i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Duy và TS. Phạm Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ tôi từng bước tiếp cận và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và môi trường. Thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được nền tảng kiến thức bước tiếp những chặng đường tiếp theo. Con xin gửi lòng biết ơn đến ba mẹ và anh chị đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và dành cho con tất cả tình yêu thương, con sẽ luôn cố gắng sống và phấn đấu với niềm tin yêu này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn lớp 48 CNSH, đã đồng hành và chia sẽ buồn vui với tôi trong những năm tháng sinh viên, trong suốt khóa học cũng như quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Minh Nhật và nhóm G8-50SH đã quan tâm và nhiệt tình giúp đỡ để bài luận văn được hoàn thành. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình cảm quý báu này! Nha Trang, tháng 07 năm 2010 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Cẩm Ly ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi LỜI NÓI ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm hải sản 2 1.1.1. Trên thế giới 2 1.1.2. Ở Việt Nam 6 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 7 1.2.1. Phân loại chi Vibrio 7 1.2.2. Đặc điểm của V. parahaemolyticus 9 1.2.3. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của V. parahaemolyticus 12 1.2.4. Khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus 13 1.2.5. Gen độc tố của V. parahaemolyticus 14 1.3. Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài 18 1.3.1. Mục tiêu 18 1.3.2. Tính cấp thiết 18 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Vật liệu 19 2.1.1. Mẫu 19 2.1.2. Thiết bị chuyên dụng 19 2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 20 2.2. Nội dung nghiên cứu 24 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 25 iii 2.3.1. Phân lập vi khuẩn V. parahaemolyticus 25 2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio 26 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng 27 2.3.4. Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio 28 2.3.5. Bảo quản chủng vi khuẩn. 30 2.3.6. Tách chiết DNA hệ gen từ tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus 30 2.3.7. Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 31 2.3.8. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di 33 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1. Phân lập vi khuẩn vi khuẩn Vibrio từ thực phẩm hải sản 35 3.2. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio 39 3.3. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Vibrio 41 3.4. Một số đặc tính sinh hóa của V. parahaemolyticus 42 3.5. Xác định gen độc tố của các chủng Vibrio bằng kỹ thuật PCR 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 iv DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT Base pair bp Deoxynucleotide triphosphate dNTP Deoxyribonucleotide Acid DNA Polymerase Chain Reaction PCR Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TCBS Food and Drug Adimistration FDA Thermostable direct hemolysin tdh (TDH) Tdh-related hemolysin trh (TRH) V. parahaemolyticus toxRS Vp-toxRS Random Amplification of Polymorphic DNA RAPD Loop mediated isothermal amplification LAMP Reverse Transcription PCR RT- PCR Ethylenediaminetetraacetic Acid EDTA Optical Density OD Type III Secretion System T3SS v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm V. parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm 4 Bảng 1.2. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi V. parahaemolyticus do tiêu thụ thực phẩm hải sản 1993 -2000 Hồng Kông 5 Bảng 1.3. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus 5 Bảng 1.4. Các đặc tính khác nhau của các loài thường gây bệnh trên người liên quan đến việc tiêu thụ hải sản 8 Bảng 1.5. Các kháng nguyên của V. parahaemolyticus (1986) 11 Bảng 2.1. Các mẫu hải sản thu mua từ một số chợ ở thành phố Nha Trang dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio 19 Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR: 32 Bảng 2.3. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR 32 Bảng 3.1. Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng Vibrio được phân lập từ các mẫu hải sản ở chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ biển (Bãi Dương) 36 Bảng 3.2. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio 43 Bảng 3.3. Khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn Vibrio 44 Bảng 3.4. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 45 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus được quan sát dưới kính hiển vi 9 Hình 1.2. Hai nhiễm sắc thể dạng vòng của V. parahaemolyticus 17 Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 24 Hình 2.2. Sơ đồ chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR 33 Hình 3.1. Các khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio sau một ngày (24 giờ) nuôi trên môi trường thạch TCBS ở điều kiện pH 8,5, nhiệt độ 37 0 C 35 Hình 3.2. Các khuẩn lạc chủng C2 màu xanh (A) và khuẩn lạc chủng C13 màu vàng sữa (B) 35 Hình 3.3. Tế bào chủng vi khuẩn C2 được soi tươi 39 Hình 3.4. Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio C7 sau khi nhuộm Gram 40 Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của các chủng Vibrio (C1, C2, C7, C15, C23) nuôi trên môi trường APW, ở pH 8,5 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở 150 vòng/phút 41 Hình 3.6. Thí nghiệm lên men đường của chủng vi khuẩn C15 (A) và C2 (B) 44 Hình 3.7. Thí nghiệm sử dụng lysin của các chủng Vibrio 45 Hình 3.8. DNA tổng số của các chủng vi khuẩn được điện di và soi dưới tia UV 46 Hình 3.9. Sản phẩm khuếch đại gen toxR được điện di và soi dưới tia UV 47 1 LỜI NÓI ĐẦU Trong những năm trở lại đây, nhiều địa phương trên cả nước thường xuyên phải đối mặt với tình trạng ngộ độc thực phẩm, có nơi ngộ độc thực phẩm đã xảy ra hàng loạt. Có nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm trong đó tiêu thụ hải sản là một trong những nguyên nhân chính yếu. Các món ăn hải sản ngày càng phong phú và là thực phẩm bổ dưỡng hàng đầu, đi kèm đó cũng chứa đựng nhiều nguy cơ tiềm ẩn gây hại cho sức khỏe của con người. Khi ăn các món ăn sống như ăn gỏi, ăn tái người ăn rất dễ bị nhiễm các bệnh về hệ tiêu hóa. Dù mang lại nguồn dinh dưỡng cao nhưng phải sử dụng nguồn hải sản tươi, đun nấu chín, hợp vệ sinh, tuyệt đối không được ăn tái nếu không sẽ bị nhiễm khuẩn, nhiễm độc, làm lây truyền dịch bệnh tiêu chảy cấp và các bệnh truyền nhiễm đường tiêu hoá. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn thường sống kí sinh trên các đối tượng hải sản như tôm, mực, cua, cá,… chúng được coi là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thức ăn nên cần nghiên cứu khả năng gây bệnh của chúng. Đề tài “Phân lập và xác định gen độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong hải sản tƣơi sống tại các chợ ở thành phố Nha Trang” được tiến hành với mục tiêu: Phân lập và định danh loài V. parahaemolyticus ở các chợ thành phố Nha Trang có mặt trong một số hải sản tươi sống (tôm, mực, cá, cua…). Xác định gen độc tố của vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, tạo cơ sở khoa học cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh sớm. 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm hải sản 1.1.1. Trên thế giới Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, có thể gây ra nguy hiểm, thậm chí tử vong. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm bao gồm buồn nôn, co thắt dạ dày, tiêu chảy, nôn, sốt và đau đầu. Triệu chứng có thể xảy ra trong vòng 30 phút sau khi ăn trong một vài giờ, hoặc vài ngày sau đó và ở mức độ nặng, nhẹ khác nhau. Vi khuẩn V. parahaemolyticus là nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước châu Á, bao gồm Trung Quốc (31,1% vụ dịch ngộ độc thực phẩm được báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20-30% các trường hợp từ 1981 đến 1993) và Đài Loan (69% trường hợp được báo cáo giữa năm 1981 và 2003). Ngoài ra, dịch còn xảy ra ở các nước châu Âu như Tây Ban Nha (1989, 1999, 2004), Pháp (1997) và cả Châu Mỹ, điển hình là Hoa Kỳ (Norinaga và cộng sự, 2005). Nhật Bản: Trước năm 1994, tỷ lệ mắc bệnh do V. parahaemolyticus được công bố còn ít. Thời kì 1994-1995 đã có 1.280 vụ về nhiễm bệnh do V. parahaemolyticus được báo cáo, còn nhiều hơn các vụ ngộ độc thực phẩm do Salmonella. Phần lớn các trường hợp ngộ độc xảy ra trong mùa hè, số lượng ca ngộ độc lớn nhất xuất hiện trong tháng tám. Từ 1996-1998, đã có 496 ổ dịch, với 24.373 trường hợp do V. parahaemolyticus gây ra. Số lượng các trường hợp ngộ độc thực phẩm V. parahaemolyticus tăng gấp đôi vào năm 1998 so với năm 1997. Ấn Độ: Thời kì 1994-1996, xác định được 146 bệnh nhân bị ngộ độc do vi khuẩn V. parahaemolyticus (Okuda và cộng sự, 1997). Tỷ lệ này tăng đột ngột vào tháng hai năm 1996 và vẫn còn cao cho đến tháng tám. Tỷ lệ của bệnh do V. parahaemolyticus tăng lên liên quan đến tăng sự lưu hành của chủng O3: K6. Tỷ lệ mắc tiêu chảy do chủng O3: K6 chiếm 63% các chủng phân lập từ bệnh nhân ở Calcutta giữa tháng 9 năm 1996 và tháng 4 năm 1997. 3 Mexico: Tổng số 266 mẫu nước biển, nhuyễn thể và cá thu thập từ 12 điểm khác nhau trong đầm phá Pueblo Viejo, Mexico vào các tháng khác nhau trong năm cho thấy: V. parahaemolyticus được tìm thấy ở 11 trong 12 điểm trên. Các chủng đã được kiểm tra kiểu huyết thanh cho mục đích dịch tễ học và O3 là nhóm huyết thanh thường gặp nhất. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nhân tố tác động đến phân bố V. parahaemolyticus trong môi trường bao gồm nhiệt độ nước, muối, nồng độ oxy, sự tương tác với thực vật nổi, sự có mặt của các trầm tích, chất hữu cơ trong huyền phù, cá và hải sản cũng như sự lên xuống của thủy triều ở cửa sông (Maria và cộng sự, 2004). Chile: Tóm tắt dịch bệnh tiêu chảy liên quan đến tiêu thụ hải sản và V. parahaemolyticus xảy ra trong mùa hè năm 2004 và 2005 ở các vùng quanh của Puerto Montt, Chile. V. parahaemolyticus thu được từ động vật có vỏ và mẫu lâm sàng trong thời gian dịch bệnh chủ yếu thuộc nhóm O3: K6 (Loreto và cộng sự, 2005). Đài Loan : Từ năm 1983 đến 1993, có 786 chủng Vibrio parahaemolyticus đã được thu thập từ các dịch bệnh truyền qua thực phẩm và một số các trường hợp tiêu chảy ở miền bắc Đài Loan, gồm 42 kiểu huyết thanh. Năm kiểu huyết thanh thường gặp là K8 (36,8%), K15 (10,8%), K12 (8,7%), K56 (7,9%) và K63 (4,7%). Đa số chủng gây ra bệnh có kiểu huyết thanh là O3:K6 (Wong và cộng sự, 2000). Gần đây, bệnh tiêu chảy do V. parahaemolyticus đã được báo cáo từ Việt Nam, Úc, Hoa Kỳ, Trung Mỹ và Anh. Tại châu Phi, V. parahaemolyticus lần đầu tiên được xác định trong các dịch bệnh tại Togo. Do triệu chứng phát bệnh tương tự với tả nên người ta đẩy mạnh về công tác y tế công cộng (Bockemuhl và Triemer, 1974). V. parahaemolyticus là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm như viêm dạ dày ruột ở người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc vết thương tiếp xúc với động vật biển hoặc vùng nước ấm ven biển đặc biệt là ở Đông Nam Á (Wong và cộng sự, 2000). Khi nhiệt độ tăng lên trong một khoảng thời gian ngắn là đủ cho vi 4 khuẩn V. parahaemolyticus phát triển cho đến khi đạt đến mức độ nhiễm độc (10 6 vi khuẩn) (Daniels và cộng sự, 2000). Trong những năm gần đây, Sở Y tế Hồng Kông nghiên cứu cho biết Vibrio parahaemolyticus đã liên tục gây ngộ độc và được xếp vào nguyên nhân hàng đầu do ăn thực phẩm hải sản. Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm V. parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm (từ 1999 đến 2003) Nhóm thực phẩm Số ca xác nhận Số ngƣời mắc phải Hải sản 313 (56,7%) 1465 (53,8%) Món ăn hỗn hợp 68 (12,3%) 449 (16,5%) Thịt, sản phẩm từ thịt và cá tạp 54 (9,8%) 314 (11,5%) Ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc 39 (7,1%) 89 (3,3%) Gia cầm và sản phẩm từ gia cầm 29 (5,3%) 187 (6,9%) Trái cây, rau và sản phẩm từ chúng 25 (4,5%) 98 (3,6%) Nhóm khác (chƣa rõ) 33 (4,3%) 123 (4,6%) Tổng 552 (100%) 2725 (100%) (Nguồn: Risk Assessment Studies, Report No.20, 2005 ) [...]... chứa gen tdh mà còn chứa cụm gen T3SS2 Do vậy, Vp-PAI liên quan đến phát sinh bệnh của V parahaemolyticus gây ra ở người 1.3 Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài 1.3.1 Mục tiêu Phân lập và định danh loài V parahaemolyticus ở các chợ thành phố Nha Trang có mặt trong một số hải sản tươi sống (tôm, mực, cá, cua…) Xác định gen độc tố của vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, tạo cơ sở khoa học cho vi c... trường tăng sinh vi khuẩn APW 3% NaCl - Cấy các chủng vi khuẩn đã chọn lọc vào môi trường - Nuôi cấy tĩnh các chủng vi khuẩn trên máy lắc ở 150 vòng/ phút trong vòng 36 giờ - Tiến hành đo OD600 từ lúc cấy vào và cứ mỗi 2-3 giờ đo một lần - Dựng đường cong sinh trưởng của các chủng Vibrio 2.3.4 Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio a Xác định khả năng chịu muối của vi khuẩn Vibrio Mục đích:... (Nishibuchi và Kaper, 1995) có trình tự gen độc tố tdh, trh giống với gen độc tố tdh, trh ở chủng V 16 parahaemolyticus gây bệnh nên trong nghiên cứu, Sujeewa và cộng sự (2009) không chỉ xác định mỗi gen tdh, trh mà còn xác định gen toxR để chỉ ra chính xác đây là loài V parahaemolyticus Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các gen. .. 2.3.3 Xác định khả năng sinh trƣởng Mục đích: - Xây dựng đường cong sinh trưởng (đường chuẩn) của vi khuẩn Vibrio - Test sinh hóa - Giữ giống Nguyên lý: Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng cách đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm Dựa vào đường chuẩn để xác định các pha sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó tiến hành các bước giữ giống, test sinh hóa cho đúng với các giai đoạn phát triển của. .. liệu 2.1.1 Mẫu Mẫu hải sản (tôm bạc, tôm sú, cua biển, mực ống) được thu mua từ các chợ ở Nha Trang: chợ biển (Bãi Dương), chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ từ 15/03 đến 15/04 Bảng 2.1 Các mẫu hải sản thu mua từ một số chợ ở thành phố Nha Trang dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio STT Ngày lấy mẫu Địa điểm Số lƣợng mẫu lấy Tôm 1 15.03.2010 Vĩnh Hải 3 2 08.04.2010 Vĩnh Thọ 3 3 15.04.2010 Cua Chợ biển (Bãi Dương)... chúng từ các cặn trầm tích, nước, thực vật và hải sản Các loài hải sản là nơi an toàn cho các loài Vibrio sinh sống, bao gồm các loài như trai, sò, cua, tôm, mực Đối với các loài không ưa mặn, chúng có thể được phân lập từ mẫu nước ngọt (Rujiwat, 2007) Hầu hết các loài Vibrio phân lập từ các mẫu lâm sàng của người đều gây bệnh ngoại trừ V vurnissi Vibrio spp thường gây tiêu chảy hoặc nhiễm độc ngoài... Đặc điểm của V parahaemolyticus Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn V parahaemolyticus đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi (Tế bào vi khuẩn có hình dấu phẩy, di động bằng lông mao đơn cực) 10 Phân loại khoa học của Vibrio parahaemolyticus: Giới : Vi khuẩn Ngành : Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ : Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio Loài: V parahaemolyticus Theo khóa phân loại của Bergey, V parahaemolyticus. .. triển trong môi trường chứa acid Chúng sinh trưởng tốt trong khoảng pH từ 7,4 – 9,6, ức chế ở pH 6,8 và 10,2 (Rujiwat, 2007) Các loài Vibrio chủ yếu sống ở nước và phân bố dựa vào nhiệt độ, nồng độ Na+, hàm lượng dinh dưỡng có trong nước và sự có mặt của các loài thực vật và động vật (McCarter, 1999) Chúng thường sống ở biển hoặc cửa sông, trên bề mặt và trong ruột động vật biển Người ta thường phân lập. .. đến các độc tố khác Gen toxR có kích thước 368 bp là gen điều hòa cho operon Vp- toxRS (Zulkifli và cộng sự, 2009), tồn tại ở tất cả các chủng V parahaemolyticus Ở loài V cholerae, gen toxR được biết là gen điều hòa dịch mã của gen ctxmã hóa cho độc tố tả Các nghiên cứu sau đó cũng chỉ ra gen toxR là gen mã hóa protein màng đóng vai trò chủ chốt trong điều hòa gen ctx và nhiều gen khác, bao gồm gen. .. 65 Các kiểu huyết thanh (O4: K48 và O1: K56, và O3: K6) chiếm ưu thế trong các dịch bệnh (Nandini và cộng sự, 2000) Các chủng V parahaemolyticus được phân lập cùng một kiểu huyết thanh có thể giống nhau hoặc phân biệt với nhau Không phải tất cả các chủng V parahaemolyticus đều gây bệnh ở người Thực tế, phần lớn các chủng phân lập từ môi trường hoặc hải sản không gây bệnh Các chủng gây bệnh thì sản . ra các vụ ngộ độc thức ăn nên cần nghiên cứu khả năng gây bệnh của chúng. Đề tài Phân lập và xác định gen độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong hải sản tƣơi sống tại các chợ ở thành. thành phố Nha Trang được tiến hành với mục tiêu: Phân lập và định danh loài V. parahaemolyticus ở các chợ thành phố Nha Trang có mặt trong một số hải sản tươi sống (tôm, mực, cá, cua…). Xác. Các kháng nguyên của V. parahaemolyticus (1986) 11 Bảng 2.1. Các mẫu hải sản thu mua từ một số chợ ở thành phố Nha Trang dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio 19 Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng