Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang - 50SH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài : NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GÂY MIỄN DỊCH NGỰA ĐỂ SẢN XUẤT HUYẾT THANH THÔ KHÁNG NỌC RẮN HỔ ĐẤT. Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ NHÃ UYÊN. Sinh viên thực hiện : PHAN THANH QUANG. Lớp : 50CNSH Khoá : 50 Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang - 50SH i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn, động viên quý báu của nhiều đơn vị và cá nhân. Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn: - Ban lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi trường - Đại Học Nha Trang đã giới thiệu em đến thực tập tại Viện Vắc Xin và Sinh Phẩm Y Tế. - Em xin chân thành cảm ơn cô Lê Nhã Uyên đã rất tận tình hướng dẫn,giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành bài luận văn tốt nghiệp của mình. - Em cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện Vắc Xin và Sinh Phẩm Y Tế nói chung và Cơ sở Suối Dầu nói riêng đã sắp xếp và tạo điều kiện cho em được thực tập tại Cơ Sở Suối Dầu của Viện Vắc Xin và Sinh Phẩm Y Tế. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn K.s Lê Bá Bút cùng toàn thể cô, chú, anh,chị trong Tổ Chăn Nuôi I Suối Dầu, những người đã hết lòng giúp đỡ và hướng dẫn tận tình trong thời gian em thực tập tại Viện. Dù đã có nhiều cố gắng trong quá trình thực hiện, song chắc chắn rằng luận văn này sẽ không thể tránh khỏi một vài thiếu sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô. Cuối cùng em xin gửi tới tất cả các thầy cô, các cô chú, anh chị những lời chúc tốt đẹp nhất trong cuộc sống và trong công tác ! Nha Trang , ngày….tháng….năm Sinh viên Phan Thanh Quang Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI MỞ ĐẦU 1 Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. Những đặc điểm cơ bản về hình thái của rắn hổ đất . 1 1.1.1. Da rắn 1 1.1.2. Cấu tạo hàm rắn 2 1.1.3. Cấu tạo răng độc và nọc độc. 2 1.1.4. Các cơ quan cảm giác 3 1.2. Một số đặc điểm dịch tễ học ở Việt Nam. 4 1.2.1 Rắn độc ở Việt Nam. 4 1.2.2. Triệu chứng khi bị rắn cắn. 6 1.3. Bản chất sinh hóa và các tác động của nọc rắn lên cơ thể con người 7 1.3.1. Thành phần hóa học của nọc rắn 7 1.3.2. Tính độc của nọc rắn 7 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới tính độc của nọc rắn 8 1.3.4. Tính độc của nọc rắn thay đổi theo mùa và vùng địa lí 10 1.3.5. Các tác động của nọc rắn lên cơ thể con người 10 1.4. Hệ thống miễn dịch của cơ thể 11 1.4.1. Khái niệm 11 1.4.2. Phân loại miễn dịch. 11 1.4.3. Huyết thanh. 12 1.4.4. Kháng thể. 15 Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH iii 1.4.5. Huyết thanh phòng và chữa bệnh. 16 1.4.6. Súc vật để gây miễn dịch. 17 1.5. Tá chất gây miễn dịch 17 1.5.1. Định nghĩa tá chất 17 1.5.2 Cơ chế hoạt động của tá chất. 17 1.5.3 Vai trò của tá chất 18 1.5.4. Tính an toàn của tá chất. 18 1.5.5. Tá chất Montanide ISA 50 V2 19 1.6.1. Lịch sử 22 1.6.2. Hiện trạng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và điều trị nạn nhân bị rắn cắn ở Việt Nam 23 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Vật liệu 25 2.1.1. Động vật thí nghiệm và các vật liệu khác 25 2.1.2. Máy móc, thiết bị và dụng cụ 26 2.1.3. Hóa chất. 27 2.2. Phương pháp 27 2.2.1. Sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất thô theo phương pháp cũ 27 2.2.2 Sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất thô đã cải tiến 30 2.2.3 Phương pháp xác định hiệu giá huyết thanh 33 2.2.4. Phương pháp lấy huyết tương. 37 2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu. 38 Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39 Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH iv 3.1. Kết quả hiệu giá huyết thanh của 2 lô ngựa miễn dịch. 39 3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ cao độ 41 3.3. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ nhắc lại 2, 3, 4 43 3.4. So sánh hiệu giá hai lô ngựa qua các chu kỳ khai thác 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 Kết luận 49 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH v DANH MỤC BẢNG Bảng1.1: Danh sách các loài rắn độc ở Việt Nam . 5 Bảng 1.2: Tính chất của các chất dùng để lọc và hấp phụ nọc rắn 9 Bảng 1.3: Tính chất vật lý của MONTANIDE ISA 50V2 19 Bảng 1.4: Tính chất hoá học của MONTANIDE ISA 50V2 20 Bảng 1.5: Tính chất tạo nhũ dịch của Montanide ISA 50 V2 20 Bảng 2.1: Phác đồ gây miễn dịch dự phòng bệnh uốn ván 26 Bảng 2.2: Phác đồ gây miễn dịch cao độ cho lô A 29 Bảng 2.3: Phác đồ gây miễn dịch nhắc lại cho lô A. 30 Bảng 2.5: Phác đồ gây miễn dịch nhắc lại cho lô B 33 Bảng 2.6: Pha loãng nọc rắn dùng trung hòa huyết thanh 34 Bảng 3.1: Kết quả hiệu giá huyết thanh của lô A (hồi cứu) 40 Bảng 3.2: Kết quả hiệu giá huyết thanh của lô B ( thí nghiệm ) 40 Bảng 3.3: Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ cao độ 41 Bảng 3.4: Kết quả phân tích phương sai hàm lượng kháng thể ở giai đoạn miễn dịch cao độ (chép nguyên gốc từ phần mềm thống kê Excell ) 42 Bảng 3.5: Kết quả đáp ứng miễn dịch nhắc lại chu kì 2, 3, 4 43 Bảng 3.6: Kết quả phân tích phương sai hàm lượng kháng thể ở giai đoạn miễn dịch nhắc lại 2, 3, 4 (chép nguyên gốc từ phần mềm thống kê Excell ) 45 Bảng 3.7: Hiệu giá trung bình của 4 chu kì miễn dịch của 2 lô 46 Bảng 3.8: Hiệu giá trung bình của 4 chu kì miễn dịch của 2 lô ngựa A và B 48 Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH vi DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1: Rắn hổ đất (Naja kaouthia) 1 Hình 1.2: Cấu tạo xương hàm của rắn 2 Hình 1.3: Móc độc và nọc độc của rắn 2 Hình 1.4: Cấu trúc kháng thể 15 Hình 1.5: Thành phần và các dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA 50 V2 19 Bảng 2.4: Phác đồ gây miễn dịch cao độ cho lô B 32 Hình 3.1: Biểu đồ biểu diễn kết quả đáp ứng miễn dịch ở giai đoạn cao độ của 2 lô A và B 42 Hình 3.2: Biểu đồ biểu diễn kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ nhắc lại 2, 3, 4 của 2 lô A và B 45 Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện hiệu giá trung bình của 4 chu kì miễn dịch của 2 lô ngựa 47 Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT APC Antigen presenting cells (Tế bào trình diện kháng nguyên) Ck Chu kì IgG Immunoglobulin G (Globulin miễn dịch loại G) IgA Immunoglobulin A (Globulin miễn dịch loại A) IgD Immunoglobulin D (Globulin miễn dịch loại D) IgE Immunoglobulin E (Globulin miễn dịch loại E) IgG Immunoglobulin G (Globulin miễn dịch loại G) IgM Immunoglobulin M (Globulin miễn dịch loại M) IVAC Viện Vacxin và sinh phẩm y tế KN - KT Kháng nguyên – Kháng thể KN - MHC Kháng nguyên – Phức hợp chủ yếu hòa hợp mô KT Khai thác LD 50 Liều gây chết 50% Lf Limit of floculation (Đơn vị lên bông) M Mũi tiêm MD Miễn dịch MDCĐ Miễn dịch cao độ MHC Major histocompatibility complex (Phức hợp chủ yếu hòa hợp mô) ml mili lit NL Nhắc lại O/W Oil in water (Nhũ dịch dầu trong nước) PD50 Liều bảo vệ 50% PBS Photphate buffered saline (Đệm muối photphate) SAD Serum Anti Diphtheria (Huyết thanh kháng bạch hầu) SAR Serum Anti Rabique (Huyết thanh kháng dại) SAT Serum Anti Tetanus (Huyết thanh kháng uốn ván) TB Tế bào WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) W/O Water in oil (Nhũ dịch nước trong dầu) W/O/W Water in oil in water (Nhũ dịch nước trong dầu trong nước) Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang- 50SH LỜI MỞ ĐẦU Từ bao đời nay, rắn độc và nạn nhân của rắn độc luôn là mối quan tâm của nhiều người trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Hằng năm, trên thế giới có hàng ngàn người chết vì bị rắn cắn. Thống kê sơ bộ cho thấy, mỗi năm Việt Nam có khoảng 300.000 bệnh nhân bị rắn cắn nhập viện. Trong số những người được cứu sống, có đến 13-14% phải cắt chi hoặc một phần chi. Trước đây, ở Việt Nam người ta thường dùng các biện pháp điều trị Đông Y không đặc hiệu kết quả lành bệnh rất hạn chế, tỉ lệ tử vong cao. Phương pháp sử dụng huyết thanh để điều trị nạn nhân bị rắn độc cắn đã có từ cuối thế kỷ XIX. Đây được xem là phương pháp điều trị có hiệu quả và phổ biến nhất, tính đặc hiệu trong kháng nọc của nó giúp giảm tỷ lệ tử vong khoảng 7 - 10 lần, và trở thành thường qui của các nước tiên tiến dùng trong công tác điều trị, và cấp cứu nạn nhân do rắn độc cắn. Ở Việt Nam, sau 8 năm nghiên cứu, vào đầu tháng 4/2004 Viện Vắc-Xin Nha Trang được sự cho phép của Bộ Y Tế đã sản xuất đại trà hai loại huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và rắn lục tre. Tuy nhiên, huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất sản xuất được vẫn chưa tối ưu về chất lượng. Vì vậy, Viện Vắc Xin hiện nay đã và đang nghiên cứu áp dụng quy trình miễn dịch mới để cải tiến phương pháp sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất nâng cao chất lượng và số lượng đồng thời giảm giá thành. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài : Nghiên cứu cải tiến quy trình gây miễn dịch ngựa để sản xuất huyết thanh thô kháng nọc rắn hổ đất. Mục tiêu nghiên cứu:  Hoàn thiện, cải tiến quy trình miễn dịch ngựa sản xuất huyết thanh thô kháng nọc rắn hổ đất để sản xuất huyết thanh tinh chế có chất lượng và hiệu quả tốt nhất.  Đề xuất phác đồ tiêm miễn dịch cho ngựa sản xuất huyết thanh thô có đáp ứng miễn dịch cao. Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang SVTH: Phan Thanh Quang Trang 1 Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm quanh năm. Có hơn 3.200 km bờ biển và 2/3 diện tích đất đai là rừng núi, sình lầy. Do đó, động vật nói chung và rắn nói riêng rất dễ phát triển. Rắn có thể sống ở khắp nơi từ vùng cao, vùng đồng bằng đến các hải đảo xa xôi, rắn sống trên cây, trên mặt đất, trong hang hốc…rắn sống ở sông suối, ao, hồ và cả biển nữa. Một trong những loài rắn độc nguy hiểm thường cắn người ở nước ta là loài rắn hổ đất (Naja kaouthia). Vì vậy, cần phải có biện pháp phòng ngừa và chữa trị hiệu quả. 1.1. Những đặc điểm cơ bản về hình thái của rắn hổ đất [4]. Hình 1.1: Rắn hổ đất (Naja kaouthia). Rắn hổ đất có tên khoa học là Naja kaouthia. Rắn hổ đất là rắn độc cạn, thân màu đen, nâu đen, nâu vàng, gáy chúng có vòng tròn sáng màu và có tâm đen. 1.1 .1. Da rắn. Rắn có “bộ áo” được kết bằng vẩy, xếp kề bên nhau hoặc tỳ lên nhau như ngói lợp. Những lớp vẩy này do lớp da bên ngoài ngấm chất sừng dày lên mà thành. [...]... tiếp tục nghiên cứu và sau đó công bố kết quả nghiên cứu nọc rắn của mình Ngày 27/01/1896, Calmette lại công bố một lần nữa là có thể sử dụng huyết thanh ngựa đã gây miễn dịch bằng giải độc tố nọc rắn để điều trị nạn nhân bị rắn cắn Sau khám phá này thì phương pháp sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn được thông báo trên khắp thế giới và nhiều quốc gia đã tự sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn để điều... trước đây Từ thành công của việc nghiên cứu, sản xuất hai loại huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và rắn lục tre, hiện nay Viện Vắc Xin Nha Trang đang nghiên cứu để chuẩn bị sản xuất thêm huyết thanh kháng nọc của một số loài rắn khác, trong đó có loài rắn cạp nong (có nơi gọi là rắn mái gầm) Trước đây, khi chưa sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu, nạn nhân bị rắn cắn thường được điều trị triệu... sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn 3 Huyết thanh kháng nọc rắn an toàn và có hiệu lực phù hợp với tình hình ở Việt Nam được sản xuất ở qui mô công nghiệp, quốc gia 4 Nghiên cứu khoa học trên qui mô thực nghiệm phòng thí nghiệm, trên thực địa với nạn nhân bị rắn cắn sẽ được thực hiện để kiểm tra hiệu lực và an toàn của huyết thanh kháng nọc rắn, tiến tới xác định phương thức sử dụng huyết thanh kháng nọc. .. bệnh dại (SAR), huyết thanh kháng virut viêm gan B… - Huyết thanh kháng nọc độc: huyết thanh của động vật đã được tiêm nọc độc đã làm giảm độc của những loài có nọc độc, chẳng hạn như nọc rắn (SAV) - Huyết thanh của người mới lành bệnh: hiện nay ít dùng SVTH: Phan Thanh Quang Trang 16 Đồ án tốt nghiệp Đại Học Nha Trang 1.4.6 Súc vật để gây miễn dịch Việc sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn tuỳ thuộc rất... dụng huyết thanh kháng nọc rắn 5 Tổ chức hoạt động truyền thông, giảng dạy, đào tạo các nhân viên bảo vệ sức khỏe về xử lí nạn nhân bị rắn cắn và điều trị huyết thanh kháng nọc rắn bao gồm cả cung cấp huyết thanh kháng nọc 6 Điều tra chương trình quốc gia về điều trị nạn nhân rắn cắn tại Việt Nam 1.6.2 Hiện trạng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và điều trị nạn nhân bị rắn cắn ở Việt Nam Hiện... hủy của enzym và quá trình đào thải của cơ thể - Làm biến đổi điện thế bề mặt kháng nguyên, thu hút các tế bào trình diện kháng nguyên - Tạo thuận lợi cho quá trình tóm bắt kháng nguyên và trình diện kháng nguyên cho tế bào có thẩm quy n miễn dịch, sinh kháng thể và hoạt hóa các cytokin 1.6 Sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất 1.6.1 Lịch sử Dựa vào những công trình nghiên cứu của Sewall ở Mỹ và... Nhân tạo Chủ động Tự nhiên Nhân tạo Huyết thanh kháng nọc rắn độc được sản xuất dựa trên cơ chế của miễn dịch thụ động nhân tạo 1.4.3 Huyết thanh Sử dụng huyết thanh là phương pháp tạo miễn dịch thụ động rất có hiệu quả Có thể điều chế huyết thanh kháng nọc rắn độc từ máu ngựa được gây miễn dịch với kháng nguyên Ngoài ra, miễn dịch thụ động còn được tạo ra bởi γ-globulin lấy từ máu nhau thai γ-Globulin... (µ) 1.4.5 Huyết thanh phòng và chữa bệnh Huyết thanh chữa bệnh là huyết thanh của động vật đã được gây miễn dịch bằng những phương pháp khác nhau hay là huyết thanh của người mới lành bệnh Các huyết thanh này chứa rất nhiều kháng thể và gây được miễn dịch thụ động cho người dùng sau vài giờ nhưng thời gian được miễn dịch rất ngắn Huyết thanh động vật: được chế từ máu động vật (thường là ngựa hoặc bò,... được miễn dịch với những bệnh nhiễm trùng khác nhau) đem loại bỏ các protein không đặc hiệu, còn kháng thể giữ ở nồng độ cao Tuỳ theo tác nhân gây miễn dịch, người ta phân biệt: - Huyết thanh kháng độc tố: huyết thanh động vật đã được tiêm độc tố vi khuẩn như huyết thanh chống bạch hầu (SAD), chống uốn ván (SAT) - Huyết thanh kháng virus: huyết thanh động vật đã được miễn dịch đối với virus dại dùng để. .. để gây miễn dịch Trên nguyên tắc người ta có thể dùng bất cứ loại súc vật nào cũng được, nhưng trong thực tế sản xuất người ta phải lựa chọn súc vật để gây miễn dịch và súc vật phải được chăm sóc, phòng ngừa và điều trị thật chu đáo và cẩn thận Tổ chức Y tế thế giới đã khuyến cáo nên sản xuất huyết thanh kháng nọc trên nhiều loại súc vật khác nhau để tránh phản ứng hay bệnh huyết thanh do sử dụng huyết . Nghiên cứu cải tiến quy trình gây miễn dịch ngựa để sản xuất huyết thanh thô kháng nọc rắn hổ đất. Mục tiêu nghiên cứu:  Hoàn thiện, cải tiến quy trình miễn dịch ngựa sản xuất huyết thanh thô kháng. 2.2.1. Sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất thô theo phương pháp cũ 27 2.2.2 Sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất thô đã cải tiến 30 2.2.3 Phương pháp xác định hiệu giá huyết thanh. thô kháng nọc rắn hổ đất để sản xuất huyết thanh tinh chế có chất lượng và hiệu quả tốt nhất.  Đề xuất phác đồ tiêm miễn dịch cho ngựa sản xuất huyết thanh thô có đáp ứng miễn dịch cao. Đồ