ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ VĂN THẮNG TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN INTERFERON GAMMA NGƯỜI TRONG HỆ THỐNG BIỂU HIỆN E coli Ở QUY MÔ PHỊNG THÍ NGHIỆM CHUN NGÀNH: VI SINH MÃ SỐ: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN HOÀNG CHƯƠNG MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ iv LỜI MỞ ĐẦU vi 1.1 Giới thiệu chung IFN 1.1.1 Lịch sử phát 1.1.2 Đặc điểm chung 1.1.3 Phân loại nguồn gốc 1.2 Interferon gamma (IFN-γ) 1.2.1 Cấu trúc protein IFN-γ 1.2.2 Sự tạo thành protein IFN-γ 1.2.3 Cấu trúc thụ thể đường truyền tín hiệu protein IFN-γ 1.2.3.1Cấu trúc thụ thể IFN-γ 1.2.3.2Con đường truyền tín hiệu protein IFN-γ 10 1.3 Ứng dụng điều trị xơ gan tác động protein IFN-γ 12 1.3.1 Ứng dụng điều trị xơ gan protein IFN-γ 12 1.3.2 Những tác động protein IFN-γ điều trị bệnh 14 1.4 Biểu protein tái tổ hợp dạng thể vùi tế bào vi khuẩn E coli 19 1.4.1 Ưu điểm biểu protein tái tổ hợp tế bào E coli 19 1.4.2 Sự hình thành thể vùi tế bào chất E coli 20 1.4.3 Chủng E coli, hệ thống vector chế kiểm soát dùng biểu protein 20 1.4.3.1 Chủng E coli BL21(DE3) Star 20 1.4.3.2 Hệ thống vector biểu protein tái tổ hợp dạng thể vùi sử dụng promoter T7 21 2.1 Vật liệu 25 2.1.1 Chủng vi sinh vật 25 2.1.2 Vector 25 2.1.3 Gen IFN-γ 26 2.1.4 Các mồi dùng cho giải trình tự 26 2.1.5 Các thang chuẩn dùng cho điện di 27 2.1.6 Các kháng thể dùng cho lai Western blot 27 2.2 Hóa chất 27 2.2.1 Hóa chất dùng cho điện di DNA 27 2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt 28 2.2.3 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 28 2.2.4 Hóa chất dùng tinh DNA từ gel Agarose 28 2.2.5 Hóa chất dùng biến nạp plasmid 28 2.2.6 Hóa chất dùng cho điện di protein 28 2.2.7 Hóa chất dùng cho western blot 28 2.2.8 Hóa chất dùng biểu protein mục tiêu 29 2.2.9 Hóa chất dùng cho ELISA 29 2.2.10 Hóa chất dùng hòa tan IFN-γ từ tế bào E coli 29 2.2.11 Hóa chất dùng cho tinh chế protein tái tổ hợp 30 2.3 Dụng cụ thiết bị 30 2.4 Phương pháp 30 2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp 30 2.4.2 Hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli khả nạp 31 2.4.3 Cắt mở vòng vector pNanogen cặp enzyme NdeI/HindIII 31 2.4.4 Tạo vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ 31 2.4.5 PCR khuẩn lạc 32 2.4.6 Quy trình ni cấy chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ sinh tổng hợp protein IFN-γ quy mơ phịng thí nghiệm 33 2.4.7 Phương pháp điện di SDS-PAGE 34 2.4.8 Phương pháp lai western blot 34 2.4.9 Phương pháp ELISA 35 2.4.10 Thu nhận protein IFN-γ từ tế bào E coli 36 2.4.11 Tinh protein IFN-γ 37 2.4.12 Sắc ký HPLC 39 2.5 Sơ đồ tóm tắt tồn quy trình thực thí nghiệm 40 2.5.1 Quy trình tạo dịng E coli biểu protein IFN-γ 40 2.5.2 Quy trình lên men thu nhận protein IFN-γ 41 2.5.3 Quy trình tinh chế thu nhận protein IFN-γ 42 3.1 Tạo dòng vi khuẩn E coli biểu protein IFN-γ 43 3.1.1 Thu nhận gen IFN-γ 43 3.1.2 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen IFN-γ 44 3.1.3 Tạo dòng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ biểu protein IFN-γ 46 3.1.4 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E coli BL21(DE3) Star/ pNanogenIFN-γ môi trường LB 47 3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men biểu protein IFN-γ 48 3.2.1 Khảo sát thời điểm cảm ứng biểu IFN-γ 48 3.2.2 Khảo sát nồng độ IPTG 50 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ ni cấy q trình cảm ứng 51 3.2.4 Khảo sát thời gian nuôi cấy sau cảm ứng ảnh hưởng đến biểu protein IFN-γ 53 3.3 Nuôi cấy chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ biểu protein IFN-γ môi trường LB quy mô 500 ml điều kiện tối ưu 54 3.4 Tinh protein IFN-γ 55 3.4.1 Tách chiết protein IFN-γ 55 3.4.2 Tinh protein IFN-γ 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 DANH MỤC CÁC BẢNG PHỤ LỤC 74 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Các kí hiệu, chữ viết tắt Amp Ampr Ampicillin Ampicillin resistance APC Antigen presenting cell bp DNA Jak Kan Kanr base pair Deoxyribonucleic Acid deoxyribonucleotide Triphosphate double strand Ribonucleic Acid Escherichia coli Interferon Interferon-γ IFN Gamma Receptor-α chain IFN Gamma Receptor-β chain Interferon-α Interferon-β Interleukin 4, 10, 12 Isopropyl-β-DThiogalactoside Janus tyrosin kinase Kanamycin Kan resistance kb kilobase kDa kiloDaltone LB Luria-Bertani medium LBKan Luria-Bertani Kanamycin MAF Macrophage Activated Factor dNTP dsRNA E coli IFN IFN-γ IFNGR1 IFNGR2 IFN-α IFN-β IL- 4, 10, 12 IPTG Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tương đương tiếng Việt Kháng sinh ampicillin Kháng ampicillin Tế bào trình diện kháng nguyên Cặp base RNA sợi đôi Chủng vi khuẩn E coli Thụ thể chuỗi alfa IFN-γ Thụ thể chuỗi beta IFN-γ Chất cảm ứng Kháng sinh kanamycin Kháng kanamycin Đơn vị đo base DNA Đơn vị đo trọng lượng phân tử protein Môi trường LB Môi trường LB bổ sung kanamycin Nhân tố hoạt hóa đại thực bào MCS Multicloning site PT7 RNA Rnase rpm Major Histocompatibility Complex Messenger Ribonucleic Acid Natural Killer cell Natural Killer T cell Polymerase Chain Reacton Protein kinase dsRNARegulated Promoter T7 Ribonucleic Acid Ribonuclease round pump minute SDS Sodium Dodecyl Sulfate MHC (I, II) mRNA NK NKT PCR PKR SDS-PAGE TEMED TNF-α Vị trí gắn chèn gen vector Phức hợp mô (I, II) RNA thông tin Tế bào giết tự nhiên Tế bào T giết tự nhiên Phản ứng khuếch đại DNA Protein điều hòa Enzyme phân hủy RNA Tốc độ lắc (vòng/phút) - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Phương pháp điện di Gel Electrophoresis N, N, N, NTetramethylEthylenediamine Tumor Necrosis factor alpha Nhân tố gây hoại tử khối u v/p vòng/phút DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Trình tự protein IFN-γ cơng bố dược điển châu Âu trình tự gen IFN-γ tổng hợp 26 Bảng 2.2: Các mồi dùng giải trình tự gen 27 Bảng 2.3: Thành phần môi trường LB 28 Bảng 3.1: Kết đo OD600 môi trường LB, kết lặp lại lần 47 Bảng 3.2: Hàm lượng protein IFN-γ thời điểm cảm ứng, kết lặp lại lần 49 Bảng 3.3: Hàm lượng protein IFN-γ nồng độ IPTG, kết lặp lại lần 51 Bảng 3.4: Hàm lượng protein IFN-γ nhiệt độ, kết lặp lại lần 52 Bảng 3.5: Hàm lượng protein IFN-γ theo thời gian cảm ứng, kết lặp lại lần 54 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Sự hình thành IFN Hình 1.2: Mơ hình cấu trúc IFN-α người Hình 1.3: Mơ hình cấu trúc IFN-β người Hình 1.4: Mơ hình cấu trúc IFN-γ người Hình 1.5: Mơ hình cấu trúc monomer IFN-γ người Hình 1.6: Mơ hình cấu trúc dimer IFN-γ người Hình 1.7: Sự hình thành IFN-γ tế bào T/NK Hình 1.8: Cấu tạo thụ thể protein IFN-γ 10 Hình 1.9: Sự truyền tín hiệu protein IFN-γ 11 Hình 1.10: Tỉ lệ nhiễm viêm gan siêu vi B toàn giới 13 Hình 1.11: Những tác động protein IFN-γ 14 Hình 1.12: Cơ chế kháng virut protein IFN-γ 16 Hình 1.13: Cơ chế điều hòa âm hệ thống operon lac 22 Hình 1.14: Cơ chế kiểm soát âm dương operon lac 24 Hình 2.1: Vector pNanogenIFN-γ 25 Hình 2.2: Các thang chuẩn dùng kỹ thuật điện di 27 Hình 2.3: Điều kiện phản ứng PCR 33 Hình 3.1: Kết thu nhận đoạn gen IFN-γ 43 Hình 3.2: Vector pNanogenIFN-γ 44 Hình 3.3: Kết PCR khuẩn lạc để sàng lọc dòng tái tổ hợp 45 Hình 3.4: Kết kiểm tra vector pNanogenIFN-γ phản ứng cắt với enzyme NdeI/HindIII 46 Hình 3.5: Đường cong tăng trưởng chủng E coli BL21(DE3) Star mang vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ 48 Hình 3.6: Khảo sát thời điểm cảm ứng IPTG 49 Hình 3.7: Khảo sát cảm ứng nồng độ IPTG 50 Hình 3.8: Kết khảo sát theo nhiệt độ cảm ứng 52 Hình 3.9: Khảo sát biểu IFN-γ theo thời gian 53 Hình 3.10: Kết lên men 500 ml chai Schott 54 Hình 3.11: SDS-PAGE cơng đoạn tách chiết protein IFN-γ 55 Hình 3.12: Phổ đồ phương pháp lọc gel lần 56 Hình 3.13: SDS-PAGE phương pháp lọc gel lần 57 Hình 3.14: Phổ đồ giai đoạn cation 58 Hình 3.15: Kết SDS-PAGE cơng đoạn cation 58 Hình 3.16: Phổ đồ công đoạn lọc gel lần 59 Hình 3.17: Kết SDS-PAGE cơng đoạn lọc gel lần 60 Hình 3.18: SDS-PAGE (A) western blot (B) giai đoạn tinh chế 60 Hình 3.19:Phổ đồ kiểm tra độ mẫu tinh chế IFN-γ HPLC 61 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung IFN 1.1.1 Lịch sử phát Đầu năm 1920, người ta nhận thấy tế bào bị nhiễm virut tế bào tế bào lân cận khơng bị nhiễm tiếp virut virut khác Năm 1937, Findlay Mac Callum nhận thấy nhiễm virut Rift vào khỉ, sau nhiễm tiếp liều gây chết virut sốt vàng khỉ khơng bị bệnh sốt vàng Hai ơng gọi tượng can thiệp (interference) virut [1] Năm 1957, Alick Isaac Jean Lindenman Viện nghiên cứu Y học Quốc gia Luân Đôn tiến hành thí nghiệm quan trọng mang tính lịch sử Họ nhận thấy nhiễm virut cúm sống vào phơi gà phát triển mà trước nhiễm virut cúm bất hoạt nhiệt virut nhân lên Nếu nghiền phôi thành dịch tiêm truyền vào phơi gà khác ngăn cản nhân lên virut phôi gà Hai ơng cho tượng có liên quan đến tạo thành chất đặc biệt tế bào nhiễm virut đặt tên cho interferon viết tắt IFN [1], [39] Vào năm 1965, năm sau phát IFN, Wheelock trình bày xuất chất có khả kháng lại vi sinh vật giống IFN dịch môi trường nuôi tế bào bạch cầu người sau chúng ủ với lectin phytohemagglutinin thực vật (PHA) [76] Hình 3.15: Kết SDS-PAGE công đoạn cation (1) Thang protein; (2) Mẫu qua công đoạn cation; (3) IFN-γ chuẩn Kết điện di SDS-PAGE Hình 3.15 cho thấy giếng phần lớn tạp chất loại bỏ, lại monomer dimer protein IFN-γ với protein có trọng lượng phân tử cao Các tạp chất loại bỏ thông qua bước lọc gel Lọc gel lần Cột gel 50 x 78 mm (V = 1500 ml) nhồi với gel Superdex 75 để tách tạp chất lại khỏi mẫu Mẫu sau thu từ công đoạn chạy cation nạp vào cột với lượng mẫu 40 ml lần/cột 50 x 78 mm, tốc độ dòng ml/phút, nhiệt độ cột 200C Kết thu với peak tách rõ phổ đồ (Hình 3.16) Manual run 6:10_UV Manual run 6:10_ 200 400 600 800 1000 1200 mAU 1000 Peak Peak Peak Hình 3.16: Phổ đồ công đoạn lọc gel lần Thu nhận riêng peak tiến hành điện di SDS-PAGE để xác định peak chứa protein mục tiêu (Hình 3.17) 10 kDa Hình 3.17: Kết SDS-PAGE cơng đoạn lọc gel lần (1) Thang protein; (2) peak 1; (3) peak 2; (4) peak 3; (5) IFN-γ chuẩn Qua kết chạy điện di SDS-PAGE nhận thấy giếng (peak 1) tương ứng với tạp chất có trọng lượng phân tử cao nhất, giếng (peak 2) dimer protein IFN-γ, giếng (peak 3) tương ứng với kích thước phân tử protein IFN-γ chuẩn Chúng thu nhận peak (giếng 4), tiến hành chạy kiểm tra lại lai western blot với kháng thể kháng protein IFN-γ chạy HPLC Hình 3.18: SDS-PAGE (A) western blot (B) giai đoạn tinh chế (1) Thang protein (Fermentas) (2) phươp pháp lọc gel lần 1; (3) giai đoạn trao đổi cation; (4) giai đoạn lọc gel lần 2; (5) IFN-γ chuẩn Lượng tạp chất giảm dần qua giai đoạn tinh chế (Hình 3.18A, giếng 24), protein IFN-γ tinh hoàn toàn qua bước lọc gel lần (Hình 3.18A, giếng 4) Trong đó, protein thu qua bước tinh chế cho phản ứng lai đặc hiệu với kháng thể kháng protein IFN-γ (Hình 3.18B), protein thu giai đoạn khẳng định protein IFN-γ mục tiêu Protein thu sau lọc gel kiểm tra độ tinh phương pháp HPLC K ết đư ợc thể tr ên Hình 19 A C B Hình 3.19: Phổ đồ kiểm tra độ mẫu tinh chế IFN-γ HPLC (A) Đệm; (B) IFN-γ chuẩn; (C) Mẫu IFN-γ Kết HPLC (Hình 3.19) cho thấy mẫu protein IFN-γ sau qua tinh chế (Hình 3.19C) xuất peak với thời gian lưu 38,673 phút so với protein IFN-γ chuẩn (Hình 3.19B), bên cạnh cịn xuất peak nhỏ với thời gian lưu 33,150 phút khác so với mẫu protein IFN-γ chuẩn so với dung dịch đệm (Hình 3.19A), thành phần tạp chất cịn lại sau trình tinh chế Tỉ lệ lượng tạp chất lại sau tinh chế 2,78% (Bảng phụ lục 13) Lượng tạp chất nằm khoảng cho phép 5% tạp chất sau tinh chế (theo tiêu chuẩn ngun liệu cơng ty Dược Nanogen) Sau q trình tinh chế thu lượng mẫu 200 ml với nồng độ 250 μg/ml (Đo phương pháp ELISA), hiệu xuất trình tinh chế = (Tổng protein IFN-γ tinh sạch)/(tổng protein IFN-γ ban đầu) = 50 (mg)/204,4 (mg) = 24,5% PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận- đề nghị Học 4.1 Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Kết luận Các kết thực nghiệm luận văn tóm tắt sau:  Đã tạo vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ mang đoạn gen mã hóa protein IFN-γ tạo thành cơng chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ có khả biểu protein IFN-γ dạng thể vùi  Đã biểu thành công protein IFN-γ chất cảm ứng IPTG chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ môi trường LBkan  Đã tối ưu hóa điều kiện ni cấy cảm ứng protein IFN-γ chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ: nuôi cấy lắc môi trường LBkan, 37oC, sau 30 phút nuôi cấy tiến hành cảm ứng với 0,5 mM IPTG tiếp tục nuôi trước ly tâm thu sinh khối  Đã áp dụng thành công điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ có khả biểu protein IFN-γ quy mô 500 ml  Đã thu nhận protein IFN-γ sau trình lên men với hiệu suất tinh chế đạt 24,5%  Đã thành công việc tinh protein IFN-γ với độ tinh 97% 4.2 Đề nghị Với mục tiêu ứng dụng protein IFN-γ điều trị xơ gan bệnh virut có xu hướng ngày gia tăng giới Việt Nam, đề tài cần tiếp tục thực nghiên cứu sau:  Hồn thiện quy trình lên men áp dụng vào quy mô bán công nghiệp cơng nghiệp  Hồn thiện quy trình tinh chế protein IFN-γ để thu nhận lượng protein IFN-γ đạt hiệu xuất cao  Gắn peg (polyethylene glycol) vào phân tử protein IFN-γ  Thử nhiệm hoạt tính sinh học protein IFN-γ  Tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng Trang 63 DANH MỤC BẢNG PHỤ LỤC Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Trang 84 Trang 84 Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Trang 85 Trang 85 Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Trang 86 Trang 86 Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Trang 87 Trang 87 Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Danh mục bảng phụ lục Học Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Trang 88 Trang 88 Danh mục bảng phụ lục Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Học Danh mục bảng phụ lục Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Học Bảng phụ lục 5: Kết phân tích ANOVA nồng độ protein IFN-γ thời điểm cảm ứng One-way ANOVA: Nồng độ protein versus Thời gian cảm ứng Source DF SS MS F P Thời gian cảm ứng 2612770529 522554106 2212.71 0.000 Error 30 7084802 236160 Total 35 2619855331 S = 486.0 R-Sq = 99.73% R-Sq(adj) = 99.68% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+ 5.5 34939 390 (* 6.0 30329 419 *) 6.5 25059 616 (* 7.0 21972 516 *) 7.5 14873 594 *) 8.0 10040 300 * ) + -+ -+ -+ 14000 21000 28000 35000 Pooled StDev = 486 H0: Nồng độ protein cảm ứng thời gian H1: Nồng độ protein khác cảm ứng thời gian khác Qua phân tích thấy giá trị P=0.00 (