTV từ khối u vú ác tính Bước đầu thiết lập thành cơng liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào tua nạp kháng nguyên TBGUTV mơ hình chuột TBUTV phân lập từ khối u vú bệnh nhân đồng ý tự nguyện cho mẫu Về bản, khối u rửa Tế bào tua từ tủy xương chuột sản xuất thành công sử cắt thành từ mảnh nhỏ Những mẩu mô nuôi điều kiện dụng chúng liệu pháp tế bào tua Nếu chuột điều trị vào thích hợp Trong nghiên cứu có hai loại mơi trường ni sử ngày 10 sau tiêm TBGUTV, có đến 60,0 ± 20% chuột khơng hình dụng để ni tế bào từ mảnh mô Trong giai đoạn 1, sử dụng thành khối u sau tiêm tế bào tua nạp kháng nguyên TBGTV sau môi trường biến đổi từ Speirs et al (1998) Trong giai đoạn 2, 18 ngày Trong có đến 100% chuột mang khối chuột đối sử dụng loại mơi trường khác, M171 bổ sung với chứng (tiêm PBS) sau 15 ngày Có 0,095±0,018% tế bào tua tồn yếu tố kích thích phát triển tế bào biểu mô tuyến vú MEGS tách vào ngày sau ghép Lượng tế bào CD8 CD45 Invitrogen Ltd lô ghép tế bào tua tăng cao so với chuột đối chứng Các tế bào thu nhận đánh giá biểu marker CD24 hóa tế bào miễn dịch phân tích phần trăm tế bào biểu CD24 CD90 kĩ thuật flow cytometry Trong nghiên cứu này, tiến hành loại bỏ tế bào tạp nhiễm kĩ thuật tách tế bào âm tính với marker CD90 Sau thu nhận quần thể TBUTV, tiến hành xác định đặc điểm tế bào như: khả gây u in vivo mơ hình chuột, biểu gen Brca1, biểu gen liên quan đến hình thành khối u di Cyclin D1, Cyclin E2, EGFR, Mucin Myc Cuối cùng, dòng tế bào thu nhận được phát nhiễm mycoplasma 2.2 PHÂN LẬP TBGUTV TBGUTV ứng viên phân lập tách quần thể CD44+CD24- Các TBGUTV ứng viên nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung 10% FBS 1% antibiotic-mycotic, ủ tủ ấm 370C, 5% CO2 Quần thể tế bào sử dụng để xác định đặc điểm đặc trưng TBGUTV xét nghiệm hình thành mammosphere, khả gây u in vivo mơ hình chuột NOD/SCID, khả kháng thuốc chống khối u (doxorubicin 20 verapamil) Cuối cùng, quần thể TBGUTV đánh giá nhiễm - Trong điều kiện in vitro, TBGUTV điều hòa giảm biểu mycoplasma CD44 biểu số đặc điểm: 2.3 ĐIỀU HÒA GIẢM BIỂU HIỆN CD44 VÀ SỰ KHÁNG + tăng sinh chậm sau xử lí với doxorubicin THUỐC DOXORUBICIN CỦA TBGUTV + tăng mức apoptosis thay đổi chu kì tế bào Tác động gây siRNA sử dụng để làm giảm biểu CD44 apoptosis quan sát rõ TBGUTV bị điều hòa giảm biểu TBGUTV Việc chuyển nhiễm siRNA CD44 kit theo hướng CD44 đạt đến 34,19% tế bào chết xử lí 1,0 µg/mL dẫn nhà sản xuất (Santa Cruz Biotechnology Inc) Sau 48h chuyển doxorubicin đạt đến 40.2% xử lí doxorubicin nồng độ 6,0 nhiễm, tế bào sử dụng đánh giá biểu CD44 RT- µg/mL PCR hóa tế bào miễn dịch + Thay đổi biểu gen quan trọng liên quan đến Các tế bào sau khẳng định điều hòa giảm biểu CD44 thành công, chúng sử dụng để đánh giá khả kháng tính gốc, tính kháng thuốc di Muc-1, MMP9 Myc biểu giảm, biểu LEF1 liên quan đến tính gốc giảm thuốc với thuốc chống khối u Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử + chu kì tế bào bị tác động Pha G2/M pha S dụng doxorubicin để khảo sát nồng độ 0, 1, µg/mL Tế TBGUTV bị điều hịa giảm CD44 tương tự với TBUTV Pha G2/M bào tiếp xúc với nồng độ doxorubicin 48 TBGUTV bị điều hòa giảm CD44 giảm tương tự với TBUTV sau sử dụng để đánh giá chu kì tế bào, tăng sinh (24,23±0,34% so với 23,41±0,50%) pha S tăng từ apoptosis 13,93±0,69% TBGUTV lên 16,98±0,95% TBGUTV điều 2.4 BIỆT HÓA TBGUTV BẰNG CÁCH LÀM GIẢM BIỂU hòa giảm biểu CD44, so với 20,08±0,31% TBUTV HIỆN CỦA CD44 - Trong mơ hình chuột NOD/SCID, TBGUTV điều hịa giảm biểu Trong thí nghiệm này, tiến hành phân lập quần thể tế bào, có quần thể TBGUTV phân lập CD44 cho thấy khả gây u giảm tốc độ phát triển khối u kích thước khối u hình thành so với TBGUTV quần thể khác biểu marker khác với TBGUTV CD44- + TBGUTV gây u 66,67% (2/3) chuột bị tiêm 103 tế CD24-, CD44+CD24+, CD44-CD24+ Ba quần thể trộn bào; TBUTV cần đến 106 tế bào để gây u 33,33% (1/3) với tỉ lệ 1:1:1 để hình thành quần thể gọi tế bào khơng có chuột Ở liều 104 tế bào, TBGUTV điều hòa giảm biểu CD44 kiểu hình TBGUTV gọi chung TBUTV khơng có khả gây u so với 100% chuột bị u tiêm TBGUTV Tiếp theo, TBGUTV làm giảm biểu CD44 + Kích thước trọng lượng khối u có khác biệt đáng kể việc chuyển CD44 shRNA vector lentivirut Các tế bào nhóm điều trị theo phác đồ điều trị liệu pháp điều hòa chuyển nhiễm chọn lọc tế bào nhận vector chuyển cách giảm CD44 kết hợp doxorubicin mơ hình chuột So với chuột đối chọn lọc môi trường bổ sung puromycin dihydrochloride theo chứng, kích thước chuột giảm 1,74; 3,04 12,47 lần tương hướng dẫn nhà sản xuất Sự điều hòa giảm biểu CD44 ứng trong nhóm Doxorubicin, CD44 shRNA, CD44 shRNA kết hợp doxorubicin Trong nhóm kết hợp CD44 shRNA kết hợp 19 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ khẳng định kĩ thuật flow cytometry hóa tế bào miễn dịch 4.1 KẾT KUẬN Sau đánh giá biểu CD44, mẫu có >90% tế Tế bào ung thư vú từ 23 mẫu khối u vú phân lập bào không biểu CD44 sử dụng để tiến hành đánh giá ni cấy Đã thiết lập thành cơng dịng tế bào ung thư vú VNBRC1 VNBRC2 từ mẫu Các tế bào ung thư vú thu Trạng thái biệt hóa TBGUTV đánh giá dựa vào nhận biểu đặc điểm sau: tương đồng TBGUTV sau điều hòa giảm biểu CD44 với - chứa 0,11% tế bào dương tính CD90, 96,45±1,76% tế bào dương TBUTV khác biệt TBGUTV tế bào điều hòa giảm tính với CD24 biểu CD44 Các đặc điểm khảo sát bao gồm khả sinh u - biểu thấp gen Brca1, biểu mạnh gen mơ hình chuột NOD/SCID, biểu gen liên quan đến tính cyclin D1, cyclin E2, EGFR Mucin so với dòng tế bào ung thư vú gốc di căn, chu kì tế bào thương mại MCF-7 Có 22 gen chia thành phức hợp gen khảo sát, bao - hình thành khối u chuột NOD/SCID tiêm 2.106 tế gồm: Phức hợp gồm 17 gen: Bcl-2 [Genebank:NM_000633], Fos bào/chuột [Genebank: NM_005252], ICAM1 [Genebank:NM_000201], CCND1 - âm tính với mycoplasma M arginini, M faucium, M [Genebank: NM_053056], MMP7 [Genebank:NM_002423], Myc fermentans, M hyorhinis, M orale) Acholeplasma laidlawii [Genebank:NM_002467], PRKCE [Genebank:NM_005400], TP53 Thiết lập thành công hai dòng tế bào gốc ung thư vú (BCSC1 [Genebank:NM_000546], VCAM1 [Genebank:NM_001078], IL4R BCSC2) Các TBGUTV biểu đặc điểm đặc trưng sau: [Genebank:NM_000418], PTCH1 [Genebank:NM_000264], HSPB1 - biểu mạnh protein CD44, không biểu hay biểu yếu [Genebank: NM_001540], PTGS2 [Genebank: NM_000963], HSF1 protein CD24 bề mặt tế bào [Genebank:NM_005526], - có khả tự làm in vitro hình khối cầu môi [Genebank:NM_003202], and FASN [Genebank:NM_004104]; phức trường không huyết hợp gồm gen: Muc-1 [Genebank:NM_002456], cyclin E2 - có khả gây u chuột NOD/SCID với liều 103 TBGUTV [Genebank:NM_004702], tiêm da [Genebank:NM_002467], and cyclin D1 [Genebank:BC001501] - kháng mạnh với verapamil nồng độ cao (50 µg/mL) so với tế bào 2.5 ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN KHỐI U TRÊN MƠ HÌNH ung thư vú CHUỘT BẰNG LIỆU PHÁP GEN ĐIỀU HÒA GIẢM BIỂU - âm tính với mycoplasma M arginini, M faucium, M HIỆN CD44 KẾT HỢP VỚI DOXORUBICIN fermentans, M hyorhinis, M orale) Acholeplasma laidlawii LEF1 [Genebank:NM_016269], EGFR [Genebank:NM_005228], TCF7 Myc Trong thí nghiệm này, chúng tơi xác định tỉ lệ xâm nhiễm cho Liệu pháp gen điều hòa giảm biểu CD44 thiết lập hiệu lượng hạt virus mang shRNA CD44 tế bào thành cơng mơ hình chuột khối u Các tỉ lệ khảo sát bao gồm 2:1, 1:1 1:2 tương ứng với 18 tỉ lệ TBGUTV hạt lentivirut mang shRNA CD44 với lô đối sau 18 ngày ghép, có đến 100% chuột mang khối u chứng không bổ sung hạt lentivirut Các tế bào nuôi tiếp tục lô đối chứng sau 15 ngày tiêm PBS ngày sau nhiễm với lentivirut sử dụng để phân tích tỉ lệ phần trăm tế bào biểu CD44 kĩ thuật flow cytometry Về khả di cư tế bào tua ghép đến lách, phân tích tồn tín hiệu huỳnh quang Vybrant Dil-CM đánh dấu tế bào Sau đó, chuột NOD/SCID tiêm TBGUTV để gây tạo tua kĩ thuật flow cytometry cho thấy có 0,095±0,018% tế bào tua khối u da Sau tuần, khối u hình thành đủ lớn, chúng ghép diện lách tổng số tế bào lách Kết phân tích chia thành nhóm Nhóm (đối chứng, con), chuột mang u mơ học quan sát kính hiển vi huỳnh quang cho thấy có khơng điều trị Nhóm (Doxorubicin –Dox), chuột tiêm tồn tín hiệu huỳnh quang lát cắt lách vào khối u doxorubicin với liều 2mg/kg hàng tuần tuần Nhóm Tiếp theo việc đánh giá thay đổi đáp ứng miễn dịch (shRNA), chuột tiêm với CD44 shRNA lentivirut với liều ghép tế bào tua thông qua thành phần tế bào CD8 CD45 lách xác định thí nghiệm Nhóm (CD44 shRNA kết hợp so với chuột đối chứng chuột bình thường cho thấy tỉ lệ tế bào CD8 với doxorubicin, shRNA+Dox), chuột tiêm CD44 shRNA tăng cao so với chuột đối chứng chuột bình thường (tương ứng lentivirut với lượng tương đương nhóm với doxorubicin với 26,33%; 9,52% 2,61% chuột ghép tế bào tua, chuột bình lượng chế độ tiêm với nhóm Kích thước trọng lượng thường chuột đối chứng) Điều cho thấy việc ghép tế bào khối u ghi nhận tua kích hoạt đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào T gây độc Kết 2.6 TÁC ĐỘNG CỦA TẾ BÀO TUA ĐƯỢC NẠP DỊCH CHIẾT phân tích cho thấy việc ghép tế bào tua làm tăng tỉ lệ tế TBGUTV LÊN MƠ HÌNH CHUỘT MANG KHỐI U VÚ bào CD45 so với chuột đối chứng (76,97% so với 48,11%) Tuy Trong thí nghiệm này, dịch chiết TBGUTV tạo sau 5.106 TBGUTV thu nhận cho vào ống li tâm 1.5 mL Tế bào nhiên, tỉ lệ tương đối thấp so với chuột bình thường Điều tác động chất ức chế miễn dịch xử lí với 400µl Pro-PREP trộn kĩ Huyền phù làm lạnh nhanh -200C 10-20 phút Dịch tế bào chuyển sang ống li tâm bảo quản để sử dụng thí nghiệm Tế bào tua biệt hóa từ tế bào đơn nhân tủy xương chuột Chuột mơ hình u vú tạo cách tiêm 106 TBGUTV vào da vùng mỡ vú chuột Để ức chế đào thải tế bào ghép, chuột tiêm busulfan (liều 20 mg/kg) cyclophosphamide (liều 200 mg/kg) Chế phẩm tế bào tua sử dụng để tiêm cho chuột tạo sau 100 µl dịch chiết TBGUTV thêm vào mL tế bào tua 17 shRNA riêng rẽ nhau; kết hợp, chúng gây tác tương ứng 106 tế bào tua Ủ hỗn hợp 24 tủ ấm 370C động ức chế mạnh với thay đổi kích thước, trọng lượng có ý nghĩa Sau nạp kháng nguyên, tế bào tua nhuộm với chất phát thống kê so với lô điều trị riêng rẽ huỳnh quang Vybrant Dil-CM để theo dõi di cư chúng tiêm So với chuột đối chứng, kích thước khối u giảm 1,74; 3,04 vào chuột 12,47 lần tương ứng trong nhóm Doxorubicin, CD44 shRNA, Phác đồ điều trị chuột: sau 10 ngày chuột tiêm với CD44 shRNA kết hợp doxorubicin Trong nhóm kết hợp CD44 TBGUTV tiêm chế phẩm tế bào tua vào tĩnh mạch với liều shRNA doxorubicin, trọng lượng khối u giảm đáng kể đến 4,38 lần 106 tế bào chứa 0,2 mL PBS; đó, chuột lơ đối so với nhóm đối chứng chứng tiêm 0,2 mL PBS Chuột theo dõi hình thành Như vậy, biểu mạnh CD44 TBGUTV có ý nghĩa khối u nhận thấy mắt thường Để theo dõi di cư quan trọng tăng sinh, kháng thuốc tế bào Từ tế bào ghép, số chuột giết vào ngày sau ghép, lách kết nghiên cứu, cho liệu pháp kết hợp điều chuột thu nhận để đánh giá tồn tế bào ghép Sự kích hịa giảm biểu CD44 doxorubicin ức chế mạnh phát hoạt hệ miễn dịch chuột ghép tế bào tua khảo sát thông triển khối u so với đối chứng Kết hứa hẹn cho liệu qua thay đổi thành phần tế bào CD45 tế bào lympho T CD8 pháp sử dụng kết hợp liệu pháp gen hóa trị liệu để công lách TBGUTV điều trị UTV 3.4 LIỆU PHÁP TẾ BÀO TUA LÀ LIỆU PHÁP TIỀM NĂNG TRONG ĐIỀU TRỊ UTV Trong thí nghiệm chuẩn bị thành công TBGUTV tế bào tua Các TBGUTV tăng sinh đủ số lượng để tiến hành thí nghiệm giữ kiểu hình CD44+CD24- Các tế bào tua biệt hóa từ tế bào đơn nhân tủy xương chuột So với, trước cảm ứng tế bào biểu số đặc điểm kiểu CD40, CD80 CD86, CD14 khơng biểu Sau đó, tế bào tua nạp kháng nguyên TBGUTV để hoạt hóa đáp ứng miễn dịch chuyên biệt với TBGUTV Đáp ứng đánh giá thông qua tiêu: hiệu điều trị ung thư chuột, di cư tế bào tua ghép vào đến lách thay đổi thành phần tế bào T CD8 T CD45 tách Về hiệu ức chế phát triển khối u, kết cho thấy lô thí nghiệm có khoảng 60,0 ± 20% chuột khơng mang khối u 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 PHÂN LẬP THÀNH CÔNG TẾ BÀO UNG THƯ Sự thay đổi biểu gen quan trọng kéo theo thay đổi chu kì TBGUTV bị làm giảm biểu CD44 theo kiểu Kết cho thấy tế bào từ mơ với hai hình dạng chính: tế tế bào khơng phải TBGUTV Pha S tế bào tăng pha G2/M lại bào giống tế bào biểu mô tế bào giống trung mô (nguyên bào sợi, tế giảm TBGUTV bị làm giảm biểu CD44 tương tự tế bào nền) Sự khác biệt hai kiểu tế bào nhận diện bào khơng có kiểu hình TBGUTV nhuộm với kháng thể kháng CD90 phân tích flow cytometry: Sự khác biệt khảo sát khả gây u quần thể dương tính CD90 quần thể âm tính CD90 Tuy tiêm chúng vào chuột Tiềm sinh u tiêu chuẩn vàng để nhiên, chúng TBUTV Thật vậy, tế bào biểu mô đánh giá tế bào có phải TBGUT Kết cho thấy, tiêm 103 bình thường tồn khối u vú Để làm giàu nâng cao TBGUTV có khả gây u chuột NOD/SCID, độ tinh TBUTV, chúng tơi ni sơ cấp mảnh mô môi TBGUTV bị làm giảm biểu CD44 cần đến 106 tế bào để gây u, trường chuyên biệt cho TBUT biểu mô phát triển loại bỏ tế bào tương tự quần thể tế bào khơng có kiểu hình TBGUTV nhiễm Chúng tơi đặt tên cho dòng TBUTV ứng viên thu nhận Như vậy, việc điều hòa giảm biểu CD44 gây biệt hóa VNBRC1 Để khẳng định tế bào thu nhận TBUTV, thí TBGUTV thành kiểu hình tế bào khơng mang tính gốc nghiệm tiếp theo, chúng tơi tiến hành phân tích biểu 3.3.3 Liệu pháp gen điều hòa giảm biểu CD44 ức chế khối u gen liên quan đến di hình thành ung thư Kết cho thấy vú mơ hình chuột NOD/SCID có khác biệt quan trọng biểu gen Từ kết thí nghiệm trên, nhận thấy VNBRC1 với tế bào tuyến vú bình thường lại tương tự với việc kết hợp liệu pháp biệt hóa điều hịa giảm biểu CD44 tế bào MCF-7, đặc biệt gen liên quan đến UTV So với tế bào với hóa trị liệu ức chế tiêu diệt khối u Trong thí nghiệm này, MCF-7, VNBRC1 biểu nhiều gen liên quan di mạnh tiến hành thử nghiệm cận lâm sàng điều trị khối u vú Dựa vào kết này, chúng tơi khẳng định tế bào thu mơ hình chuột liệu pháp kết hợp liệu pháp gen điều hịa nhận TBUTV VNBRC1 khơng giống với MCF-7 giảm CD44 hóa trị liệu với thuốc chống khối u doxorubicin chúng biểu gen liên quan đến di mạnh (Mucin 1, Cyclin E2, EGF receptor, Myc Cyclin D1) tế bào MCF-7 Sau 48 giờ, tiêm với vector lentivirut CD44 shRNA, chuột điều trị với doxorubicin Thời điểm chọn dựa Một số đặc điểm khác VNBRC1 xác định vào nghiên cứu trước cho thấy virut xâm nhiễm chúng biểu thấp gen BRCA1 Gen liên quan đến rủi ro ức chế biểu gen sau 24 Doxorubicin sử dụng liều hình thành UTV nhiều ung thư khác BRCA1 gen ức chế mg/kg trọng lượng chuột Kết cho thấy khác biệt có ý khối u, trì tồn vẹn gen ngăn chặn đột biến gây nên nghĩa thống kê kích thước trọng lượng khối u lơ ung thư Do đó, sản phẩm gen cho có vai trị sửa chữa chuột khác Việc điều trị doxorubicin shRNA CD44 DNA, điều hòa phiên mã gen nhiều chức khác Gen riêng rẽ hay kết hợp có tác động ức chế phát triển khối u Tuy biểu thấp số ung thư, đặc biệt UTV VNBRC1 nhiên, tác động ức chế việc điều trị với doxorubicin hay CD44 10 15 khẳng định TBUT dương tính với CD44 biểu gen thấp thấp dòng TBUTV thương mại TBUT tuyến liệt MCF-7 Dựa vào kết nghiên cứu này, giả thuyết Tiêu chuẩn vàng để khẳng định liệu quần thể tế bào có CD44 mục tiêu để điều trị ung thư, đặc biệt UTV Sử phải TBUT khả gây u chúng tiêm vào chuột suy dụng siRNA CD44 công TBGUTV với kiểu hình CD44+CD24_ có giảm miễn dịch hay chuột NOD/SCID Trong nghiên cứu này, thể chiến lược liệu pháp gen hiệu để điều trị UTV Tuy nhiên, VNBRC1 gây u chuột suy giảm miễn dịch chuột ứng dụng liệu pháp gen để làm giảm biểu gen CD44 đương NOD/SCID tiêm 2.106 tế bào với lần tiêm đầu với thử thách lớn nhiều tế bào thể dương tính Tóm lại, nội dung thứ nghiên cứu, với CD44 Do đó, liệu pháp gen tiêm vào khối u với thiết lập thành cơng hai dịng TBUTV từ khối u vú ác tính phụ nữ polyethylenimine/siRNA CD44 lựa chọn tốt Việt Nam Chúng đặt tên chúng VNBRC1 VNBRC2 (là từ trường hợp viết tắt Vietnamses breast cancer cells Vietnamese breast 3.3.2 Làm giảm biểu CD44 gây nên biệt hóa cancer cells 2) So với kĩ thuật khác, nghiên cứu xây dựng TBGUTV kĩ thuật thiết lập dòng TBUTV với số thuận lợi Các kĩ Trong thí nghiệm tiếp theo, xác định chế tác thuật trước sử dụng kĩ thuật nuôi cấy sơ cấp cấy chuyền liên tục để động việc làm giảm biểu CD44 lên tính kháng thuốc điều đạt quần thể TBUTV tinh Mặc dù kĩ thuật có số trị ung thư Chúng tơi tiến hành làm giảm biểu CD44 vector lợi ích dễ tiến hành, rẻ đương đầu với việc nhiễm tế lentivirut shRNA chọn lọc puromycin để tạo quần thể tế bào giảm bào khác tế bào biểu mơ bình thường, ngun bào sợi tốn thời biểu CD44 ổn định gian Cải tiến kĩ thuật này, sử dụng kĩ thuật loại bỏ tế Sau đó, tính gốc quần thể tế bào, bao gồm: TBGUTV, bào nhiễm môi trường nuôi, cấy chuyền liên tục chọc lọc tế TBGUTV làm giảm biểu gen CD44 tế bào bào quan tâm loại bỏ tế bào không mong muốn marker TBGUTV (tế bào không biểu kiểu hình CD44+CD24- thu nhận từ bề mặt quần thể TBUTV) so sánh với Các tiêu so sánh bao 3.2 PHÂN LẬP THÀNH CÔNG TBGUTV TỪ DÒNG TBUTV gồm: biểu gen liên quan đến TBG di căn, kháng VIỆT NAM thuốc, thay đổi chu kì tế bào, khả hình thành khối u in vivo chuột NOD/SCID Kết tương tự với phát AlHajj cs quần thể TBGUTV khối u ác tính Đó có Kết cho thấy TBGUTV bị làm giảm biểu gen có quần thể nhỏ TBGUTV với kiểu hình CD44+CD24-/dim khối biểu giảm rõ rệt gen khảo sát tương tự mức biểu tế u vú ác tính Tuy nhiên, kết Honeth cs (2008) cho thấy có bào khơng phải TBGUTV Đặc biệt gen liên quan đến khả di đến 31% tế bào có kiểu hình khối u vú ác tính Ở Muc-1, MMP9, Myc giảm biểu mạnh TBGUTV bị nghiên cứu khác, tác giả cho thấy có đến 59% tế bào biểu điều hòa giảm CD44 tương tự tế bào khơng có kiểu hình TBG kiểu hình CD44+CD24- khối u vú 14 11 Quần thể tế bào thu nhận biểu mạnh protein CD44, nói cách khác, điều hòa giảm biểu CD44 làm TBGUTV nhạy không biểu hay biểu yếu protein CD24 bề mặt tế cảm với tác nhân chống ung thư Thật CD44 protein xuyên bào Kết khẳng định kĩ thuật flow cytometry hóa màng tổng hợp dạng nhiều isoform mRNA splicing Mặc tế bào miễn dịch Theo kết Clarke cs (2006), cấy ghép dị dù CD44 thiếu domain quan trọng cho truyền tín hiệu, loại sử dụng để tách quần thể tế bào CD44+CD24- có tiềm gây u mơ tả cần thiết cho “trở nhà” chứa số đặc điểm mơ hình chuột NOD/SCID Họ cho thấy 200 tế bào với quan trọng cho TBGUT máu Có số chứng CD44 hỗ kiểu hình gây u tiêm vào chuột NOD/SCID trợ bám dính in vitro phát triển khối u di tiêm 20.000 tế bào khơng biểu kiểu hình khơng khối u rắn Chức kích thích khối u CD44 xảy thơng có khả gây u in vivo Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiêm qua đồng kích thích với tín hiệu thụ thể nhân tố 1000 TBGUTV mà thu nhận có khả gây tăng trưởng EGF receptor-2 (Her 2), EGF receptor (Her1) u yếu tố phát triển tế bào gan (Met) CD44 xem Trong xét nghiệm tiếp theo, chúng tơi kiểm tra đặc tính tiếp marker hữu dụng để phát làm giàu TBGUT Các tế bào dương theo TBGUTV khả tự làm kĩ thuật ni cấy tạo tính CD44 có khả di gây u Hơn nữa, marker CD44 mammosphere Kết cho thấy TBGUTV thu nhận có khả sử dụng để tách TBGUT tuyến tiền liệt, tuyến tụy đại tràng Một tạo mammosphere manh đặc điểm quan trọng TBGUT khối u biểu cao Đặc tính kháng thuốc TBGUT khảo sát ABC transporter, đặc biệt ABCG2 Vì TBGUT có khả nghiên cứu Các TBGUT với kiểu hình CD44+CD24- kháng mạnh kháng thuốc, hóa trị liệu Về lâm sàng, hóa trị liệu với thuốc verapamil so với TBUTV khơng biểu kiểu hình tiêu diệt hầu hết tế bào khối u rắn Tuy nhiên, quần thể Từ nội dung này, tạo dòng TBGUTV, nhỏ tế bào gọi TBGUT có khả kháng thuốc, đặt tên BCSC1 BCSC2 diện kênh ABC transporter giúp đẩy thuốc trị ung thư 3.3 CD44 LÀ ĐÍCH TIỀM NĂNG TRONG ĐIỀU TRỊ TRÚNG Sự biểu gia tăng ABC transporter TBGUT dẫn ĐÍCH UTV đến đào thải Hoechst 33342 Rhodamine 123 mà phát 3.3.1 Điều hịa giảm biểu CD44 làm giảm tính kháng thuốc kĩ thuật flow cytometry Những tế bào có khả gọi TBGUTV quần thể phụ Các TBGUTV bị điều hòa giảm biểu CD44 nhạy cảm với Trong nghiên cứu này, làm giảm biểu CD44 làm doxorubicin TBGUTV Ngay nồng độ cao, doxorubicin giảm tính kháng thuốc TBGUTV Điều cho thấy thất bại giết TBGUTV CD44+CD24-, nồng độ tương quan tính kháng thuốc biểu CD44 hay doxorubicin gây apoptosis TBGUTV bị điều hòa giảm biểu đường truyền tín hiệu liên quan đến protein Sự điều hịa giảm CD44 Điều cho thấy việc điều hịa giảm biểu biểu CD44 ức chế tăng sinh gây nên apoptosis CD44 làm giảm khả kháng doxorubicin TBGUTV Hay 12 13 ... hướng điều trị phù hợp sử dụng để cơng TBGUTV Vì thế, tiến hành nghiên cứu với tên đề tài ? ?Phân lập, xác định đặc điểm tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam bước đầu ứng dụng điều trị thực nghiệm? ??... nhiều đặc điểm tế bào gốc ung thư (TBGUT) xác định sử dụng đích cơng số chiến lược trị liệu Vài đích công TBGUTV sử dụng thử nghiệm lâm sàng; số có số phát triển trở thành thuốc điều trị thư? ??ng... S tế bào tăng pha G2/M lại bào giống tế bào biểu mô tế bào giống trung mô (nguyên bào sợi, tế giảm TBGUTV bị làm giảm biểu CD44 tương tự tế bào nền) Sự khác biệt hai kiểu tế bào nhận diện bào