BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ========== NGUYỄN ANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ CONOTOXIN TỪ BA LOÀI ỐC CỐI CONUS STRIATUS, CONUS TEXTILE, CONUS VEXILLUM VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CỦA ĐỘC TỐ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1. PGS – TS. NGÔ ĐĂNG NGHĨA 2. CN. NGUYỄN THANH SƠN Nha Trang, tháng 07 năm 2010 ii LỜI CẢM ƠN Qua 3 tháng nỗ lực phấn đấu cuối cùng với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và bạn bè tôi đã hoàn tất đồ án này. Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS - TS Ngô Đăng Nghĩa và CN Nguyễn Thanh Sơn đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đồ án. Em xin bày tỏ lòng biết ơn trân trọng nhất tới các thầy cô giáo, các cán bộ trong Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức trong những năm học vừa qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm: Bộ môn Công Nghệ Sinh học, bộ môn Môi Trường, tổ Nghiên Cứu thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực tập. Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên lớp 48cnsh, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ động viên tôi. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến cùng anh chị em thân yêu. Những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chật lẫn tinh thần trong quá trình học tập và thực hiện đồ án. Sinh viên Nguyễn Anh Phương iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Đặt vấn đề 3 1.1.1. Tính cấp thiết của đề tài 3 1.1.2. Ý nghĩa khoa học của đề tài 4 1.1.3. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4 1.2. Tổng quan về ốc Conus và tuyến độc tố 4 1.2.1. Bộ máy nọc độc của ốc cối 6 1.2.2. Cơ chế tác động của độc tố ốc cối 11 1.2.3. Tác dụng của độc tố ốc cối 11 1.2.4. Những công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 13 1.2.4.1. Tài liệu nước ngoài 13 1.2.4.2. Tài liệu trong nước 14 1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 15 1.3.1. Tổng quan về phương pháp sắc ký 15 1.3.1.1. Lịch sử ra đời phương pháp sắc ký 15 1.3.1.2. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 17 1.3.1.3. Phân loại phương pháp sắc ký 17 1.3.1.4. Các cách tiến hành phân tích sắc ký 19 iv 1.3.2. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 20 1.3.2.1. Cơ sở lý thuyết 20 1.3.2.2. Hệ thống HPLC 26 1.3.2.3. Chọn điều kiện sắc ký 30 1.3.2.4. Tiến hành sắc ký 32 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. Đối tượng nghiên cứu 34 2.2. Hóa chất và dụng cụ 34 2.2.1. Dụng cụ, thiết bị 34 2.2.2. Hóa chất 34 2.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35 2.3. Phương pháp thực hiện 36 2.3.1. Giải phẫu tách tuyến nọc độc 36 2.3.2. Chuẩn bị mẫu phân tích cho HPLC 36 2.3.3. Xác định độc tố conotoxin bằng HPLC 36 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Xác định khối lượng độc tố thô/cá thể 38 3.2. Phố HPLC 41 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 46 4.1. Kết luận 46 4.2. Một số đề xuất 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 v DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Kí hiệu viết tắt Diễn giải HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IUPAC Hội hoá học cơ bản và ứng dụng quốc tế GC Sắc ký khí LC Sắc ký lỏng LSC Sắc ký lỏng – rắn BPC Sắc ký hấp phụ IEC Sắc ký trao đổi ion SEC Sắc ký phân loại theo kích cỡ GSC Sắc ký khí – rắn GLC Sắc ký khí – lỏng WLOT Cột ống mở PLOT Cột nhồi KL Khối lượng NP Pha thuận RP Pha ngược MeOH Methanol ACN Acetonitril TFA Trifluoro acetic acid vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Số liệu thống kê khối lượng tuyến nọc độc của Conus textile 38 3.2 Số liệu thống kê khối lượng tuyến nọc độc của Conus striatus 38 3.3 Số liệu thống kê khối lượng tuyến nọc độc của Conus vexillum 39 3.4 Khối lượng trung bình tuyến nọc độc của 3 loài ốc cối 39 3.5 Khối lượng độc tố ốc thô, độc tố ốc thô/cá thể của 3 loài ốc cối 40 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hình dáng bên ngoài conus vexillum 6 1.2 Hình dáng bên ngoài conus textile 6 1.3 Cấu tạo tuyến nọc độc conus textile 6 1.4 Phân loại các phương pháp sắc ký 18 1.5 Quá trình tách các chất A và C trong cột tách sắc ký 20 1.6 Sắc ký đồ quá trình phân tách ở Hình 1.5 21 1.7 Các thông số chính của quá trình sắc ký lỏng cơ bản 24 1.8 Độ phân giải ở các nồng độ khác nhau 24 1.9 Tính không đối xứng của peak 26 1.10 Các bộ phận cơ bản của hệ thống HPLC 26 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35 3.1 Biểu đồ so sánh khối lượng trung bình tuyến nọc độc của 3 loài ốc cối 40 3.2 Biểu đồ so sánh khối lượng độc tố ốc thô, độc tố ốc thô/cá thể của 3 loài ốc cối 41 3.3 Phổ sắc ký đồ của Conus textile ở Gradient 60 phút 42 3.4 Phổ sắc ký đồ của Conus textile ở Gradient 90 phút 42 3.5 Phổ sắc ký đồ của Conus textile ở Gradient 120 phút (lần 1) 43 3.6 Phổ sắc ký đồ của Conus striatus ở Gradient 120 phút 44 3.7 Phổ sắc ký đồ của Conus textile ở Gradient 120 phút (lần 2) 44 3.8 Phổ sắc ký đồ của Conus vexillum ở Gradient 120 phút 45 1 MỞ ĐẦU Ốc cối là một trong những họ động vật thân mềm lớn (gồm khoảng 700 loài) thuộc loại ăn thịt, có nọc độc, phân bố khắp nơi trên thế giới đặc biệt là ở vùng biển nhiệt đới. Độc tố của chúng là các peptide có hoạt tính gây độc thần kinh còn gọi là conotoxin chứa trong ống độc. Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về các loài này đặc biệt các nghiên cứu về hệ protein của từng loài cũng như xác định các protein độc của chúng rất được các nhà khoa học quan tâm. Ở Việt Nam, thành phần protein các loài ốc cối còn chưa được nghiên cứu, khai thác [4]. Trong đồ án này chúng tôi trình bày phương pháp nghiên cứu tách chiết độc tố conotoxin từ ba loài ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum và bước đầu khảo sát thành phần của độc tố bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nội dung chính như sau:  Tìm hiểu khái quát về ốc cối và tuyến nọc độc của chúng.  Tách chiết độc tố conotoxin từ ba loài ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum.  Tìm hiểu phổ Sắc ký đồ của ba loài ốc cối trên.  Thảo luận kết quả và đề xuất ý kiến. 2 Chương 1. TỔNG QUAN Ốc là tên chung để chỉ hầu hết các loài động vật thân mềm trong lớp Chân bụng với đặc điểm có vỏ xoắn khi trưởng thành (có các loài ốc không có vỏ hoặc vỏ rất nhỏ, ví dụ ốc sên trần). Đặc điểm chung là có vỏ cứng bằng đá vôi, tạo thành ống rỗng, cuộn vòng quanh trục chính thành các vòng xoắn, thường theo chiều thuận với chiều kim đồng hồ. Ốc sống ở rất nhiều môi trường, từ rãnh nước, sa mạc, cho đến những vực biển sâu. Đa số các loài ốc sống ở môi trường biển. Nhiều loại khác sống trên cạn, trong môi trường nước ngọt và nước lợ [3]. Ở Việt Nam, ốc là một trong những nhóm nguồn lợi hải sản quan trọng, có mức độ phong phú về thành phần loài, trong đó có nhiều loài có giá trị thương mại cao như ốc Tù Và, ốc Hương, ốc Bàn Tay, ốc Cối đã được khai thác với sản lượng lớn. Tuy nhiên trong những năm gần đây, nguồn lợi ốc đã và đang có chiều hướng suy giảm nhanh chóng do việc khai thác quá mức, chưa có biện pháp quản lý và sử dụng hợp lý nguồn lợi. Nhiều loài ốc có nguy cơ tuyệt chủng hoặc đe dọa bị tuyệt chủng đã được liệt kê trong danh mục những loài cần được bảo tồn (Sách đỏ Việt Nam, 2003). Hiện nay tại Việt Nam người ta chỉ quan tâm đến các loài ốc bởi giá trị thương mại và thực phẩm của chúng, trong khi đó chúng còn có các giá trị như trong y học, đa dạng sinh học cho đến nay hầu như chưa có nhiều các nghiên cứu. Ốc cối (Conus) là một trong những loài có giá trị thương mại, y học, tính đa dạng sinh học cao. Chúng có số lượng loài lớn nhất trong số các động vật không xương ở biển gồm khoảng 700 loài, độc tố contoxin của chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, thuốc giảm đau trong khoa học thần kinh. Ở Việt Nam hiện nay đã phát hiện được khoảng 62 loài ốc Conus [2] trong đó có 20 loài thường xuất hiện ở các vùng biển Việt Nam đó là: Conus capitaneus, Conus tulipa, Conus lividus, Conus miles, Conus marmoreus, Conus bandanus, Conus litteratus, Conus bilious, Conus vexillum, Conus caracteristicus, Conus distans, Conus imperialis, Conus quercinus, 3 Conus textile, Conus betulinus, Conus generalis, Conus lynceus, Conus musteus, Conus lynceus, Conus varius, Conus flavidus.  Phân loại ốc cối [3] Giới (Kingdom): Animalia Linnaeus, 1758 – animals. Phân giới (Subkingdom): Bilateria (Hatschek, 1888) Cavalier-Smith, 1983 – bilaterians. Chi (Branch): Protostomia Grobben, 1908 – protostomes. Dưới chi (Infrakingdom): Lophotrochozoa – Lophotrochozoans. Liên ngành (Superphylum): Eutrochozoa. Ngành (Phylum): Mollusca (Linnaeus, 1758). Lớp (Class): Gastropoda Cuvier, 1795 - Snails and Slugs. Phân lớp (Subclass): Orthogastropoda Lindberg, 1996. Liên bộ (Superorder): Caenogastropoda Cox, 1960. Bộ (Order): Sorbeoconcha Ponder & Lindberg, 1997. Phân bộ (Suborder): Hypsogastropoda Lindberg, 1997. Phân bộ (Infraorder): Neogastropoda Thiele, 1929. Liên họ (Superfamily): Conoidea Fleming. Họ (Family): Conidae Rafinesque, 1815 - Cone. Giống (Genus): Conus Linnaeus, 1758. 1.1. Đặt vấn đề 1.1.1. Tính cấp thiết của đề tài Conotoxin trong các loài Conus là một trong những độc tố đa dạng nhất. Ước tính có khoảng 700 loài ốc Conus trên toàn thế giới, mỗi loài có đến 50-200 độc tố conotoxin khác nhau [1]. [...]... c ci Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum l mt trong hn 700 loi Conus sng vựng bin nhit i v cn nhit i c t conotoxin ca chỳng nm bu c v ng c a dng v thnh phn v cu trỳc ca cỏc conotoxin ang c nghiờn cu v mt s loi c cho l cú tim nng s dng nh l cỏc tỏc nhõn dc lý c bit trong chn oỏn v tr liu Trờn c s ú chỳng tụi tin hnh NGHIấN CU TCH CHIT C T CONOTOXIN T BA LOI C CI Conus striatus, Conus textile,. .. LOI C CI Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum V BC U KHO ST THNH PHN CA C T BNG SC Kí LNG HIU NNG CAO (HPLC) 1.1.2 í ngha khoa hc ca ti Bc u xỏc nh ph Sc ký ca c t 3 loi c Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum, qua ú bit c mc phc tp ca cỏc hn hp peptide trong c t, lm nn tng cho cỏc nghiờn cu sõu v sau 1.1.3 í ngha thc tin ca ti Cung cp d liu ban u v thụng tin ca ph c t, t ú cú th... cha cỏc peptide ngn c gi l conotoxin, mi loi c ci sn sinh ra mt hn hp cỏc peptide c rt phc tp, cú cu trỳc v tớnh dc lý c trng Conotoxin gm nhng nhúm sau: - Conotoxin tỏc ng lờn kờnh natri: à-, à0- v -conotoxin - Conotoxin tỏc ng lờn kờnh canxi: nhúm -conotoxin - Conotoxin tỏc ng lờn th th nicotinic acetylcholine: h -conotoxin - Conotoxin tỏc ng lờn kờnh kali: -conotoxin Conotoxin tỏc ng lờn Nmethyl-D-aspartate:... ụng nam nc Australia) cho bit c t c cú nhiu loi khỏc nhau gm: tetrodotoxin, saxitoxin v conotoxin trong c ci Mt khỏc, nghiờn cu nc c ca c vựng Sydney ú l Conus imperialis v Conus pennaceous cha c t alpha conotoxin, omega conotoxin c sn xut bi Conus geographus v Conus magus Nm 1999, trong bi bỏo a dng sinh hc ca ging Conus (Fleming, 1822): Ngun phong phỳ cỏc peptide cú hot tớnh sinh hc ca Frộdộric Le Gall,... nc c ca Conus californicus Nm 2008, cỏc nh khoa hc Thomas F.Duda Jr, Matthew B.Bolin, Christopher P.Meyer, Alan J.Kohn (M) a ra kt qu nghiờn cu khi s dng k thut di truyn phõn nh v mụ t mt s loi trong ging Conus spp m trc õy bin phỏp mụ hc thụng thng cha thc hin c gm cỏc loi sau: Conus 14 sponsalis, Conus nanus, Conus ceylanensis, Conus musicus v Conus parvatus ti min tõy n - Thỏi Bỡnh Dng v Conus nux... lu cht hp ph rn + Lc hp ph bao gm lc Van de Walls, lc cm ng, lc liờn kt húa hc v lc liờn kt hydrogen + Sc ký lng xỏc nh c rt nhiu loi cu t, c bit l cỏc cht cú khi lng phõn t ln 19 1.3.1.4 Cỏc cỏch tin hnh phõn tớch sc ký [7] Tu thuc ch a mu vo h thng sc ký cng nh cỏc thao tỏc tin hnh sc ký, ngi ta chia cỏch tin hnh sc ký thnh ba loi: Phng phỏp tin lu õy l phng phỏp sc ký n gin nht Vớ d, hn hp hai... v cỏc loi conotoxin trong h thng c t c ci Cng trong nm ny cỏc nh khoa hc M l Manami Nishi v Alan J Kohn ó nghiờn cu so sỏnh tỳi rng kitin ca 11 loi trong ging Conus spp Trong ú cú Conus bandanus v Conus textile Nm 2002, Jennifer Marshall, Wayne P Kelley, Stanislav S Rubakhin, JonPaul Bingham, Jonathan V Sweedler, v William F Gilly trong Nhng yu t tng quan n gii phu v s sn sinh c t trong Conus californicus... sut khụng lờn v mỏy sc ký s ngng hot ng Trong bt c trng hp no nờu trờn cng cho kt qu phõn tớch sai + Pump Cao ỏp: 28 - Mc ớch bm pha ng vo ct thc hin quỏ trỡnh chia tỏch sc ký Pump phi to c ỏp sut cao khong 3000-6000 psi hoc 250 at n 500 at (1 at = 0,98 Bar) v Pump phi to dũng liờn tc Lu lng bm t 0,1 n 9,999 mL/phỳt - Mỏy sc ký lng ca chỳng ta hin nay thng cú ỏp sut ti a 412 Bar Tc dũng 0,1-9,999... Hỡnh 1.4: Phõn loi cỏc phng phỏp sc ký - Sc ký khớ: trong sc ký khớ mu c tỏch do s phõn b gia pha tnh v pha ng nh c ch hp ph, phõn b hoc kt hp c hai c ch ny + Khi pha tnh l mt cht hp ph rn thỡ k thut phõn tớch c gi l sc ký khớ rn + Khi pha lng c gn lờn b mt ca cht mang tr hoc c ph di dng mt lp phim mng bờn thnh ct mao qun thỡ k thut ny c gi l sc ký khớ lng - Sc ký lng: l quỏ trỡnh tỏch do ỏi lc khỏc...4 c t ca Conus l hn hp ca cỏc polypeptide gm cỏc acid amin trong ú cú mt khung l cỏc cystein vi cỏc cu ni disulfide cú kh nng c ch cỏc kờnh ion v cỏc th th dn truyn thn kinh Ngoi vai trũ quan trng l bt mi v bo v thỡ conotoxin cũn l mt cụng c hu ớch trong khoa hc thn kinh Hn na, conotoxin cng cho thy tim nng ln trong vic phỏt trin thuc, vớ d conotoxin MVIIA t Conus magus cú kh nng bao võy kờnh calcium . hành “NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ CONOTOXIN TỪ BA LOÀI ỐC CỐI Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CỦA ĐỘC TỐ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) pháp nghiên cứu tách chiết độc tố conotoxin từ ba loài ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum và bước đầu khảo sát thành phần của độc tố bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nội. khái quát về ốc cối và tuyến nọc độc của chúng.  Tách chiết độc tố conotoxin từ ba loài ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum.  Tìm hiểu phổ Sắc ký đồ của ba loài ốc cối trên.