GIÁO D C VÀ ÀO T O B NÔNG NGHI P VÀ PTNT VI N KHOA H C NÔNG NGHI P VI T NAM ************************** LÊ MAI NH T NGHIÊN C U B NH VÀNG LÁ GREENING I CÂY N QU CĨ MÚI M T S T NH PHÍA B C VI T NAM VÀ XU T BI N PHÁP PHÒNG CH NG Chuyên ngành: B o v th c v t Mã s : 62 62 01 12 TÓM T T LU N ÁN TI N S NÔNG NGHI P Hà N i – 2014 Cơng trình c hồn thành t i: VI N KHOA H C NÔNG NGHI P VI T NAM Ng i h ng d n khoa h c: TS Ngô V nh Vi n PGS.TS Nguy n V n Vi t Ph n bi n 1: Ph n bi n 2: Ph n bi n 3: Lu n án ti n s c b o v t i H i ng ch m Lu n án c p Vi n h p i: Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam Vào h i gi ngày tháng n m 2014 Có th tìm hi u lu n án t i th vi n: Th vi n qu c gia Vi t Nam Th vi n Vi n Khoa h c nông nghi p Vi t Nam U Tính c p thi t c a tài Cây n qu có múi (cam, quýt, chanh, b i…) nhóm n qu quan tr ng s n xu t nông ngh i p n c ta N m 2011 di n tích n qu có múi Vi t Nam t 124.057 ha, ó di n tích tr ng cam quýt 70.300 ha, b i 45.000 ha, chanh 18.000 Các lo i qu có múi khơng ch hàng hóa áp ng cho tiêu th i a mà m t hàng xu t kh u có giá tr kinh t cao Ngh tr ng n qu có múi c phát tri n m nh m nhi u n c thu c vùng nhi t i, nhi t i ôn i Song s a d ng khí h u vùng tr ng tr t u ki n thích h p cho nhi u lồ i sâu b nh phát sinh gây h i có múi, c bi t b nh vàng greening (VLG) t nh ng nhân t tr ng i phát tri n có múi ã lan truy n gây h i h u h t n c tr ng n qu có múi nh VLG lan truy n t v t li u nhân gi ng nh cành chi t, m t ghép ã nhi m b nh côn trùng môi gi i Nh ng nghiên c u b c u v b nh Vi t Nam ã c ti n hành, song nh ng v n v b n ch t c a b nh v n ch a c tìm hi u m t cách y Vì v y, nh ng bi n pháp phòng tr b nh v n hi u qu Nh m gi i quy t c yêu c u phòng ch ng b nh VLG trì s n xu t n qu có múi b n v ng cho vùng tr ng cam quýt phía B c, vi c ti n hành tài “Nghiên c u b nh vàng greening h i n qu có múi m t s t nh phía B c Vi t Nam xu t bi n pháp phòng ch ng” mang tính th i s c p thi t M c tiêu nghiên c u 2.1 M c tiêu Xác nh c c m phát sinh, phát tri n ph ng th c lan truy n b nh vàng greening (VLG) làm c s khoa h c xây d ng gi i pháp phịng ch ng có hi u qu cho n qu có múi m t s t nh phía B c 2.2.Yêu c u m c tình hình phân b c a b nh vàng greenin g m t s vùng tr ng n qu có múi t nh phía B c Xác nh c ch ng vi khu n gây b nh vàng greening s phân b c a ch ng vi khu n m t s ch ng lo i n qu có múi vùng sinh thái khác Xác nh c ph ng th c truy n b nh y u t nh h ng làm c s khoa c xu t bi n pháp phòng ch ng có hi u qu b nh vàng greening Ý ngh a khoa h c th c ti n c a tài - Cung c p b sung d n li u khoa h c th c ti n v b nh vàng greening, ph ng th c truy n b nh, y u t nh h ng gi i pháp phòng ch ng b nh có hi u qu - Xác nh c ph ng pháp ch n oán nhanh b nh vàng green ing ng ru ng T ó, góp ph n a gi i pháp phịng tr k p th i có hi u qu cao - Các k t qu c a tài óng góp d n li u khoa h c làm c s khoa h c th c ti n xây d ng h th ng phòng ch ng b nh có hi u qu , góp ph n trì, b o t n phát tri n b n v ng ngành tr ng n qu có múi Vi t Nam i t ng ph m vi nghiên c u 4.1 i t ng nghiên c u - Vi khu n Liberibacter asiaticus gây b nh vàng greening có múi môi gi i truy n b nh r y ch ng cánh Diaphorina citri Kuwayama - M t s lồi n qu có múi b n a nh p n i c tr ng m t s t nh phía c Vi t Nam, thu c h Rutaceae ký ch c a vi khu n L asiaticus gây nh vàng greening có múi 4.2 Ph m vi nghiên c u tài nghiên c u ph ng th c lan truy n b nh, y u t nh h ng t i s phát sinh gây h i c a b nh u ki n sinh thái t nh phía B c Xác nh ch ng vi khu n L.asiaticus gây b nh có múi, s phân b ch ng vi khu n Nghiên c u m t s gi i pháp có hi u qu phòng ch ng b nh vàng greenin g n qu có múi m t s t nh phía B c Nh ng óng góp m i c a lu n án - Cung c p b sung d n li u khoa h c v m c ph bi n, tri u ch ng, ký ch c a nh VLG n qu có múi phía B c - L n u tiên xác nh c vi khu n gây b nh vàng greening thu c ch ng I II gi ng n qu có múi hi n ang tr ng s n xu t phía B c Vi t Nam - Hoàn thi n c k thu t vi ghép nh sinh tr ng làm s ch b nh greening nh vi rút khác, góp ph n hồn thi n quy trình s n xu t gi ng s ch b nh - ánh giá tính ch ng ch u c a m t s lo i g c ghép b n a , nh p n i v i b nh vàng greening xu t gi i pháp ch ng tái nhi m b nh vàng greening C u trúc lu n án Lu n án g m 146 trang, g m ph n m u trang; Ch ng C s khoa h c ng quan tài li u (36 trang); Ch ng V t li u, n i dung ph ng pháp nghiên c u (19 trang); Ch ng K t qu nghiên c u th o lu n (85 trang); K t lu n ki n ngh trang v i 41 b ng s li u, 39 hình Tham kh o 164 tài li u, ó có 34 tài li u ti ng vi t, 130 tài li u ti ng anh Ch ng S KHOA H C VÀ T NG QUAN TÀI LI U 1.1 s khoa h c c a tài Các nhà khoa h c u xác nh b nh vàng greening b nh h i quan tr ng nh t n qu có múi vùng th gi i T ri u chúng b nh bi u h i n v i m c khác tu thu c vào t ng ch ng lo i có mú i, ngu n g c gi ng, môi gi i truy n b nh v.v… c ng nh bi n pháp canh tác, b o v v n Nhi u nhà khoa h c ã kh ng nh phòng ch ng b nh VLG có hi u qu , tr c t ph i i sâu nghiên c u d ch t h c c a tác nhân gây b nh, y u t môi tr ng nh h ng n kh n ng phát tri n, lan truy n b nh ng ru ng (Matsumoto et al., 1961; Aubert et al., 1988; Su et al., 1998; Bové et al., 2006) Các nghiên c u n c th gi i ch rõ b nh VLG có kh n ng lan truy n nhanh m c tàn phá r t cao n u s d ng gi ng ã nhi m b nh, k thu t canh tác không c quan tâm Theo tác gi Su et al (1998); Bové et al (2006); Hà Minh Trung c ng s (2008) k thu t s n xu t s d ng gi ng s ch nh, phát hi n s m nh ng gi ng b nh i m b nh lo i b tr ng c coi khâu u tiên h t s c quan tr ng vi c xu t gi i pháp phòng ch ng b nh t hi u qu Nh v y, vi c nghiên c u xác nh tác nhân gây b nh, ph ng pháp nh n bi t s m b b nh, ph ng th c lan truy n s thay i c tính c a ch ng vi khu n gây b nh t ng ch ng lo i n qu có múi nh ng v n quan tr ng T ó, làm c s xây d ng h th ng gi i pháp phòng ch ng t ng h p b nh VLG có hi u qu kinh t , k thu t cao b n v ng 1.2 Tình hình nghiên c u ngồi n c 1.2.1 Tri u ch ng, ch s phát hi n, phân b c a b nh vàng greening nh vàng greening ã c ghi nh n t n m 1929 Trung Qu c, v i nhi u tên i khác nh Huanglongbing hay ch i vàng (yellow shoot) Nam Trung Qu c c tài li u hóa n m 1943, Greening Nam Phi (n m 1947), Likubin ( ài Loan, m 1951), Leaf mottle ye llows Philippines, huanglongb ing Thái Lan (n m 1960), Dieback n , greening Myanmar (n m 1970), Vein Phloem degeneration Indonesia (n m 1980), greening Vi t Nam, Lào, C m Pu Chia (n m 1980), Huanglongbing Iriomote, Ok inawa (n m 1994), o Okinawa, Nh t b n (n m 2003), Tokunoshima, Kagosh ima, Japan (n m 2003), Huanglongb ing Braz il (N m 2004) Florida, Hoa k (n m 2005) n ch a ghi nh n c Ôtxtrây-li-a 1.2.2 Ch n oán giám nh b nh vàng greening Xác nh tác nhân gây b nh b ng kính hi n vi nt : i kính h i n vi nt quan sát c vi khu n gây b nh VLG Hình d ng c a vi khu n th ng có hình g y, thon dài c thay i t t bào non cho n lúc thành th c (Huang, 1987) Xác nh tác nhân gây b nh b ng ph ng pháp sinh h c phân t : Ph ng pháp ã dùng c p m i c hi u ch n oán b nh VLG t m u b nh t i côn trùng mô i gi i (Hung et a l., 1999, Jagoueix et al., 1996; A Hocquellet 1997; Subandiyah et al., 2000) Nghiên c u v ch ng gây b nh vàng greening: Su, (2008) ã xác nh c ch ng vi khu n gây b nh VLG ài Loan b ng ph ng pháp s d ng ch th m t s gi ng n qu khác k t h p v i công ngh sinh h c Cho n ã xác nh c ch ng vi khu n gây b nh khác Các ch ng khác cho tri u ch ng khác gi ng 1.2.3 Nghiên c u v d ch t sinh thái h c c a b nh vàng greening nh lây lan r t nhanh t t l 95% kho ng th i gian t n m sau xu t hi n tri u ch ng u tiên (Matsumoto et a l., 1961; Aubert et al., 1988, Bové et al., 2000b; Gottwald, 2005) nh vàng greenin g c lan truy n qua ng nhân gi ng lan truy n b i côn trùng môi gi i (Diaphorina citri Kuwayama) theo ki u b n v ng (Halbert Manjunath, 2004; Pluke et al., 2008) Skelley & Hoy (2004) ã s d ng ph ng pháp nhân nuôi r y ch ng cánh nguy t qu (Murraya paniculata L.), không b nhi m b nh môi gi i ho c ghép lây b nh M t s loài ký ch t t cho D citri bao g m: Citrus reticulata Blanco, Bergera koenigii L., Citrus maxima (Burm.) Merr., Citrus medica L., Citrus taiwanica Tanaka & Y Shimada, and Citrus aurantiifolia (Christm.) Swingle 1.2.4 Nghiên c u gi i pháp qu n lý b nh Vi ghép nh sinh tr ng ph ng pháp t t nh t ph c tráng l i gi ng ngu n gen quý ã ang phát tri n nh ch i hay mô phân sinh th ng không mang tác nhân gây b nh VLG, phát tri n t vi ghép th ng s ch b nh P h ng pháp vi ghép nh sinh tr ng c ghép theo ki u ch T ng c (Murashige et a l., 1972) M i ây nh t ph ng pháp vi ghép ã c c i ti n b ng hình tam giác ng c (Su & Chu, 1984; Chen, 2012; Jae-Wook Hyun et al., 2012) Các gi i pháp nh m c i th i n gi ng n qu có múi, ng th i áp d ng bi n pháp canh tác, sinh h c hóa h c phịng ch ng b nh vàng greening 1.3 Tình hình nghiên c u tro ng n c 1.3.1 L ch s , tri u ch ng s phân b c a b nh nh vàng greening c ghi nh n t nh ng n m 1960 (Hà Minh T rung, 2005) M c b b nh tùy thu c vào u ki n canh tác, ph ng pháp nhân gi ng thu t phòng tr sâu b nh t ng vùng (Hà Minh T rung, 2003; Ngô V nh Vi n cs, 2012) ình c (1991), Hà Minh Trung (1995), Nguy n Minh Châu (2001), Lê T h T hu H ng (2009) ã mô t ghi nh n tri u ch ng b nh vàng greening có múi 1.3.2 C n oán giám nh b nh vàng greening Th i gian u t i Vi t Nam c ng t n t i hai tr ng phái khác v nguyên nhân gây b nh Tr ng phái th nh t cho r ng b nh greening y u t sinh lý gây ra, tr ng phái th hai l i cho r ng b nh VLG b nh truy n nhi m vi sinh v t gây Ngày s d ng k thu t sinh h c phân t ã kh ng nh b nh vàng có múi n c ta b nh VLG r y ch ng cánh (D citri Kuwayama) mô i gi i truy n b nh (Hà Minh Trung cs., 1996) 1.3.3 Nghiên c u v d ch t h c c a b nh Hà Minh Trung cs, (1995) ã nghiên c u s lan truy n b nh qua ghép qua côn trùng môi gi i m t ghép Ngô V nh Vi n cs., (2009), Nguy n V n Hoà cs., (2012) ã thu th p nghiên c u ánh giá s b tính ch ng ch u c a m t s loài thu c h Rutaceae 1.3.4 Nghiên c u gi i pháp qu n lý b nh Cho t i quy trình k thu t vi ghép nh sinh tr ng ln c hồn thi n t ng kh n ng s ng s ch b nh i v i vi ghép T ó thi t l p h th ng nhà i l u gi u dòng s n xu t gi ng s ch b nh Bi n pháp qu n lý b nh c ng b t công n ch n t o c i thi n b gi n g, gi i pháp k thu t tr ng tr t k t h p v i bi n pháp sinh h c hóa h c phịng tr môi gi i truy n b nh Ch ng T LI U, N I DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 a m th i gian nghiên c u a m nghiên c u - B môn B nh cây, Vi n B o th c v t, ông Ng c, T Liêm, Hà N i - Phịng Thí nghi m tr ng i h c t ng h p ài Loan - Ngh i Diên, Nghi L c, Ngh An m t s a ph ng thu c phía B c Th i gian nghiên c u: T tháng 1/2010 – 10/2013 2.2 V t li u nghiên c u Môi tr ng MS (Mu rash ige and Skoog), BAP, ch t u ti t sinh tr ng dùng vi ghép nh sinh tr ng H t g c ghép (cam ba lá, b i chua, ch p, cam Sành, quýt Cleopatra) Các hóa ch t s d ng xác nh tác nhân gây b nh VLG Cây có múi s ch b nh (Cam Canh, Xã oài, b i Di n, chanh Eureka, Thanh Yên); g c ghép (b i chua, ch p) m t s loài có múi thu c chi Citrus d i thu c h Rutacea Khung nhà nh 1m × 1m × 1m, túi b u h th ng nhà l i c p; giá th tr ng (cát vàng, mùn c a g t p phân mùn vi sinh) Kháng sinh (Streptomic ine) thu c hóa h c Confidor 100SL (Im idacloprid) 2.3 N i dung nghiên c u 2.3.1 Nghiên c u m c ph bi n tri u ch ng c a b nh vàng greenin g 2.3.2 Nghiên c u giám nh tác nhân gây b nh s lan truy n b nh vàng green ing 2.3.3 Nghiên c u xác nh ký ch s phân b c a ch ng vi khu n gây b nh vàng greening n qu có múi m t s t nh phía B c Vi t Nam 2.3.4 Nghiên c u m t s gi i pháp khoa h c cơng ngh phịng ch ng b nh vàng green ing n qu có múi Ph ng pháp nghiên c u 2.4.1 Ph ng pháp nghiên c u m c ph bi n tri u ch ng c a b nh vàng greening Ph ng pháp u tra t l b nh m c ph bi n ng ru ng theo ph ng pháp nghiên c u B o v th c v t T p ( ng V T h Thanh Hà Minh T rung, 1997) Ph ng pháp xác nh d ng tri u ch ng b nh vàng greening n qu có múi m t s t nh mi n B c Vi t Nam theo Matsumoto et al., 1961, Su et al., 2008; Hà Minh Trung cs, 1995) Ph ng pháp u tra r y ch ng cánh Diaphorina citri Kuwayama n qu có múi theo Ph m V n L m (2005) 2.4.2 Ph ng pháp nghiên c u giám nh tác nhân gây b nh s lan truy n nh vàng greening Ph ng pháp xác nh tác nhân gây b nh b ng hi n vi nt : c th c hi n t i Vi n V sinh d ch t Trung ng - Hà N i Ph ng pháp ch n oán b nh vàng greening b ng sinh h c phân t : Theo ph ng pháp ch n oán b nh vàng green ing c a Hung et al., 1999; Hocquellet et al., 1999 Jagouex et al., 1996 Ph ng pháp nghiên c u lan truy n qua h t gi ng, qua m t ghép môi gi i: T heo ph ng pháp th ng qui nghiên c u b o v th c v t 2.4.3 Ph ng pháp nghiên c u xác nh ký ch s phân b c a ch ng vi khu n gây b nh vàng greening n qu có múi m t s t nh phía B c Vi t Nam Theo ph ng pháp c a Su, (2008), Hung et al., 1999 C p m i c hi u xác nh ch ng vi khu n gây b nh có múi c a Tomimura et al., 2010 2.4.4 Ph ng pháp nghiên c u gi i pháp phòng ch ng b nh VLG Ph ng pháp vi ghép nh sinh tr ng: Theo ph ng pháp c a Su and Chu (1984) Quy trình vi ghép bao g m chu n b g c ghép nh sinh tr ng, vi ghép n 1, nuôi u ki n inv itro Sau ó, vi ghép l n chuy n v n m T rong nghiên ã hoàn thi n c i ti n m t s b c quan tr ng nh m làm t ng l s ng s ch b nh vi ghép nh sinh tr ng t o gi ng s ch b nh Ph ng pháp s n xu t gi ng s ch b nh: c th c hi n theo quy trình khép kín h th ng nhà l i c p bao g m: Giá th làm b u gieo h t; K thu t s n xu t gi ng nhà l i b ng h n h p b u không t; K thu t ph ng pháp ghép m t Ph ng pháp ánh giá tính ch ng ch u c a g c ghép hi n ang s d ng n xu t gi ng i v i b nh vàng greening: Theo ph ng pháp c a Kranz (1988) Bowen (2004) Ph ng pháp nghiên c u ch ng tái nhi m b nh ng ru ng: T heo ph ng pháp nghiên c u th ng qui v b o v th c v t i v i n qu có múi 2.5 Ph ng pháp x lý s li u thí nghi m: S li u thí ngh i m c x lý th ng kê ng ph n m m MS.Exel, 2007 ch ng trình IRRISTAT VERSION 5.0 T QU Ch ng NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 3.1 M c ph bi n tri u ch ng c a b nh vàng greening 3.1.1 Hi n tr ng s d ng gi ng n qu có múi t i Hà N i Hịa Bình Nh ng n m qua, di n tích n qu có múi c phát tri n nhanh, nh ng u h t h s n xu t v n ch a xác nh c s nguy hi m c a ngu n b nh ti m n K t qu u tra v ngu n g c ch t l ng gi ng Hà N i cho th y ng i dân t s n xu t gi ng ch i m 46,67%, gi ng không rõ ngu n g c chi m 40,0%, gi n g mua t c s s n xu t ch chi m 13,33%; t ng t Hòa Bình t l n l t 20%; 33,33%; 53,33% 3.1.2 M c ph bi n c a b nh vàng greening t i vùng u tra t qu u tra ánh giá h i n tr ng m c ph bi n c a b nh t i vùng sinh thái, b nh vàng greening xu t hi n gây h i n qu có múi t t c vùng, v i t l b nh t 10,49 – 50,93% T rong s ó, v n n qu có múi i vùng Tây B c có t l b b nh th p nh t (10,43%), vùng ng b ng sơng H ng 13,95- 16,34%, cịn vùng B c Trung b 14,97- 39,2% vùng ông B c b n ng nh t t 21,18- 50,93% B nh VLG gi ng b i Thanh Trà Th y Bi u H ng Vân (Th a Thiên Hu ) v i t l b nh ghi nh n c 14,97% Trong s t nh ã ti n hành u tra v n n qu có múi có t l b nh vàng greening th p nh t t nh Hồ Bình (10,49%) t nh b h i n ng nh t Qu ng Ninh (50,93%) Có s khác bi t rõ r t v t l b b nh m c m c b nh gi a a ph ng trình canh tác k thu t qu n lý b nh không u gi a vùng (Hà Minh Trung, 2003; Ngô V nh Vi n cs., 2012) 3.1.3 M c nhi m b nh vàng greening ch ng lo i có múi vùng sinh thái T rong n m (2010- 2012) ã ti n hành u tra, thu th p phân tích v i t ng 175 m u, s ó có t i 81 m u ch nhi m v i b nh vàng greening, chi m 46,28% s m u thu th p ánh giá S m u l i c xác nh ã b nhi m m t ba b nh (tristeza, tatter leaf exocortis) b nh lý khác u ó cho th y c nhi m b nh VLG t i v n n qu có múi t nh phía B c ph bi n, th hi n m c tr m tr ng quan tâm c a th c ti n s n xu t hi n u thu th p cam quýt cho t l b nhi m b nh cao nh t, t t i 81,81% cam 86,00% quýt Còn chanh b i có t l m u nhi m nh g n ngang (68,57 66,67%) Riêng m u thu th p t qu t cho t l b nhi m b nh th p nh t, ch có 60% s m u b nhi m b nh 3.1.4 M c nhi m b nh vàng greeining h n h p v i b nh vi rút, viroid n qu có múi Các b nh vi rút khác ã góp ph n làm cho q trình suy thối v n n qu có múi ngày tr m tr ng h n B nh vàng greening tristeza ã ã gây h i n ng t t c lồi có múi u tra T l m u b nhi m b nh vàng green ing s m u u tra t 60,0 n 86,0%; b nh tristeza t 27,91 n 37,78% c bi t, trình u tra, l n u tiên ã xác nh c b nh exocortis gây h i cam, v i t n su t b t g p chi m 14,28% t ng s m u thu th p b nh tatter leaf gây h i quýt, chi m t i 9,68% t n g s m u thu th p (b ng 3.5) ng 3.5 K t qu xác nh s hi n di n c a b nh vàng greening m t s nh vi rút h i có múi m t m u b nh b ng sinh h c phân t (t i Vi n B o v th c v t, 2010 – 2012) Ch ng lo i Tên ng s m u l (%) m u b b nh QCM khoa h c phân tích VLG CTV CTLV CEVd Cam Citrus sinensis 55 81,81 37,78 14,28 Quýt Citrus reticulata 50 86,00 27,91 9,68 i Citrus grandis 35 68,57 31,43 0 Chanh Citrus aurantifolia 15 66,67 30,0 0 Qu t Citrus microcarpa 20 60,00 33,33 0 Ghi chú: VLG: Vàng greening; CTV: B nh tristeza; CEVd: B nh Exocortis; C QCM: n qu có múi CTLV: B nh tatter- leaf; 3.1.5 Xác nh nhóm tri u ch ng b nh vàng greening qua phân tích b ng sinh c phân t T ri u ch ng b nh vàng greening quan sát b ng m t th ng khó có th phân bi t c nh ng có tri u ch ng b nh n ho c m i ch m b b nh t h p ph ng pháp truy n th ng v i công ngh sinh h c ã chia tri u ch ng nh vàng greening m nhóm tri u ch ng (Lá vàng l m m; Vàng c c t ng cành/cây; Lá vàng l m m vàng c c b ; Khô cành, ch t cây, vàng qu b chín ng c), nhóm tri u ch ng nhi m h n h p v i b nh tristeza (Lá vàng, gân trong; Gân b s ng n ; Th p lùn cây) tài l n u tiên ã thu c tri u ch ng n hình v i b nh vàng greenin g qu (hình 3.2 ; 3.5 3.6) Hình 3.2 Lá vàng c c b Hình 3.5 Tri u ch ng qu cam Hình 3.6 Tri u ch ng vàng, b nh greening gân Ngu n (hình 3.2; 3.5 3.6): Lê Mai Nh t, 2012 Nh v y, b nhi m b nh VLG ng th i nhi m b nh tristeza ã làm cho b tàn l i nhanh, gây t n th t l n n n ng su t ch t l ng qu thu ho ch 3.1.6 Ki m ch ng kh n ng nhi m b nh vàng greening ng ru ng d a tri u ch ng ã xác nh Cùng v i m u u tra ã thu th p, tài ã ng d ng công ngh sinh h c giám nh s hi n d i n b nh vi rút viro id n qu (b ng 3.9) K t qu giám nh b nh b ng sinh h c phân t cho th y, b nh tristeza ã xu t hi n t t c m thu th p m u T i Hà N i, ã xác nh c s hi n di n c a c ba b nh (tristeza, tatter leaf exocortis) có múi Ngh An ã xác nh c b nh exocortis b ng RT-PCR ghép ch th (Etrog citron 861) T i B c Quang, Hà Giang ã thu c b nh tristeza b nh tatter leaf (ghép ch th Rusk citrange) ng 3.9 S phân b c a m t s loài vi rút viroid n qu có múi thu nh n m t s t nh phía B c Vi t Nam (Vi n B o v th c v t, 2011) a m Ch ng lo i Cây n qu có múi Cam Xã ồi Liêm Qu t (Hà N i) i Di n Cam Canh c Quang (Hà Giang) Cam Sành Cam Xã oài Ngh An Quýt P Q Ghi chú: - : Ch a ghi nh n c; + : Ghi nh n c b nh b ng ph t qu giám nh b nh Tristeza T atter leaf Exocortis (Strip) (RT-PCR) (RT-PCR) + + + + + + + + + + + ng pháp RT-PCR, Strip 11 im t 10 RCC b nh ã bi u hi n tri u ch ng gi n g cam Xã ồi sau tháng cơng th c gi lây nhi m, 12 gi 36 gi b nh ã bi u hi n sau tháng, t b b nh t t 8,33 n 41,67% Gi ng cam Canh sau tháng lây nhi m t l nh t t 8,33 n 16,67% Trên gi ng b i Di n b nh ch a bi u hi n tri u ch ng ng 3.14 nh h ng c a m t r y ch ng cánh n kh n ng lan truy n nh vàng greening (Nhà l i Vi n B o v th c v t, tháng 4/2011) Ch ng lo i n qu t RCC/cây r y ch ng cánh k t qu phân tích b ng PCR RCC/cây RCC/cây RCC/cây Sau Sau tháng tháng Sau tháng có múi Sau Sau Sau tháng tháng tháng Cam Canh Cam Xã oài i Di n i ch ng - - - Sau tháng - - 8,33 8,33 - 8,33 - Sau tháng 16,67 16,67 ± - Ghi chú: Các cơng th c thí nghi m c nhi m RCC 24h; - : K t qu âm tính i b nh vàng greening; ±: Khơng c ó tri u c h ng PCR không rõ ràng; i ch ng: Th r y ch ng cánh s ch b nh gi ng s ch b nh 3.2.3 M t r y ch ng cánh Diaphorina citri Kuw ayama n qu có múi Cây n qu có múi n u c tr ng b ng gi ng s ch b nh s lan truy n b nh VLG t nhiên môi gi i D citri Kuwayama a d ng v ch ng lo i n qu có múi c ng nh ch ch m sóc khác ã làm cho d ch h i bùng phát nhanh h n h u nh chúng có tính thích nghi v i u ki n kh c nghi t cao h n RCC xu t hi n c 12 tháng n m nh ng v i m t khác M t môi gi i v n n qu ph thu c vào ngu n th c n, quy trình ch m sóc qu n lý d ch h i, c bi t liên quan n t l c n m nhi t mùa M t RCC cao nh t t l c hè, xuân, gi m d n l c Thu ông Ngh An v n n qu khơng c ch m sóc m t RCC trung bình 25,15 con/cây Trên v n c ch m sóc m t RCC th p h n h n (hình 3.18) Hình 3.18 M t r y ch ng cánh v n cam Xã oài Ngh An t l c n m, l c hè cho m t r y ch ng cánh cao nh t, ti p n l c xuân, l c thu; t l c ông m t r y ch ng cánh r t th p T i v n cam khơng thâm canh, m t trung bình c a r y ch ng cánh t 25,15 con/cây, ó v n cam thâm canh ch thu c 4,05 con/cây T ng t l c xuân (21,5 3,7 12 con/cây), l c thu (12,25 2,65 con/cây), l c ông (3,95 0,9 con/cây) i v n cam Canh Hà N i, m t r y ch ng cánh cao t ng n Ngh An c hai v n, m t môi gi i c minh h a qua hình 3.19 ng v i Hình 3.19 M t r y ch ng cánh v n cam Canh Hà N i i Cao P hong, Hòa Bình vào kho ng th i gian t l c n m c ti n hành u tra ghi nh n m t r y ch ng cánh v n không c thâm canh nh ng m t ã th p h n h n so v i Hà N i Ngh An t l c hè m t r y ch ng cánh ch t 17,35 con/cây; l c xuân l c thu t 7,05 – 9,6 con/cây; v n thâm canh, m t r y ch ng cánh dao ng t 0,85 - 2,45 t l c (hình 3.20) Hình 3.20 M t r y ch ng cánh v n cam Xã ồi t i Cao P hong, Hịa Bình Nh v y, k t qu u tra cho th y m t r y c h ng cánh phát sinh cao vào t l c chín h n m Trên v n cam không thâm canh m t r y ch ng cánh cao h n so v i v n thâm canh, có th v n khơng thâm canh câ y c ta cành t o tán, nhi u ch i v t l c phát sinh r i rác quanh n m ã t o u ki n ngu n th c n thu n l i cho r y ch ng cánh phát tri n th ng xuyên xu t hi n ng ru ng K t qu u tra thu c t ng t v i k t qu c a Vi n B o v th c v t nh ng n ghiên c u tr c (Ph m V n L m, 2005) S li u u tra c s khoa h c b trí ngh i m ánh giá s tái nhi m b nh ng ru ng qua môi gi i 3.3 Nghiên c u xác nh ký ch s phân b c a ch ng vi khu n gây b nh vàng greening n qu có múi phía B c Vi t Nam 3.3.1 Ký ch c a b nh vàng greening T rong s loài ã thu th p c l a ch n 14 dòng/gi ng ti n hành ánh giá tính ch ng ch u c a b nh VLG v i m t s gi ng v t li u g c ghép Các gi ng thu th p thu c chi Citrus u bi u hi n b nh sau tháng lây nhi m, gi ng b i (Citrus maxima) chanh (Citrus lemon) sau tháng m i b b nh (b ng 3.17) T rong s dòng gi n g thu th p c, nh t ch có Ti n chót (Severinia 13 buxifolia) r t m n c m v i b nh VLG, tri u ch ng n hình m c dù không thu c chi cam chanh, k t qu phù h p v i Su et al (2012) T ng t nh v y, nguy t qu d n d c a r y ch ng cánh nh tác gi ngồi c ã cơng b Qua nghiên c u, tài b c u phát hi n xác nh thêm Móc m t (Clausena excavata) c ng m t nh ng ký ch a thích c a r y ch ng cánh nh ng không b nh i m b nh VLG Vì v y, có th l a ch n Ti n chót làm ch th ph c v nghiên c u v b nh vàng greening, Nguy t qu Móc m t c s d ng nhân nuôi ngu n r y ch ng cánh s ch v i s l ng l n trí thí nghi m nhà l i c ng nh thí nghi m d i n r ng ng 3.17 Kh n ng gây b nh c a vi khu n Liberibacter asiaticus m t s ch ng lo i thu c h Rutacea (Nhà l i Vi n B o v th c v t, 2011) T ên loài T ên ti ng Vi t t qu giám nh P CR l (%) tháng tháng tháng Citrus sinensis Cam ng ình + + 100 Citrus unshiu Quýt ôn châu + + 100 Citrus nobilis Cam sành + + 100 Citrus reticulata quýt + + 100 Citrus maxima i + 100 Citrus hyxtric Ch p + + 100 Citrus lemon Chanh + 100 Citrus aurantifolia Chanh ta + + 100 Citrus jambrihi Chanh s n + + 100 Fotunella japonica Qu t + + 100 Clausena excavata Móc m t Murraya paniculata Nguy t qu Atalantia guillauminii Quýt hôi Severinia buxifolia Ti n chót + + 100 Ghi chú: +: D ng tính v i b nh vàng greening; -: Âm tính v i b nh vàng greening; LBNT: Lây b nh nhân t o 3.3.2 Xác nh ch ng vi khu n gây b nh vàng greening qua ph n ng c a m t ch ng lo i n qu có múi v i ngu n b nh T rong t ng s 81 m u b nh c ánh giá chia làm b n nhóm g m m u nh thu th p t cam (24 m u), quýt (30 m u), b i (13 m u) chanh, qu t 14 m u b nh i t ng s 24 m u thu th p t cam b b nh (b ng 3.18), có 10 m u thu c ch ng II (chi m 41,67%), 14 m u thu c ch ng I (chi m 58,33%) Các ch ng gây nh VLG c kh ng nh b ng sinh h c phân t v i c p m i c hi u c a T omimura et al., 2010 ng t thí nghi m ánh giá v i 30 ngu n m u thu th p t quýt b b nh i gi ng có múi, k t qu thu c ch ng I II ngang (15 m u cho i ch ng vi khu n gây b nh) 14 ng 3.18 Ph n ng c a ch ng lo i n qu có múi v i ngu n m u thu th p cam (Citrus sinensis) b b nh vàng greenin (Nhà l i Vi n B o v th c v t, 2013) STT Ngu n m u nh Ph n ng c a ch ng lo i n qu có múi v i m u b nh vàng greening (C p 0-3) Cam Xã Cam i oài Canh Di n (Citrus (Citrus (Citrus sinensis) reticulata) grandis) Chanh Eureka (Citrus limon) Ch ng vi khu n gây b nh Ch ng Ch ng I II G/x -I-1-1 3 3 × G/x -I-2-2 3 0 × G/x -I-3-4 3 3 × G/x -II-1-2 3 0 × G/x - II -1 -3 3 2 × G/x - II -1 -6 3 3 × G/x - II -2 -7 3 3 × G/x - II -3 -5 0 × G/x - II -3 -9 0 × 10 G/x - II -4 -1 3 0 × 11 G/x - II -4 -2 3 3 × 12 G/x - II -4 -4 3 0 × 13 G/x - II -4 -8 2 0 × 14 G/x -III-1- 3 3 × 15 G/x -III-3- 3 0 × 16 G/x -III-3- 2 0 × 17 G/n.s-III-4- 0 × 18 G/n.s-III-4- 3 0 × 19 G/n.s-III-5- 3 3 × 20 G/c.l-VI-1-1 3 0 × 21 G/c.l-VI-1-3 0 × 22 G/c -VI-1-4 3 0 × 23 G/c -VI-3-1 3 2 × 24 G/t.q-VI-4-2 3 3 × i ch ng âm 0 0 0 T ng 14 10 Ghi chú: I: Hà N i, II: Ngh An, III: Hịa Bình, VI: Qu ng Ninh; x : cam Xã oài, n.s: cam Nam S n, c.l: cam lai, c : cam ng, t.q: cam Trung qu c, Ph n ng c a loài n qu có múi n m u b nh c s hóa theo m c : = khơng có tri u ch ng; = có màu vàng nh t; = vàng l m m v i còi c c, th p lùn m c trung bình; = tri u ch ng b nh HLB n hình, vàng l m m, ng d y cong, còi c c 15 i 13 m u b nh thu th p t gi ng b i c ánh giá ã thu c m u nhi m ch ng I m u nhi m ch ng II Ch ng II ã xu t hi n gi n g b i khác m c bi u hi n tri u ch ng c ng khác (b ng 3.20) Ch ng I II gây nh ch ng lo i có múi c t ng h p b ng tri u ch ng hình 3.25 ng 3.20 Ph n ng c a ch ng lo i n qu có múi v i ngu n m u thu th p t b i (Citrus grandis) b b nh vàng greening (Nhà l i Vi n B o v th c v t, 2013) TT 10 11 12 13 Ngu n m u nh G/b.d-I-1-1 G/b.d-I-1-6 G/b.d-I-4-3 G/b.d-I-4-4 G/b.d-I-4-5 G/b.d-V-1-3 G/b.m-VI-3-4 G/b.n-VII-1-2 G/t.tr-VIII-1-5 G/t.tr-VIII-1-6 G/t.tr-VIII-2-1 G/t.tr-VIII-3-1 G/t.tr-VIII-4-1 T ng Ph n ng c a ch ng lo i n qu có múi v i m u b nh vàng greening (C p 0-3) Cam Xã Cam Canh i Di n Eureka oài (Citrus (Citrus (Citrus (Citrus reticulata) grandis) limon) sinensis) 3 3 3 0 3 0 3 3 3 0 3 0 3 2 3 2 3 3 3 3 3 0 3 3 3 0 Ch ng vi khu n gây b nh Ch ng I Ch ng II × × × × × × × × × × × × × Ghi chú: I: Hà N i, V: B c Giang, VI: Qu ng Ninh, VII: Hà Giang, VIII: Th a Thiên Hu ; b.d: B i Di n, b.n: B i Ng t, b.m: b i M , t.tr: b i Thanh Trà i v i chanh qu t lồi có múi c dùng làm gia v c nh nên c quan tâm n b nh Các m u b nh t chanh qua ánh giá ã thu c m u thu c ch ng II (chi m 33,3%), qu t thu c m u mang ch ng II (chi m 12,5%) M u b nh t qu t cho ph n ng v i gi ng b i Di n chanh Eureka c u sau lây b nh nhân t o v i c ánh giá b ng tri u ch ng ã c phân tích b ng k thu t duplex-PCR, v i i lo i primer c hi u (DNApo l/nusGrplK operon)[Tomimura et a l., 2010] S n ph m P CR c a primer DNA Poly thu c 988bp; s n ph m PCR c a primer nusG-rplK operon thu c 627bp Hai lo i primer m t ph n ng cho phép nh n bi t ch ng I, II III Ch ng I s n ph m t PCR ã xu t hi n v ch v i s n ph m nh trên; ch ng II thu c s n ph m 627 bp (hình 3.26) K t h p gi a ph ng pháp truy n th ng v i sinh h c phân ã xác nh c ch ng gây b nh vàng greening Vi t Nam s phân b a ch ng vi khu n gây b nh vùng u tra (hình 3.27) 16 988 bp 627 bp Hình 3.25 Ch ng I gây b nh cam Xã oài cam Canh; Ch ng II gây b nh gi ng (b i Di n, chanh Eureka, Xã oài cam Canh) Hình 3.26 K t qu duplex-PCR xác nh ch ng gây b nh [CC: Cam canh, RL=Rumprue lime, Cal=calamondin (Qu t)] Ch ng I: s n ph m thu c 988bp 627bp; Ch ng II: s n p h m thu c 627bp (Ngu n: Lê Mai Nh t, 2013) Hình 3.27: S phân b c a ch ng vi khu n gây b nh vàng greening có múi 3.4 Nghiên c u bi n pháp phòng ch ng b nh vàng greening 3.4.1 Nghiên c u c i ti n k thu t vi ghép nh sinh tr ng t o u dòng ch b nh 3.4.1.1 Nghiên c u c i ti n k thu t t o g c ghép l n vi ghép nh sinh tr ng t qu thí ngh i m ã xác nh c môi tr ng MS k t h p v i 0,5 gam than ho t tính lít mơi tr ng áp ng c u ki n c n vi ghép, ng kính thân t 1,51mm ng th i ã ánh giá l g c ghép (cam lá, b i chua, ch p, cam sành, quýt Cleopatra) s d ng vi ghép nh sinh tr ng n t l ng c a vi l n G c ghép ch p b i chua cho t l s ng sau vi ghép l n t 27 – 36% v i gi ng b i Ph c Hòa 30,2 – 41,7% v i gi ng cam Tr ng ng T rong k thu t vi ghép nh sinh tr ng, s d ng g c ghép kh e, có ch t ng s làm t ng kh n ng hút n c ch t dinh d ng cho s phát tri n c a nh 17 sinh tr ng T hí ngh i m tìm hi u nh h ng c a tu i g c ghép cam n t l ng c a cam Tr ng V ng (b ng 3.27) K t qu cho th y n u s d ng g c ghép non (1 tu n tu i) ho c già (4 tu n tu i) cho t l s ng th p h n so v i g c ghép t 2- tu n tu i N u s d ng g c ghép tu n tu i kh n ng tái sinh c a mô t bào nhanh t o l p mô s o làm l n át nh sinh tr ng, c n tr vi c phân hóa ch i G c ghép tu n tu i cho kh n ng tái sinh ch m lành v t th ng nên nh sinh tr ng d b khơ sau ó b ch t Cây g c ghép t - tu n tu i phù p nh t cho t l vi ghép s ng cao nh t, t t 28,0 – 34,0% ng 3.27 nh h ng c a tu i g c ghép l n n t l s ng sau vi ghép v i gi ng cam Tr ng V ng (Vi n B o v th c v t, 2010) Tu i g c l thành công Không thành công Không thành công ghép (%) ch t ch i (%) t o mô s o (%) c c a tu n 10,0 10,0 80,0 tu n 34,0 a 26,0 bc 40,0 b ab b bc tu n 28,0 38,0 36,0 tu n 20,0 b 70,0 a 10,0 c CV(%) 20,1 16,8 21,8 3.4.1.2 Nghiên c u c i ti n môi tr ng l ng nuôi vi ghép l n sung BAP 0,5mg/l vào môi tr ng MS n ng phù h p nh t n t l ng sinh tr ng phát tri n c a ch i c vi ghép S sai khác có ý ngh a công th c (b ng 3.28) ng 3.28 nh h ng c a BAP n t l s ng sau vi ghép l n gi ng b i Ph c Hòa (Vi n B o v th c v t, 2010 - 2011) l thành công m i m c Chi u dài ch i Môi tr ng (%) (Sau 20 ngày) (mm) c d b MS 27,8 2,1 4,7 MS + 0,5mg/l BAP 44,3 a 5,4 a 9,8 a ab b ab MS + 1,0mg/l BAP 39,4 4,2 7,0 MS + 1,5mg/l BAP 35,6 b 3,6 bc 3,9 b CV(%) 12,3 19,7 21,1 hoàn thi n k thu t vi ghép, tài ti p t c nghiên c u t i u hóa k thu t vi ghép nh sinh tr ng K t qu t i u c phát tri n ph ng pháp nghiên c u c a Su (2008), áp d ng t i phịng thí nghi m Vi n B o v th c v t phịng thí ngh i m tr ng i h c t ng h p ài Loan Mô i tr ng n n s d ng nghiên c u môi tr ng MS l ng b sung thêm ch t u ti t sinh tr ng (iinositol, thiamine-HCL, pyrido xine-HCL, n icotine) d ng ch t u ti t trên, t l s ng vi ghép c nâng lên, kh ng cho ghép l n hai nhanh h n K thu t vi ghép nh sinh tr ng tr nên d dàng d thành công h n S u vi t c a vi c b sung ch t u ti t sinh tr ng nh sinh tr ng d s ng, có kh n ng b t ch i s m ng th i t o kh n ng ti p h p gi a ch i ghép g c ghép nhanh (b ng 3.29) 18 ng 3.29 nh h ng c a ch t u ti t sinh tr ng c b sung vào môi tr ng l ng vi ghép nh sinh tr ng (Vi n B o v th c v t, 2012) Công th c ng s vi ghép l thành công (%) MS 35 14,29 MS + Ch t u ti t sinh 35 34,28 tr ng Ghi chú: Ch t u ti t sinh tr ng (i-inositol, thiamine-HCL, pyrido xine-HCL, nicotine) 3.4.1.3 Bi n pháp làm t ng t l s ch b nh vàng greening i v i có múi nh sinh tr ng c x lí vơ trùng, vi ghép t l vi ghép s ch b nh ho c không s ch b nh thu c ph thu c vào k thu t kích th c c t nh sinh tr ng vi ghép nh sinh tr ng c t dài t l s ng cao, nh ng t l ch b nh l i gi m i (b ng 3.30) ng 3.30 K t qu th nghi m kích th c nh sinh tr ng khác n kh n ng làm s ch b nh sau vi ghép l n (Vi n B o v th c v t, 2012) Gi ng vi ghép Kích th c l l l thí nh sinh ch b nh ch b nh ng sau ngh i m vi ghép tr ng tristeza greening (%) (%) (%) Mô phân sinh B i Ph c Hòa 30 Cam Tr ng V ng 30 Mơ phân sinh i Ph c Hịa 30 26.7 100 63,3 m m Cam Tr ng V ng 30 33.3 100 73,3 Mô phân sinh i Ph c Hòa 30 36.7 73,3 23,3 - m m Cam Tr ng V ng 30 46.7 80,0 46,7 3.4.1.4 nh h ng c a tu i vi ghép l n n s sinh tr ng phát tri n a vi ghép l n Theo nghiên c u c a Navarro (1972) Hyun (2012) có th a vi ghép n t n ki n invitro c tr ng tr c ti p vào h n h p b u u ki n nghi m ng t c i ti n nâng cao hi u qu , nghiên c u c a Su (1984; 2008) ã s d ng k thu t ghép l n Tu i vi ghép l n cho hi u qu thành công cao nh t t – tu n tu i ( t t 76,9 n 91,7%) ng 3.31 nh h ng tu i vi ghép l n n t l s ng c a ghép l n (Nhà l i Vi n B o v th c v t, 2010 - 2012) T u i vi i Ph c Hòa Cao B ng Cam Tr ng V ng Cao B ng ghép l n ng s l s ng ng s l s ng vi ghép (%) vi ghép (%) tu n tu i 13 15,4 16 18,8 tu n tu i 14 78,6 13 76,9 tu n tu i 10 90,0 12 91,7 T rong k thu t vi ghép nh sinh tr ng, công n x lý ch i c quan tâm, ch i c s d ng vi ghép r t d b t n th ng Qua th c ti n thao tác x lý ch i, ã c g ng tìm gi i pháp kh c ph c hi n t ng K t qu ã xác 19 nh b ng v i c s d ng – gi t T ween 20 cho vào dung d ch kh trùng n c c t vơ trùng Khi ó ch i s n m l l ng ph n g n d i c c ch a dung d ch kh trùng, lo i b dung d ch kh trùn g r a b ng n c c t vô trùng, ch i s l i c c, thao tác dàng, ch i khơng b d p, nát Tween 20 cịn có tác d ng làm th m loang vào nách m m lá, nên tác d ng kh trùng t t h n t l b t p nhi m n m h n 3.4.2 S n xu t gi ng có múi s ch b nh h th ng nhà l i c p Ch t l ng gi ng y u t quan tr ng phát tri n n qu có múi m b o gi ng s ch b nh ph i c s n xu t nhà l i c p ngu n m t ghép l y t c vi ghép nh sinh tr ng ng th i ã c ki m tra công nh n s ch b nh nh pb u c c i ti n v i t l 1/5 cát vàng + 2/5 mùn c a g t p + 2/5 phân mùn h u c vi sinh C i ti n ã làm t ng l ng d inh d ng ban u cung p cho cây, t ng t i x p, t ng kh n ng gi m dinh d ng Cây g c ghép sau tháng ã t tiêu chu n ghép, cịn cơng th c không c i ti n giá th th i gian ni nh t t tháng sau tr ng (trong u ki n th i ti t m) m i t tiêu chu n ghép C i ti n giá th ã ti t k i m c công t i n c, công b xung phân bón B r c a ln phát tri n t t, t ng kh n ng ch ng ch u v i tác nhân gây nh vùng r n xu t gi ng h th ng nhà l i c p c th c hi n c 12 tháng c a n m; th i v ti n hành ghép t t nh t v hè Kho ng nhi t t 28 – ° 38 C phù h p cho công n ghép cây, t l m t s ng t 94,67%, s m t ghép ng m c thành t 84,88%, t l có c t l c cho m t ghép v hè c kh e, khơng có m t ng nên m t ghép có t l s ng b t m m nhanh d ng gi y parafilm k thu t ghép s n xu t gi ng, t l s ng c a t ghép cao h n h n so v i ph ng pháp ghép thông th ng, h n ch c b nh ch y gơm, b th i m t ghép, m c kho , u C i ti n quan tr ng t o cho nhanh b t m m kho u m c a vi c dùng gi y ghép nilon giá thành r nh ng nh c m không b o v c môi tr ng l ng nilon ghép l i 3.4.3 Tính ch ng ch ng ch u c a g c ghép hi n ang s d ng s n xu t gi ng v i b nh vàng greening 3.4.3.1 Tính ch ng ch u c a g c ghép (B i chua, ch p) v i b nh vàng greening c ghép c xem y u t thành công c a gi ng, t o nên ch t l ng s n ph m tu i th c a c ng nh tr ng l ng qu B c u tìm hi u ánh giá tính ch ng ch u c a g c ghép v i b nh vàng greening Ngu n b nh c s d ng i ch ng I gây b nh b i Di n; ch ng II gây b nh cam Nam S n, hai ch ng hi n ang ph bi n phía B c Vi t Nam Sau lây nhi m nhân t o b ng m t ghép b b nh, g c ghép ã bi u hi n tri u ch ng b nh (b ng 3.35) Ghép b nh b ng ch ng II có c tính cao, tri u ch ng bi u hi n nhanh, sau hai tháng t l b nh 25,55% (g c ghép b i chua), 33,33% (g c ch p) 20 ng 3.35: T l b nh sau lây nhi m nhân t o b ng ghép m t b nh i v i c ghép hi n ang s d ng tro ng s n xu t gi ng (Nhà l i Vi n B o v th c v t, 2012) tháng tháng tháng Cây g c Ngu n b nh ghép (cây cung c p m t TLB p TLB p TLB p ghép b b nh ) (%) nh (%) nh (%) nh c c c i chua Ch ng I 0,0 28,89 51,48 b b a i chua Ch ng II 25,55 70,37 92,59 c c b Ch p Ch ng I 0,0 31,11 85,0 a a a Ch p Ch ng II 33,33 88,89 92,59 LSD0.05 0,94 6,04 7,32 CV(%) 3,4 5,9 4,8 Ghi chú: Ch ng I: ngu n b nh t b i Di n; Ch ng II: ngu n b nh t cam Nam S n T ác nhân gây b nh vàng greening ã nh h ng tr c ti p n g c ghép làm h n ch g c ghép phát tri n chi u cao T rong trình theo dõi, ch ng gây nh có kh n ng b bi n i c tính th h lây nhi m ti p theo Cùng m t ch ng lây b nh m t i t ng c hai lo i g c ghép nh ng ã cho th p lùn h n h n Hi n t ng b th p lùn ã ch ng minh c tri u ch ng th p lùn c a ng ru ng K t qu phù h p v i ngh iên c u c a Su et al., (2008, 2012); (Hung et al., 2012) v ánh giá tính ch ng ch u b nh c a b i Chua Ch p 3.4.3.2 Tính ch ng ch ng ch u c a g c ghép nh p n i v i b nh vàng greening c ghép nh p n i t ài Loan (Cleopatra mandarine, Swingle citrumelo, Fruit dragon, Volkamer lemon, Poncirus trifoliata, Carrizo citrange, Troyer citrange, Rangpur lime) c tr ng phát tri n Vi t Nam tìm lo i g c ghép phù h p cho nhân gi ng s ch b nh i v i t ng lo i n qu có múi khác B c u ánh giá tính ch ng ch u b nh VLG g c ghép nh p i (b ng 3.37) G c ghép Cleopatra, Carrizo citrange, Rangpur lime bi u hi n tri u ch ng s m, n ng tháng th n sau lây nhi m ng 3.37: T l b nh sau lây nhi m nhân t o b ng ghép m t b nh i v i g c ghép nh p n i (Nhà l i Vi n B o v th c v t, 2012 - 2013) STT Cây g c ghép Tri u ch ng b nh Tri u ch ng b nh sau tháng (C p b nh) sau tháng (C p b nh) Cleopatra mandarine Swingle citrumelo Fruit dragon Volkamer lemon Poncirus trifoliata 1 Carrizo citrange Troyer citrange 1 Rangpur lime Ch p 10 B i chua Ghi chú: - : K hơng có tri u ch ng (c p 0); +: – 30% s b i u hi n tri u ch ng (c p 1); ++ : 31 – 50% s bi u hi n tri u ch ng (c p 2); +++: > 50% s bi u hi n tri u ch ng (c p 3) Ngu n m t ghép b b nh vàng greening t cam Nam S n 21 3.4.4 Nghiên c u ch ng tái nhi m b nh vàng greening ng ru ng 3.4.4.1 K t qu x lý m t ghép b b nh b ng kháng sinh Nh ng nghiên c u tr c ây th ng x lý b ng kháng sinh Tetracyline n ng 1% (Aubert Bové, 1980; Tsai et al., 2012) T rong nghiên c u này, d a vào c ch c a v t gây b nh, kháng sinh dùng x lý ch i b b nh Streptomycine (phù h p cho vi khu n nhu m gram âm) ng 3.38 nh h ng c a x lý Streptomycine n tri u ch ng nh vàng greening (Nhà l i Vi n B o v th c v t, 2012) l Tri u ch ng b nh sau x lý Công th c ng s ng (%) tháng tháng tháng thí nghi m Steptomycine 1% + 12 gi 20 100 + + + Streptom ic ine 1% + 24 gi 20 90 i ch ng (M t s ch b nh) 20 100 i ch ng (M t ghép b b nh) 20 90 + + + Ghi chú: - : Ch i m c k hông bi u hi n tri u ch ng; +: Ch i sau n y m m xu t hi n tri u ch ng lý Streptomycine 24 gi , m c sau ghép tháng th ch a xu t hi n tri u ch ng, ó x lý 12 gi ã bi u hi n tri u ch ng b nh sau tháng ghép M c dù không bi u hi n tri u ch ng b nh nh ng ki m tra b ng P CR cho k t qu d ng tính X lý kháng sinh Streptomycine có tác d ng c ch , ng n ch n không cho b nh phát tri n, trì m t s vi khu n m c th p 3.4.4.2 Hi u qu ch ng tái nhi m b nh vàng greening ng ru ng u ki n qu n lý khác Ngh iên c u bi n pháp khác nhau, v i ngu n g c gi ng s ch b nh, qu n lý môi gi i khác k t qu thu c b ng 3.40 ng 3.40: T l tái nhi m b nh vàng greening ng ru ng v i gi i pháp qu n lý b nh khác (Nghi L c, Ngh An, 10/2013) Công th c l b nh (%) c Xuân L c Hè L c Thu c b Cây gi ng s ch b nh + Không phun thu c 9,33 14,67c 16,0 Cây gi ng s ch b nh+Phun thu c nh k theo t 0,0 a 1,33a 5,33a c Cây gi ng s ch b nh + Canh tác c a nông dân 4,0 b 10,67 b 16,0b LSD0.5 0,66 1,15 1,99 CV (%) 7,5 6,5 9,4 Ghi chú: B t u ánh giá t l b nh sau tr ng 15 tháng; N gày tr ng: 25/12/2011; Ngày ánh giá n 1: 15/3/2013; Ngày ánh giá l n 2: 15/7/2013; Ngày ánh giá l n : 15/10/2013 t qu sau tr ng 15 tháng ã b tái nhi m b nh công th c không s d ng thu c b o v th c v t tr môi gi i (9,33%), công th c canh tác theo nông dân (4%) P hun thu c nh k theo t l c b nh ch a xu t hi n nh ng b nh ã b tái nhi m n ng h n sau l n ánh giá công th c x lý thu c t l b nh m i ch t 22 5,33% sau h n hai n m tr ng cơng th c cịn l i b nh ã t ng lên nhanh (16%) k t qu nghiên c u t c v b nh vàng greening phía B c Vi t Nam c ng nh m t s k t qu n c ã t c, xu t m t s gi i pháp phòng ch ng b nh VLG (b ng 3.41) ng 3.41 M t s gi i pháp phòng ch ng b nh vàng greening t hi u qu m t s t nh phía B c Vi t Nam (n m 2013) Gi i pháp Bi n pháp th c hi n Cây gi ng s ch - Tuy n ch n u dòng nh ng d ng k thu t vi ghép nh sinh tr ng ph ng pháp ch n oán b nh ã c c i ti n ph c tráng, b o t n u dòng s ch b nh n xu t gi ng s ch b nh g m l a ch n g c ghép phù h p, n h p b u không t k thu t ghép t tr ng - Gi i phóng t tr ng tr c tháng tr ng m i, thu d n tàn h y b ã b b nh VLG b nh vi rút khác Nên tr ng h u c it o t - Tr ng hàng rào ch n gió xung quanh v n tr ng b ng keo tai t ng - Ki m tra pH c a t t ng vùng có bi n pháp c i t o thích h p Th i v tr ng Nên tr ng mùa xuân, mùa thu t tr ng - Gi ng cam: 650 – 750 cây/ha - Gi ng quýt: 800 – 1000 cây/ha - Gi ng b i: 450 – 500 cây/ha Kích th c h t i núi: 1m × 1m × 1m tr ng t b ng ph ng, thoát n c t t: 0,8m × 0,8m × 0,8m t chuy n i t c y lúa, tr ng rau màu c n lên líp tr ng n i hồn tồn tránh ng p n c cho Bi n pháp canh - Làm c (x i c quanh g c tán lá, c t c tán lá) tác - Che ph g c b ng r m ph i khơ - Bón phân: Th i k ki n thi t c b n bón – l n/n m; th i k kinh doanh bón – l n/n m i n c: t p trung t i n c vào mùa khô a cành, t o tán Bi n pháp hóa Phun tr mơi gi i RCC giai n l c m i nhú b ng thu c c Confidor 100SL ho c thu c thu c nhóm n i h p ho c l u d n (n u có mơi gi i) Hu n luy n - Xác nh c môi gi i lo i d ch h i - Theo dõi quy lu t phát sinh c m gây h i - Qu n lý t ng h p d ch h i 23 Nh v y, bi n pháp phát huy c tác d ng hi u qu , trình th c hi n c n k t h p v i gi i pháp bón phân, c t t a t o tán t i n c t l c t p trung, ó ti n hành phun thu c s có tác d ng rõ r t L c t p trung s h n ch c ngu n th c n ng ru ng d n n m t RCC ng ru ng c ng gi m theo K thu t bón phân khơng ch l c t p trung, mà t o nên ch t l ng qu , n nh n ng su t qua t ng n m Gi i pháp t i n c ngồi vi c l c t p trung cịn có tác d ng h n ch nh n h i, tránh c hi n t ng r ng qu sinh lý khô ho c m ng th i kéo dài th i gian thu ho ch, nâng cao hi u qu kinh t v giá thành áp ng c nhu c u c a ng i tiêu dùng Tác d ng c a nguyên t a l ng vi l ng: N: t ng kh n ng sinh tr ng c a n ng su t; P: Phát tri n b r ch t l ng qu ; K: m b o tr ng l ng qu ch ng ch u v i u ki n b t thu n; Ca: Làm ch c thành t bào ch ng ch u v i u ki n b t thu n; Mg: có di p l c tham gia vào trình trao i thành ph n enzyme Các gi i pháp c n c áp d ng ng b nh ng linh ho t nâng cao hi u qu , gi m chi phí u t Trong ó gi i pháp v hu n luy n c n c quan tâm ng i s n xu t không hi u không n m b t c d ch h i có múi khơng th phịng tr c H n n a, th i m phát sinh gây h i ch y u c a t ng lo i ch h i c ng khác nên c n c b i d ng t m qu n lý t ng h p d ch b nh T LU N VÀ NGH K t lu n 1.1 Các vùng tr ng n qu có múi phía B c Vi t Nam b nhi m nh VLG v i t l b nh 10,49 - 50,93% B nh VLG th ng phát sinh b nh vi rút Trong t ng s m u d ng tính v i b nh VLG có 58,33 - 73,33% m u h n h p b nh tristeza v i tri u ch ng s ng n gân lá, th p lùn, vàng gân 35,07% m u b nhi m v i b nh tristeza, tatter leaf, b nh exocortis 1.2 B ng k thu t hi n vi n t ã xác nh c vi khu n gây b nh VLG (Liberibacter asiaticus) làm thối hóa m ch d n, gây tích t tinh b t làm ho i t l c p S d ng c p m i c hi u c a Sandrine Jagoueix (16S); A Hocquellet (A2 J5) Hung et al (1999) k t h p c i ti n b c tách chi t DNA b ng NaOH cho k t qu nhanh, xác t ng ng v i s d ng kít ch n ốn, giá thành r , khơng s ng hóa ch t c h i nh VLG nhanh bi u hi n tri u ch ng cam Xã oà i, cam Canh sau 45 ngày ghép lây b nh nhân t o M t RCC con/cây ho c con/cây ti p xúc 24 gi , tri u ch ng b nh (t ng ng) ch xu t hi n sau tháng tháng lây nhi m gi ng cam Xã oài cam Canh n u tiên xác nh ti n chót (Severinia buxifolia) thu th p c Th 24 Xuân, Thanh Hóa ký ch m n c m v i b nh vàng greening 1.3 B ng ph n ng c a m u b nh VLG v i ch th m t s ch ng lo i n qu (cam, quýt, b i, qu t) k t h p v i k thu t duplex-PCR ã xác nh c vi khu n gây b nh VLG phía B c thu c ch ng I II Ch ng II l n u tiên ghi nh n m t s t nh phía B c Vi t Nam T i Hà N i, B c Giang, Hà Giang, Ngh An Hịa Bình có t l m u nhi m ch ng I cao h n t l m u nhi m ch ng II (t ng ng 53,84 - 66,67% 33,33 - 46,16%) H ng Yên Th a T hiên Hu có t l m u nhi m ch ng I (33,33 - 40%) th p h n t l m u mang ch ng II (60 - 66,67%) T i Qu ng Ninh t l m u nhi m hai ch ng ngang 1.4 Xác nh c g c ghép - tu n tu i mô i tr ng MS k t h p v i 0,5 gam than ho t tính ni g c ghép l n phù h p nh t cho vi ghép nh sinh tr ng T l s ng trung bình c a vi ghép nh sinh tr ng l n t ng t 23,2 - 28,5% ( i v i b i cam) n 34,0 - 41,7% ( i v i b i Ph c Hịa, cam Tr ng ng) sung BAP 0,5 mg/lít vào môi tr ng MS l n g làm t ng t l s ng cao nh t kích thích sinh tr ng cho ch i vi ghép t 44,3% B sung ch t u ti t sinh tr ng (i-inositol, thiamine-HCL, pyrido xine-HCL, n icotine) cho t l thành công vi ghép l n 34,28% nh ng rút ng n c th i gian l u gi vi ghép l n phịng thí nghi m g c ghép l n (1,5 n tháng tu i x lý) nh sinh tr ng g m mô phân sinh m m cho hi u qu s ch b nh cao nh t, thu c 100% s s ch b nh VLG 63,3 – 73,3% s ch b nh tristeza d ng h n h p b u không t g m cát vàng, mùn c a g t p phân mùn vi sinh (theo t l 1/5:2/5:2/5) sau tháng g c ghép t tiêu chu n s n xu t gi ng s ch b nh 1.5 xu t c gi i pháp ch ng tái nhi m b nh VLG h n ch s lây lan c a b nh ng ru ng t h i u qu (X lý cành m t ghép b ng Streptomycine 1%, tiêu h y ngu n b nh, tr ng gi n g s ch b nh, th i v m t tr ng, bi n pháp canh tác, hóa h c, hu n luy n, v.v.) Sau hai n m t l b tái nh i m b nh VLG ch chi m 5,33% ngh 2.1 S d ng ph ng pháp giám nh b nh VLG b ng PCR v i c p m i a Sandrine Jagoueix (16S); A Hocquellet (A2J5) Hung et al (1999) c i ti n c tách chi t DNA b ng NaOH s rút ng n th i gian, h giá thành 2.2 S d ng gi ng có ngu n g c xu t x rõ ràng, c c quan có th m quy n c p ch ng ch gi ng s ch b nh greening b nh vi rút, viroid khác ch ng tái nhi m b nh DANH M C CƠNG TRÌNH Ã CƠNG B CÓ LIÊN QUAN N LU N ÁN Ngo Vinh Vien, Le Mai Nhat, Nguyen Bich Ngoc (2012), The Current Status of HLB Epidemic in Vietnam, International Symposium on Epidemiology and Disease management of Citrus HLB Disease for Sustainable Citrus Production in ASPAC; 5-10 Nov 2012 Nguy n Th Bích Ng c, Lê Mai Nh t, Ngơ V nh Vi n, Ph m Th Dung, Nguy n Nam D thu t vi ghép ng, Nguy n V n Vi t (2013), “Nghiên c u c i ti n k nh sinh tr ng có múi”, p chí B o vê th c t, s tr 36– 40 Lê Mai Nh t, Ngô V nh Vi n, Nguy n V n Vi t, Ngu y n Th Bích Ng c (2014), “Nghiên c u xác nh ch ng vi khu n gây b nh Huanglongbing (HLB) n qu có múi p chí B o v th c v t, s tr – 10 mi n B c Vi t Nam”, ... al 1999) ++ + ++ + ++ ++ ++ + + c ph ng pháp tách chi t DNA ch chi t thông Ngh i n th ng Eppendorf (Hung et al 1999) ng NaOH ++ + ++ ++ ++ + ++ + ++ Ghi chú: +: < 50 µg; ++ : 50 ~