Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VALIDAMYCIN A CỦA XẠ KHUẨN Streptomyces hygroscopicus 11405 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VALIDAMYCIN A CỦA XẠ KHUẨN Streptomyces hygroscopicus 11405 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã Số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. PHÍ QUYẾT TIẾN Thái Nguyên - 2013 i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Phí Quyết Tiến. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Thái Nguyên, tháng 8 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Huyền ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, dìu dắt tận tình, động viên, chỉ bảo trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận văn tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Đồng thời tôi cũng cảm ơn TS. Phan Thị Hồng Thảo, ThS. Nguyễn Thị Hồng Liên cùng các cán bộ phòng công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, những người đã động viên, giúp đỡ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản Luận văn này. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quí báu đó! Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Huyền iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về chất kháng sinh và validamycin A 3 1.1.1. Khái niệm chất kháng sinh 3 1.1.2. Một số cơ chế tác động của chất kháng sinh đối với vi sinh vật 5 1.1.3. Kháng sinh bảo vệ thực vật 8 1.1.4. Validamycin A 9 1.2. Xạ khuẩn sinh validamycin A 13 1.2.1. Đặc điểm của xạ khuẩn 13 1.2.2. Thời điểm sinh kháng sinh của xạ khuẩn 19 1.2.3. Một số đặc trưng cơ bản của xạ khuẩn có khả năng sinh validamycin A 20 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng lên men sinh validamycin A của xạ khuẩn 21 1.3.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men 21 1.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện lên men 23 1.4. Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp validamycin A trong và ngoài nước…………………………………………………………………….24 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 24 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 25 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1. Vật liệu 29 29 2.1.2. Hóa chất sử dụng 29 29 2.1.4. Thành phần môi trường nuôi cấy 30 2.2. Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1. Phương pháp giữ giống 30 2.2.2. Nhân giống xạ khuẩn 30 2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 31 2.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa 32 2.2.5. Phương pháp thu hồi dịch validamycin A thô 34 2.2.6. Xác định hoạt tính validamycin A 34 2.2.7. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp validamycin A 35 2.2.8. Xác định điều kiện lên men sinh validamycin A của xạ khuẩn trong bình tam giác 35 2.2.9. Xác định ảnh hưởng của thời gian lên men sinh tổng hợp validamycin A 35 2.2.10. Nghiên cứu đặc tính và độ bền của validamycin A 36 2.2.11. Xác định khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch validamycin A thô 36 2.2.12. Phương pháp xử lý số liệu 36 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn thích hợp cho sinh tổng hợp val-A37 3.1.1. Đặc điểm sinh học sơ bộ của hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 37 3.1.2. Khả năng sinh enzyme protease, cellulase và amylase của hai chủng xạ khuẩn 39 3.1.3. Khả năng sinh tổng hợp validamycin A của hai chủng xạ khuẩn 40 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1.4. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn 43 3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng S. hygroscopicus 11405 46 3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405 46 3.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405 48 3.3. Nghiên cứu thành phần môi trường và điều kiện lên men của chủng S. hygroscopicus 11405 50 3.3.1 Lựa chọn môi trường lên men 50 3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh validamycin A của chủng S. hygroscopicus 11405 51 3.3.3. Lựa chọn tỷ lệ tiếp giống cho lên men sinh tổng hợp validamycin A 52 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp validamycin A 52 3.3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp validamycin A…… 53 3.4. Đặc điểm của dịch validamycin A thô 54 3.4.1. Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh 54 3.4.2. Độ bền nhiệt và bền pH của dịch validamycin A thô 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 65 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ ADN Acide deoxyribonucleic ARN Acide ribonucleic BVTV Bảo vệ thực vật CKS Chất kháng sinh Đ VVK Đường kính vòng vô khuẩn HTKS Hoạt tính kháng sinh IU International Unit KTCC Khuẩn ty cơ chất KTKS Khuẩn ty khí sinh MT Môi trường Val-A Validamycin A vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Đặc điểm nuôi cấy của hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 37 Bảng 3.2. Khả năng ức chế nấm R. solani của hai chủng S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus CNLM 41 Bảng 3.3. Bảng so màu khuẩn lạc của chủng S. hygroscopicus 11405 trên các môi trường nuôi cấy tại các thời điểm khác nhau 47 Bảng 3.4. Khả năng đồng hoá nguồn carbon của chủng S. hygroscopicus 11405 49 Bảng 3.5. Khả năng chịu muối, chịu nhiệt độ và khoảng pH thích hợp cho sinh trưởng của xạ khuẩn 50 Bảng 3.6. Phổ kháng VSV của chủng S. hygroscopicus 11405 55 viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của val-A 9 Hình 1.2. Cơ chế tác động của val-A đến quá trình chuyển hóa năng lượng ở vi nấm 11 Hình 1.3. Hình ảnh minh họa sự nảy mầm và phát triển của xạ khuẩn. 17 Hình 1.4. Mối quan hệ giữa các pha sinh trưởng của xạ khuẩn 18 Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc của hai chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus CNLM khi nuôi cấy trên môi trường thạch ISP2 38 Hình 3.2. Khả năng sinh tổng hợp ba loại enzyme ngoại bào của chủng S. hygroscopicus 11405 (A) và S. hygroscopicus CNLM (B) 40 Hình 3.3. Phổ sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của val-A chuẩn (A) và val-A có trong dịch lên men của chủng S. hygroscopicus 11405 (B) và chủng S. hygroscopicus CNLM (C) 42 Hình 3.4. Hình ảnh minh họa kết quả sàng lọc tự nhiên về hoạt tính kháng nấm chủng S. hygroscopicus 11405 (A) và S. hygroscopicus CNLM (B) 43 Hình 3.5. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R. solani của chủng S. hygroscopicus 11405 44 Hình 3.6. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R. solani của chủng S. hygroscopicus CNLM 45 Hình 3.7. Hình ảnh minh họa hình dạng khuẩn lạc chủng S. hygroscopicus 11405 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 47 Hình 3.8. Cuống sinh bào tử của chủng S. hygroscopicus 11405 chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 10.000 lần) 48 Hình 3.9. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng hợp val-A 50 Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng hợp val-A 51 Hình 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh val-A 52 [...]... val -A, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và một số điều kiện lên men sinh tổng hợp validamycin A c a xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus 11045“ Mục tiêu nghiên cứu: L a chọn một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp val -A và nghiên cứu đặc điểm sinh học, một số điều kiện lên men sinh kháng sinh val -A c a xạ khuẩn được l a chọn Nội dung chính c a đề tài bao gồm 4 phần: - Nghiên. .. phần: - Nghiên cứu l a chọn chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp valA cao - Nghiên cứu đặc điểm sinh học c a chủng S hygroscopicus 11405 được tuyển chọn - Nghiên cứu l a chọn môi trường và điều kiện lên men sinh val -A c a chủng S hygroscopicus 11405 - Bước đầu nghiên cứu đặc điểm c a dịch val -A thô sinh tổng hợp bởi chủng S hygroscopicus 11405 Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men - Viện... giống như val -A thủy phân thành validamine [18], [19] Kameda đã nghiên cứu sự chuyển h a c a validamycin nhờ VSV và nhận thấy liên kết glucoside c a validamycin bị cắt có chọn lọc khi VSV thủy phân, đặc biệt validamycin C chuyển h a thành val -A nhờ Endomycosis spp hay Candida spp có ý ngh a quan trọng vì validamycin C có hoạt tính kháng Pellicularia sasakii thấp hơn 1000 lần so với val -A [30], [31],... [32] 1.1.4.2 Đặc tính h a lý c a validamycin A Validamycin A tan nhanh trong nước, methanol, dimethylsulfoxide và dimethylformamide; tan kém trong acetone và ethanol và không tan trong ethylacetate và ethyleter Val -A tan nóng chảy ở 100°C và bị phân hủy ở 135°C Khả năng quay cực c a val -A: [α]D24 = +110 15 (c = 1 trong nước), pKa = 6.0 Độ bền: Val -A bền trong môi trường kiềm hay acid và bền dưới ánh... validamycin, đặc biệt là làm giảm giá thành trong sản xuất công nghiệp 1.2 Xạ khuẩn sinh validamycin A 1.2.1 Đặc điểm c a xạ khuẩn 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái c a xạ khuẩn Hình thái c a khuẩn lạc xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình dạng c a chúng thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm…) Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc khô, kích thước thay... phân hủy nhanh, thời gian bán hủy < 2 giờ P denitrificans phân hủy val -A thành D-glucose và validoxylamine, Số h a bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 validoxylamine tiếp tục bị phân hủy để tạo ra valienamine, validamine và các hợp chất khác [25], [26] 1.1.4.3 Hoạt tính sinh học c a val -A Theo Nioh và Mizushima, val -A không gây ức chế sự sinh trưởng c a nấm và không làm thay đổi hàm... là validamycin, trong đó hiệu quả nhất là validamycin dạng đồng phân A Validamycin A (val -A) là một kháng sinh nhóm aminoglycoside có hoạt tính kháng nấm được sinh tổng hợp chủ yếu bởi Streptomyces hygroscopicus var limoneus [25] và S hygroscopicus subsp jinggangensis 5008 [39] Nhờ hiệu quả phòng trừ nấm cao cũng như an toàn cho con người và động vật, val -A trở thành một trong những kháng sinh quan... kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất bậc hai, thông thường được hình thành ở cuối pha sinh trưởng (pha log), trong pha cân bằng Ở xạ khuẩn, Số h a bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 20 sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử Đây là điểm cần lưu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn [11], [12] 1.2.3 Một số đặc trƣng cơ bản c a xạ khuẩn. .. tố điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp phần lớn chất kháng sinh không quá 10 µg/ml [9] Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng acid nucleic trong khuẩn ty xạ khuẩn, làm kéo dài pha sinh trưởng, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng sinh tổng hợp chất kháng sinh [8], [9] 1.3.2 Ảnh hƣởng c a điều kiện lên men. .. nucleic acid và thành phần c a thành tế bào nhưng gây thay đổi hình thái c a nấm R solani bằng cách ức chế quá trình sinh tổng hợp myo-inositol và làm giảm độc tính c a nấm [32] Validamycin A cũng ức chế trehalase c a R solani cũng như ở nhiều loài sinh vật khác như chuột, thỏ, lợn, nấm men và côn trùng với IC 50 = 10-810-6 M Trehalase được phân bố rộng rãi ở nhiều loài sinh vật, đóng vai trò quan trọng . Mục tiêu nghiên cứu: L a chọn một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp val -A và nghiên cứu đặc điểm sinh học, một số điều kiện lên men sinh kháng sinh val -A c a xạ khuẩn được l a chọn. Nội. thiết và nhu cầu thực tiễn c a việc sử dụng val -A, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và một số điều kiện lên men sinh tổng hợp validamycin A c a xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus. ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VALIDAMYCIN A C A XẠ KHUẨN Streptomyces hygroscopicus 11405