BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH -∗∗∗∗ BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ ĐỂ TÀI NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TỪ ĐẬU TƯƠNG LÊN MEN DÙNG CHO NGƯỜI BỆNH TIỂU ĐƯỜNG Chủ nhiệm đề tài: Ths Nguyễn Thị Hương Trà Cơ quan chủ trì: Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch Thời gian thực hiện: 1/2010 – 12/2010 Hà Nội, 2010 CHUYÊN ĐỀ THỰC HIỆN NĂM 2010 Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính kìm hãm αglucosidaza nghiên cứu tạo chế phẩm giống mốc khởi động cho lên men đậu tương Chuyên đề 1: Nghiên cứu tổng quan, xác định nội dung phương pháp nghiên cứu Chuyên đề 2: Phân lập chủng nấm mốc để lên men đậu tương tạo chất kìm hãm αglucosidaza Chuyên đề 3: Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả lên men tạo chất kìm hãm αglucosidaza nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng nấm mốc tuyển chọn Chuyên đề 4: Định tên chủng nấm mốc tuyển chọn (đến mức độ loài) Chuyên đề 5: Nghiên xứu xác định số yếu tố thích hợp cho q trình ni cấy tạo chế phẩm nấm mốc cho lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α - glucosidaza Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình cơng nghệ lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α - glucosidaza Chuyên đề 6: Nghiên cứu ảnh hưởng loại đậu tương đến khả tạo chất kìm hãm α-glucosidaza chủng nấm mốc tuyển chọn Chuyên đề 7: Khảo sát khả lên men tạo chất kìm hãm α - glucosidaza chủng nấm mốc lựa chọn môi trường đậu tương Chuyên đề 8: Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố công nghệ tới trình lên men bề mặt tạo chất kìm hãm α - glucosidaza nấm mốc BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH & - BÁO CÁO CHUYÊN ĐỂ Chuyên đề “Nghiên cứu tổng quan, xác định nội dung phương pháp nghiên cứu” Thuộc đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức từ đậu tương lên men dùng cho người bệnh tiểu” Chủ nhiệm đề tài: Ths Nguyễn Thị Hương Trà Trưởng nhóm thực hiện: Ths Nguyễn Thị Hương Trà Thời gian thực hiện: 1/2010 - 3/2010 Kinh phí thực hiện: 10.000.000 đồng Hà Nội, 2010 BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN CHUYÊN ĐỀ Chuyên đề 1: Nghiên cứu tổng quan, xác định nội dung phương pháp nghiên cứu Chủ nhiệm đề tài: Ths Nguyễn Thị Hương Trà Trưởng nhóm thực hiện: Ths Nguyễn Thị Hương Trà Thời gian thực hiện: 1/2010 - 3/2010 Kinh phí thực hiện: 10.000.000 đồng I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I.1 Vài nét thực phẩm chức Thuật ngữ thực phẩm chức (functional food) để chế phẩm thực phẩm chứa chất có hoạt tính sinh học cao, có dược tính từ động vật, thực vật, vi sinh vật, số chất tổng hợp giống hoạt chất tự nhiên vitamin, hương liệu v.v… có tính chất thiết dụng gần giống thuốc, khơng thay thuốc điều trị Thực phẩm chức chuyên gia đánh giá xu dinh dưỡng kỷ 21, đáp ứng phần quan trọng nhu cầu dinh dưỡng sức khỏe người sống đại Thực phẩm chức phân thành nhiều nhóm, phụ thuộc tác dụng sản phẩm thực phẩm chức cho người có đường huyết cao, thực phẩm chức cho người có cholesterol máu cao, thực phẩm chức cải thiện tiêu hoá…Tuy nhiên, hệ thống phân loại thực phẩm chức có tác dụng giảm đường huyết quan tâm xếp thành nhóm Thực phẩm chức vơ phong phú đa dạng, từ tự nhiên lên men truyền thống tới sản phẩm người chế biến, chủ yếu tập trung vào ba hình thức sau đây: - Thực phẩm chức có nguồn gốc tự nhiên: bao gồm loại động vật, thực vật, vi sinh vật mà thân có chứa chất “chức năng” với hàm lượng lớn, có tác dụng tích cực thể cà rốt chứa beta - caroten có khả làm sáng mắt, chống lão hoá, ngăn ngừa bệnh ung thư, chè xanh chứa catechin, rong, tảo giàu axít amin vitamin có tác dụng giảm béo, giảm hàm lượng cholesterol máu - Thực phẩm chức sản phẩm q trình chế biến, khơng có chất bổ sung sản phẩm từ sữa (sữa chua, mát) kích thích tiêu hố, điều hồ huyết áp, tăng khả miễn dịch Trong q trình lên men, ngồi việc tạo peptit chức số lượng lớn vi khuẩn lactic yếu tố quan trọng tạo nên chức sinh học sản phẩm - Thực phẩm qua chế biến bổ sung chất “chức năng” Đây thành công nghệ chế biến đại với hàng loạt sản phẩm chức nước cam có bổ sung canxi nhằm giảm nguy lỗng xương, thực phẩm có bổ sung vitamin E có tác dụng dụng tăng cường khả sinh dục, làm đẹp da… I.2 Thực phẩm chức từ đậu tương lên men Cây đậu tương hay cịn gọi đậu nành có tên khoa học Glycine max, thuộc họ đậu (Fabaceae) Ở Việt Nam, đậu tương công nghiệp, thực phẩm ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng cao dùng làm thực phẩm cho người thức ăn chăn ni Chính đậu tương 10 chương trình ưu tiên phát triển ngành nông nghiệp nước ta Trong hạt đậu tương có thành phần hố học sau: Protein (40%), lipit (12-25%), gluxit (10 - 15%); có muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; vitamin A, B1, B2, D, E, F; enzym, sáp, nhựa, cellulo Đậu tương coi nguồn cung cấp protein hồn chỉnh chứa lượng đáng kể axit amin không thay cần thiết cho thể như: isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin Sản phẩm từ đậu tương sử dụng đa dạng dùng trực tiếp hạt thô chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, giá đậu tương, sữa đậu nành Trên giới, sản phẩm từ đậu tương đậu tương lên men sử dụng phổ biến dạng thực phẩm natto, miso (Nhật Bản), sufu (Trung Quốc), tempeh (Indonesia), Doenjang (Hàn Quốc) Đậu tương lên men khơng gia tăng giá trị dinh dưỡng mà cịn giảm nhiều chất kháng dinh dưỡng trypsin chymotrypsin Đó lý ăn thực phẩm từ đậu tương lên men không bị chướng bụng, đầy ăn sản phẩm từ đậu tương không lên men Những nghiên cứu nhiều năm trở lại cho thấy đậu tương có nhiều hoạt chất sinh học quí giá trị chúng tăng lên nhiều trải qua trình lên men nhờ vi sinh vật Ví dụ thu nhận dịch sữa đậu tương nảy mầm giàu isoflavon có hoạt tính sinh học cao (daidzein, genistein) vitamin E; axit gamma aminobutyric (GABA); peptit có khả kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin Gần đây, nhà khoa học phát đậu tương lên men cịn giàu chất kìm hãm α - glucosidase I.3 Cơ sở khoa học việc sử dụng chất kìm hãm α – glucosidaza để điều trị bệnh tiểu đường Bệnh đái tháo đường gọi bệnh tiểu đường, bệnh rối loạn chuyển hóa cacbonhydrat hc mơn insulin tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động thể, biểu mức đường máu cao mmol/l Hiện tỷ lệ tử vong bệnh tiểu đường xếp thứ ba sau ung bướu, tim - mạch máu não Theo Tổ chức WHO, năm 1985 giới ước tính có khoảng 30 triệu người mắc bệnh tiểu đường Sau 10 năm (năm 1994) số lên đến 110 triệu người Năm 2000 có 180 triệu người số dự báo tăng xấp xỉ 370 triệu người vào năm 2030 [8] Bệnh nhân tiểu đường phân thành hai nhóm: Tiểu đường typ hay cịn gọi tiểu đường phụ thuộc insulin: tuyến tụy không hoạt động tạo đủ insulin để cân đường huyết nên phải tiêm uống insulin Tiểu đường typ hay cịn gọi tiểu đường khơng lệ thuộc insulin: chiếm tỷ lệ chủ yếu bệnh tiểu đường Cơ thể người bệnh tiết insulin không đủ khiến đường không đưa vào tế bào mà lưu hành máu Muốn điều trị bệnh người ta cần áp dụng chế độ ăn uống hợp lý kiềm chế bệnh Các thuốc chữa bệnh tiểu đường chia làm nhóm gồm: biguanides, sulphonylurea, glinidines, thiazolidinediones, chất kìm hãm dipeptidyl peptidase IV chất kìm hãm α – glucosidaza (AGIs) Hiện nay, loạt chất kìm hãm enzym α - glucosidaza sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường voglibose (U.S Pat No 6,200,958), acarbose (U.S Pat No 5,643,874), miglitol (U.S Pat No 4,639,436) Tinh bột (nhiều phân tử glucose) Mạch máu Hình 1.1 Ảnh hưởng chất kìm hãm α - glucosidaza đến trình trao đổi đường thể Các nghiên cứu giới làm sáng tỏ sở khoa học việc sử dụng chất kìm hãm α-glucosidaza để điều trị bệnh tiểu đường sau: tinh bột đường (sucrose) chất dinh dưỡng quan trọng gọi carbohydrate Cấu tạo gồm hai hay nhiều monosaccharide (glucose fructose) Để thể người hấp thụ được, carbohydrate phân cắt hoàn toàn thành monosaccharide nhờ hệ thống enzym tiêu hóa Dưới tác dụng amylase, tinh bột bị phân cắt thành maltose Sucrose maltose disaccharide Dưới tác dụng α - glucosidaza chúng bị phân cắt thành monosaccharide ruột non AGIs kìm hãm α-glucosidaza nên ngăn cản tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho trình tổng hợp insulin diễn dễ dàng [28] Các kết nghiên cứu cho thấy, chất kìm hãm α-glucosidaza có tác dụng gia tăng nồng độ peptit - dạng glucagon (GLP-1) peptit-2 dạng glucagon (GLP-2) huyết tương GLP-1 GLP-2 hormon sinh từ tế bào L nội tiết nằm vùng ngoại biên ruột non ruột kết GLP-1 kích thích tiết insulin phụ thuộc glucoza sinh sôi tế bào beta GLP-2 cải thiện cấu trúc chức ruột non cách tăng cường cấu trúc lơng nhung tăng hoạt tính vận chuyển enzym GLP-2 làm giảm viêm ruột GLP-1 GLP-2 tạo có kích thích thần kinh, hormon yếu tố dinh dưỡng Chất kìm hãm αglucosidaza chất kìm hãm α-glucosidaza tự nhiên có khả ngăn cản phá hủy cacbonhydrat nên kéo dài thời gian có mặt cacbonhydrat ruột Do lượng lớn cacbonhydrat đến vùng ngoại biên ruột non tương tác với tế bào L làm tăng tiết GLP-1 GLP-2 Người ta cho có mặt glucoza ngoại biên ruột non, glucoza bị lên men tạo axit béo chuỗi ngắn kích thích sản xuất tiết GLP-1 GLP-2 trình vận chuyển glucoza phụ thuộc vào Na qua màng tế bào L kích thích tiết GLP-1 GLP-2 Nồng độ GLP-1 huyết tương tăng thúc đẩy q trình kiểm sốt glycemic cản trở có mặt glucoza máu I.4 Chất kìm hãm α – glucosidaza (AGIs) từ vi sinh vật AGIs tạo nhiều đường khác như: chiết xuất từ thực vật (từ hoa Punica granatum, 1-deoxynojirimicin hay DNJ từ dâu), tổng hợp đường hóa học (sulfonamit dẫn xuất xanthon) đường sinh học nhờ vi sinh vật Tuy nhiên, để sản xuất AGIs quy mô lớn đường chiết xuất tự nhiên tốn không đơn giản, mặt khác AGIs tổng hợp theo đường hóa học lại có nhược điểm gây số tác dụng phụ rối loạn chức gan triệu chứng đau dày cho người sử dụng Do việc sản xuất AGIs vi sinh vật thu hút quan tâm nghiên cứu nhà khoa học nhà sản xuất chúng sử dụng an tồn, khơng có tác dụng phụ thể sống Hiện số chủng vi sinh vật như: Aspergillus oryzae, Streptomyces, Actinoplanes Flavobacterium saccharophilium, Saccharomyces cerevisiae nghiên cứu thích hợp cho sinh tổng hợp AGIs [23, 33] Một số AGIs phổ biến như: acarbose - pseudo-tetrasaccharite thu nhận từ canh trường lên men Actinoplanes spp SE-50 Validamycin A từ Streptomyces hygroscopicus var limoneus Adiposin, trestatin B, cyclophellitol CKD-711 lấy từ Streptomyces calvus TM521, Streptomyces dimorphogenes Phellinus spp [33] Tuy nhiên, AGIs từ A oryzae hướng nghiên cứu I.5 A oryzae lên men bề mặt I.5.1 Dinh dưỡng A oryzae A oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002) Bào tử A oryzae có màu vàng hoa cau, khơng chứa độc tố aflatoxin A oryzae tiết môi trường enzym thủy phân cellulase, pectinase, xylanase hemicellulase sống môi trường có nguồn chất tương ứng cellulose, pectin, xylan hemicellulose nên A oryzae ứng dụng rộng rãi trình sản xuất, chế biến đồ ăn công nghiệp sản xuất enzym Ở Nhật Bản A oryzae sử dụng trình sản xuất thức ăn xì dầu, rượu sakê công nghiệp sản xuất enzym Ở Việt Nam A oryzae sử dụng chủ yếu trình làm tương Năm 2001, gen di truyền A oryzae phân tích giải mã Hệ gene gồm nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene 37 triệu cặp base (Galagan et al., 2005, Machida et al., 2005) (Hình 1.2) Hình 1.2 Cấu trúc gen A oryzae (Machida et al., 2005) bày bán quảng cáo có khả chữa khỏi bệnh Tuy nhiên, phổ biến Việt Nam nên việc quản lý loại sản phẩm nhiều bất cập Thêm vào đó, lợi dụng thiếu hiểu biết người tiêu dùng, số nhà phân phối quảng cáo tác dụng khiến nhiều người hiểu sai dùng sai thực phẩm chức Hiện để chữa bệnh tiểu đường người ta thường dùng nhóm thuốc sulphonylurea biguanidses với mục đích làm tăng hiệu lực tác dụng insulin, tăng tính thấm màng tế bào với glucose Ngồi ra, thuốc dùng để kìm hãm α – glucosidaza sử dụng nhiều, thuốc chủ yếu thường định cho người mắc bệnh, xu hướng chung tìm cách phịng bệnh Trong năm gần có số cơng trình nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức cho người bệnh tiểu đường rau má tan, chanh leo hịa tan có chứa xylooligosaccharide (XOS) [9]; trà dâu uống liền, trà dâu túi lọc chứa 1deoxynojirimicin (DNJ) [2], đường chức fructooligosaccharide (FOS) từ thịt chuối [7] Công nghệ sản xuất thực phẩm chức chứa protein giàu crom hữu từ nấm men Saccharomyces cerevisiae có tác dụng phịng chống bệnh tiểu đường typ nghiên cứu [5] Trương Hương Lan cộng [3] xác định số nguyên liệu giàu chất chức (đại mạch, vừng trắng, mướp đắng) sử dụng cho sản xuất thức ăn có tác dụng làm giảm hàm lượng đường máu Các nghiên cứu đậu tương lên men tập trung vào tạo sản phẩm dinh dưỡng natto (Nguyễn Thùy Châu cộng sự) tạo thực phẩm chức giàu nattokinaza (Nguyễn La Anh) hay tạo sản phẩm chức chứa peptit chuyển hóa angiotensin (ACEIP) [2] Nguyễn Văn Nguyện nghiên cứu công nghệ chiết xuất touchi từ đậu tương phương pháp lên men vi sinh vật Tuy nhiên, nghiên cứu dừng mức thăm dị cơng nghệ chiết xuất touchi mà chưa có điều kiện nghiên cứu sâu yếu tố khác công nghệ lên men phương pháp tách, thu hồi chất kìm hãm α - glucosidaza, chưa thử nghiệm động vật người chưa thể ứng dụng vào thực tiễn II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính kìm hãm αglucosidaza nghiên cứu tạo chế phẩm giống mốc khởi động cho lên men đậu tương 1.1 Nghiên cứu tổng quan, xác định nội dung phương pháp nghiên cứu 1.2 Phân lập chủng nấm mốc để lên men đậu tương tạo chất kìm hãm αglucosidaza 1.3 Tuyển chọn 2-3 chủng nấm mốc có khả lên men tạo chất kìm hãm αglucosidaza nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng nấm mốc tuyển chọn 1.4 Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử định tên chủng nấm mốc tuyển chọn phương pháp khuyếch đại đoạn ADN chứa vùng ITS1 - 5,8S- ITS2 (đến mức độ loài) 1.5 Nghiên cứu xác định số yếu tố thích hợp (thành phần mơi trường, độ ẩm môi trường, tỷ lệ giống mốc, nhiệt độ, thời gian, phương pháp sấy ) cho trình nuôi cấy tạo chế phẩm nấm mốc cho lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α - glucosidaza Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình cơng nghệ lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α - glucosidaza 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng loại đậu tương đến khả tạo chất kìm hãm αglucosidaza chủng nấm mốc tuyển chọn 2.2 Khảo sát khả lên men tạo chất kìm hãm α-glucosidaza chủng nấm mốc lựa chọn môi trường đậu tương 2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố cơng nghệ tới q trình lên men bề mặt tạo chất kìm hãm α – glucosidaza nấm mốc - Qúa trình lên men sơ cấp: Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, độ ẩm, pH, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống, độ thơng khí đến phát triển nấm mốc khả tạo chất kìm hãm α - glucosidaza - Quá trình lên men thứ cấp: + Khảo sát nồng độ muối bổ sung vào đậu tương lên men + Khảo sát nhiệt độ lên men tạo sản phẩm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza + Khảo sát thời gian ủ chín tạo sản phẩm có hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza 2.4 Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza phương pháp quy hoạch thực nghiệm Nội dung 3: Nghiên cứu quy trình tách chiết, thu nhận chất kìm hãm αglucosidaza từ đậu tương lên men 3.1 Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp cho q trình chiết xuất 3.2 Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho q trình thu nhận chất kìm hãm α-glucosidaza phương pháp ly tâm (vận tốc, nhiệt độ, thời gian ly tâm) 3.3 Lựa chọn phương pháp thu nhận chất kìm hãm α-glucosidaza: phương pháp sắc ký, sử dụng số dung môi hữu phân cực 3.4 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp sấy sản phẩm xác định điều kiện tối ưu trình sấy để chế phẩm tạo trì hoạt tính kìm hãm α- glucosidaza 3.5 Xác định tính ổn định chất kìm hãm α-glucosidaza: bao bì đóng gói, nhiệt độ, ánh sáng, thời gian bảo quản Nội dung 4: Sản xuất thử chất kìm hãm α – glucosidaza quy mơ 50 kg nguyên liệu/mẻ ứng dụng cho sản xuất số thực phẩm chức 4.1 Hoàn thiện thơng số cơng nghệ qui trình sản xuất sản xuất thử chất kìm hãm α- glucosidase qui mơ 50 kg nguyên liệu/mẻ ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chất kìm hãm α-glucosidaza đến số enzym tiêu hóa như: trypsin, chymotrypsin, pepsin, lipaza 4.3 Nghiên cứu ứng dụng chất kìm hãm α- glucosidaza cho sản xuất viên thực phẩm chức 4.3.1 Nghiên cứu công thức phối chế để tạo chế phẩm viên nén chứa chất kìm hãm α - glucosidaza 4.3.2 Xác định tính ổn định sản phẩm: bao bì đóng gói, nhiệt độ, ánh sáng, thời gian bảo quản 4.3.3 Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất viên thực phẩm chức chứa chất kìm hãm α- glucosidaza 4.4 Nghiên cứu ứng dụng chất kìm hãm α- glucosidaza cho sản xuất trà hoà tan 4.4.1 Nghiên cứu công thức phối chế để tạo sản phẩm trà hịa tan chứa chất kìm hãm α- glucosidaza 4.4.2 Xác định tính ổn định sản phẩm: bao bì đóng gói, nhiệt độ, ánh sáng, thời gian bảo quản 4.4.3 Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất trà hịa tan 4.5 Nghiên cứu ứng dụng chất kìm hãm α - glucosidaza cho sản xuất bột dinh dưỡng chức 4.5.1 Nghiên cứu tỷ lệ phối hợp chất kìm hãm α - glucosidaza cơng thức sản xuất bột chức 4.5.2 Xác định tính ổn định sản phẩm: bao bì đóng gói, nhiệt độ, ánh sáng, thời gian bảo quản 4.5.3 Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất bột chức chứa chất kìm hãm αglucosidaza Nội dung 5: Nghiên cứu thử nghiệm chất kìm hãm α-glucosidaza Xây dựng tiêu chuẩn sở công bố chất lượng sản phẩm Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm - Bộ Y tế 5.1 Đánh giá chất lượng sản phẩm: cảm quan, hoạt tính kìm hãm α – glucosidaza IC50, hàm lượng protein, lipit, độ ẩm 5.2 Đánh giá tính an tồn sản phẩm: phân tích tiêu lý, hóa, vi sinh vật, kim loại nặng, độc chất sản phẩm 5.3 Xác định độc tính cấp chất kìm hãm α – glucosidaza động vật 5.4 Xác định độc tính bán trường diễn chất kìm hãm α – glucosidaza động vật 5.5 Thử hiệu giảm đường huyết chất kìm hãm α – glucosidaza động vật 5.6 Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng tác dụng chất kìm hãm α – glucosidaza đối tượng tiểu đường: - Sàng lọc đối tượng - Cho đối tượng dùng sản phẩm theo dõi chế độ ăn, biểu sức khỏe suốt trình can thiệp - Đánh giá hiệu giảm đường máu bệnh nhân tiểu đường - Đánh giá ảnh hưởng sản phẩm đến số chức gan, thận (GOT, GPT, Ure ) bệnh nhân tiểu đường - Đánh giá ảnh hưởng sản phẩm đến số chức mỡ máu (Cholesterol, triglycerit, HDL- Cholesterol, LDL- Cholesterol) 5.7 Xây dựng tiêu chuẩn sở cho 03 sản phẩm thực phẩm chức 5.8 Công bố chất lượng Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm - Bộ Y tế sở số liệu phân tích thành phần dinh dưỡng, chất chức có hoạt tính sinh học sản phẩm, kết khảo nghiệm động vật kết nghiên cứu lâm sàng người III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza sử dụng tất nội dung nghiên cứu đề tài Lựa chọn nguồn α-glucosidaza: Các nguồn α-glucosidaza hãng Sigma cung cấp là: α-glucosidaza từ Bacillus stearothermophilus, từ gạo, từ Saccharomyces cerevisiae intestinal acetone powder từ chuột Một số cơng trình nghiên cứu làm sáng tỏ hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza khác sử dụng α-glucosidaza có nguồn gốc khác Với mục tiêu đề tài tạo chất kìm hãm α-glucosidaza ứng dụng cho bệnh nhân tiểu đường nên chúng tơi lựa chọn α-glucosidaza từ chuột cho thí nghiệm định tính định lượng hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza Có hai phương pháp định lượng thường sử dụng để xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza: Phương pháp 1: tiến hành theo phương pháp Yamaki Mori (2006) Nguyên lý: 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside α-glucosidaza α-D-glucose + 4-nitrophenol Hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza xác định đo hình thành 4-nitrophenol α-glucosidaza sau phản ứng với 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (4-PNP) Phương pháp 2: tiến hành theo phương pháp Miwa cộng Nguyên lý Sucrose α-glucosidaza glucose + fructose Hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza xác định lượng glucose giải phóng kit thương mại (glucose test wako) sử dụng nguồn chất sucrose Đề tài lựa chọn phương pháp hóa chất dùng phương pháp dễ đặt mua Phương pháp phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza nghiên cứu tạo chế phẩm giống mốc khởi động cho lên men đậu tương - Đề tài sử dụng phương pháp vi sinh truyền thống để phân lập chủng nấm mốc - Tuyển chọn số chủng nấm mốc có hoạt tính kìm hãm α-glucosidaza theo phương pháp Yamaki and Mori - Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định tên chủng nấm mốc tuyển chọn phương pháp khuyến đại đoạn ADN chứa vùng ITS1 - 5,8S- ITS2 - Sử dụng phương pháp vi sinh để xác định thành phần, độ ẩm môi trường, tỷ lệ giống mốc, nhiệt độ, thời gian thích hợp cho tạo chế phẩm giống mốc khởi động trì số lượng bào tử hoạt lực cao, ổn định Phương pháp nghiên cứu công nghệ lên men đậu tương tạo chất kìm hãm α glucosidaza - Sử dụng phương pháp xử lý nguyên liệu lên men bề mặt chủng nấm mốc theo phương pháp Jing Chen cộng - Xử lý số liệu theo phương pháp toán học thống kê phần mềm ANOVA - Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chất kìm hãm α-glucosidaza Phương pháp nghiên cứu tách chiết, thu nhận chất kìm hãm α-glucosidaza từ đậu tương lên men - Phương pháp tách chiết sử dụng dung môi phân cực thông dụng - Phương pháp thu nhận sử dụng phương pháp đại như: phương pháp sắc ký, sử dụng số dung môi hữu phân cực - Thăm dò số phương pháp sấy cho tạo chất kìm hãm α-glucosidaza dạng bột - Đánh giá chất kìm hãm α-glucosidaza sau bảo quản Phương pháp nghiên cứu công nghệ sản xuất thử chất kìm hãm α – glucosidaza quy mơ 50 kg nguyên liệu/mẻ ứng dụng cho sản xuất số thực phẩm chức - Sản xuất thử chất kìm hãm α- glucosidaza qui mô 50 kg nguyên liệu/mẻ ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức dựa kết nghiên cứu nội dung - Sản xuất 20 kg chất kìm hãm α – glucosidaza dựa quy trình cơng nghệ đạt - Đánh giá ảnh hưởng chất kìm hãm α-glucosidaza đến số enzym tiêu hóa như: trypsin, chymotrypsin, pepsin, lipaza phương pháp thử kìm hãm enzym - Lựa chọn phụ gia thích hợp sử dụng thực phẩm chức để tạo sản phẩm chứa chất kìm hãm α - glucosidaza - Đánh giá tính ổn định sản phẩm sau bảo quản Phương pháp thử hoạt tính chất kìm hãm α-glucosidaza Xây dựng tiêu chuẩn sở công bố chất lượng sản phẩm Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm - Bộ Y tế - Đánh giá chất lượng tính an tồn sản phẩm: sử dụng phương pháp vi sinh, hóa sinh để đánh giá sản phẩm, cụ thể là: o Xác định đạm toàn phần phương pháp Kjelhdan o Xác định hàm lượng chất béo phương pháp Sochlex o Xác định hàm lượng hydratcacbon theo phương pháp Betrand o Phương pháp xác định giá trị IC50 theo Rammohan S., 2008 o Phương pháp đánh giá cảm quan: theo tiêu chuẩn Việt Nam 3215-79 o Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 4884:2005, tổng số nấm men, nấm mốc theo TCVN 5166-90, E Coli theo TCVN 6846-2001, Coliforms theo TCVN 4882:2001, B cereus theo TCVN 4992:2005, C perfringens theo TCVN 4991-2005 o Xác định độc tố aflatoxin theo TCVN 6685 : 2000 (ISO 14501 : 1998) AOAC o Xác định độc tính cấp sản phẩm theo phương pháp Đỗ Trung Đàm (theo định 371 BYT/QĐ Bộ Y tế): đánh giá số LD động vật o Xác định độc tính bán trường diễn sản phẩm theo hướng dẫn khảo sát độc tính thuốc (quyết định 371 BYT/QĐ Bộ Y tế) o Thử hiệu giảm đường huyết sản phẩm động vật gây đái tháo đường alloxan monohydrat o Phương pháp thử nghiệm lâm sàng: thử nghiệm 30- 40 bệnh nhân tiểu đường Cho đối tượng dùng sản phẩm theo dõi chế độ ăn, biểu sức khỏe đối tượng suốt trình can thiệp Đánh giá tình trạng trước sau dùng sản phẩm Đánh giá số đường huyết, số chức gan, thận (GOT, GPT, Ure ), số chức mỡ máu (Cholesterol, triglycerit, HDL- Cholesterol, LDL- Cholesterol) trước sau dùng sản phẩm - Xây dựng tiêu chuẩn sở cho sản phẩm thực phẩm chức hỗ trợ làm giảm lượng đường máu - Công bố chất lượng Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm - Bộ Y tế TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đặng Hồng Ánh cộng sự, 2007 Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột dâu tằm giàu 1-deoxynojirimicin (DNJ) ứng dụng số sản phẩm đồ uống chức cho người bệnh tiểu đường Báo cáo khoa học Trần Liên Hà, 2006 Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thực phẩm chức từ vi khuẩn Bacillus subtilis Đề tài Bộ giáo dục đào tạo Trương Hương Lan cộng (2005 - 2007) Nghiên cứu công nghệ sản xuất thức ăn từ nơng sản có tác dụng giảm hàm lượng đường máu Báo cáo khoa học Viện Công nghiệp thực phẩm Nguyễn Thiện Luân, Lê Doãn Diên, Phan Quốc Kinh (1997) Các loại thực phẩm thuốc thực phẩm chức Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thiện Luân, Lê Doãn Diên, Phan Quốc Kinh (2001) Các chất bổ sung dinh dưỡng, ngành khoa học công nghệ kỷ 21 Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Nguyện, Nguyễn Hương Trà, Nguyễn Hồng Hà, (2007) Nghiên cứu thăm dò công nghệ chiết xuất chất touchi từ đậu tương lên men Báo cáo khoa học Viện Cơ điện NN Công nghệ STH Bùi Kim Thúy, 2008 Nghiên cứu công nghệ sản xuất fructooligosaccharides làm thực phẩm chức Báo cáo khoa học Viện Cơ điện NN Công nghệ STH Nguyễn Thị Hoài Trâm, 2007 Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức bổ sung từ vi sinh vật Thuyết minh đề tài Trịnh Thị Kim Vân, 2009 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym để sản xuất sử dụng đường chức xylooligosaccharit từ phế phụ phẩm giàu xylan Đề tài cấp nhà nước mã số KC.04.17/06-10 Tài liệu tiếng anh 10 Application for the approval of touchi extract under regulation (EC) No 258/97 of the european parliament and of the council of 27 january 1997 concerning novel foods and novel food ingredients.CBC Co., Ltd July 3, 2008 11 Barbesgaard P, Heldt-Hansen HP, Diderichsen B (1992) On the safety of Aspergillus oryzae: a review Appl Microbiol Biotechnol 36: 569–572 12 Dong Wang, Li-jun Wang, Feng-xue Zhu, Ji-ye Zhu, (2008) In vitro and in vivo studies on the antioxidant activities of the aqueous extracts of Douchi (a traditional Chinese salt-fermented soybean food) Food Chemistry 107, 1421–1428 13 Falk Anne, Kaspar Kala, (2006) Methods of use and nutrittional compositions of touchi extract Patent No WO 2007/140230 A2 14 Fujita H, Yamagami T (2007) Absence of mutagenicity, genotoxicity, and subchronic oral toxicity of touchi extract International Journal of Toxicology 2007, 26:465-473 15 Fujita Hiroyukia, Yamagami Tomohidea, Ohshima Kazunorib, (2001) Efficacy and safety of Touchi Extract, an α-glucosidaza inhibitor derived from fermented soybeans, in non-insulin-dependent diabetic mellitus Journal of Nutritional Biochemistry 12, 351–356 16 Hiroyuki Fujita, Tomohide Yamagami, (2001) Fermented soybean-derived Touchiextract with anti-diabetic effect via α-glucosidaza inhibitory action in a long-term administration study with KKAy mice Life Sciences 70, 219–227 17 Hiroyuki Fujita, Tomohide Yamagami and Kazunori Ohshima, (2000) Fermented Soybean–Derived Water- Soluble Touchi Extract Inhibits α- Glucosidase and Is Antiglycemic in Rats and Humans after Single Oral Treatments The journal of nutrittion, 1211-1213 18 Hiroyuki Fujita, Tomohide Yamagami and Kazunori Ohshima, (2001) Long-Term Ingestion of a Fermented Soybean-Derived Touchi-Extract with α-glucosidaza Inhibitory Activity Is Safe and Effective in Humans with Borderline and Mild Type-2 Diabetes The journal of nutrittion, 2105-2108 19 Hiroyuki Fujitaa, Tomohide Yamagamia, Kazunori Ohshima, (2003) Long-term ingestion of Touchi-extract, an α - glucosidazainhibitor, by borderline and mild type-2 diabetic subjects is safe and significantly reduces blood glucose levels Nutrition Research 23, 713–722 20 Hiroyuki Fujitaa,T, Tomohide Yamagamia, Kazunori Ohshima, (2005) Effect of Touchi extract on blood lipids in hypertriglyceridemic subjects and SpragueDawley rats Nutrition Research 25, 681–692 21 Japan Food Research Laboratories Test of Touchi Extract for Acute Oral Toxicity in Mice Report No 299090340-005[2000] Japan Food Research Laboratories, Tokyo, Japan 22 Jian-Hua Zhang, Eizo Tatsumi, Chang-He Ding, Li-Te Li, (2006) Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides in douchi, a Chinese traditional fermented soybean product Food Chemistry 98, 551–557 23 Jing Chen, Yong-Qiang Cheng, Kohji Yamaki, Li-Te Li, (2007) Anti-αglucosidaza activity of Chinese traditionally fermented soybean (douchi) Food Chemistry 103, 1091–1096 24 Kawabata, Takanori Kasai, Hiroyuki Fujita, (2001) Extract of touchi containing an α-glucosidaza inhibitor Patent No US 6,299,911 B1, date of Patent: Oct,9, 2001 25 Kawabata, Jun, (2000) Alpha- glucosidase inhibitor Patent No EP1 025 801 A1 26 Lotong N, (1985) Microbiology of fermented foods Elsevier, New York, pp 237– 270 27 Mary A Murray, Irvine CA, James B Rouft, Stanta Monica CA, (2004) Nutritional supplement containing alpha- glucosidase and alpha - amylase inhibitors Patent No: US 2004/0091554 A1 28 Nilubon Jong-Anurakkun, Megh Raj Bhandari, Jun Kawabata, (2007).αglucosidaza inhibitors from Devil tree (Alstonia scholaris) Food Chemistry 103, 1319–1323 29 Nippon Supplement Inc Research and Development Department Safety Test of Touchi Extract after Bolus Administration in Healthy Subjects Nippon Supplement Inc Research and Development Department, Osaka, Japan; 1999 30 Shin-ichi Sugiyama, (1984) Selection of micro-organisms for use in the fermentation of soy sauce Food Microbiology, 1, 339- 347 31 Wang L.j, Yin L.j, Li D, Zou L, Masayoshi Saito Eizo Tatsumi, et al (2007) Influences of processing and NaCl supplementation on isoflavone contents and composition during douchi manufacturing Food Chemistry, 101(3), 1247–1253 32 Yu-chi Chen, Yasumasa Sugiyama, Naoki Abe, (2005) DPPH RadicalScavenging Compounds from Touchi Douchi, a soybean Fermented Food Biosci Biotechnol Biochem, 69 (5), 999-1006 33 Yun-Ping Zhu, Li-Jun Yin, Yong-Qiang Cheng, Kohji Yamaki, (2008) Effects of sources of carbon and nitrogen on production of α -glucosidase inhibitor by a newly isolated strain of Bacillus subtilis B2 Food Chemistry 109, 737–742 34 Zhu Y P, Fan J.F, Cheng Y.Q & Li L.T (2008) Improvement of the antioxidant activity of Chinese traditional fermented okara (Meitauza) using Bacillus subtilis B2 Food Control, 19, 654–661 ... khỏe người sống đại Thực phẩm chức phân thành nhiều nhóm, phụ thuộc tác dụng sản phẩm thực phẩm chức cho người có đường huyết cao, thực phẩm chức cho người có cholesterol máu cao, thực phẩm chức. .. trypsin chymotrypsin Đó lý ăn thực phẩm từ đậu tương lên men không bị chướng bụng, đầy ăn sản phẩm từ đậu tương không lên men Những nghiên cứu nhiều năm trở lại cho thấy đậu tương có nhiều hoạt chất... Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột dâu tằm giàu 1-deoxynojirimicin (DNJ) ứng dụng số sản phẩm đồ uống chức cho người bệnh tiểu đường Báo cáo khoa học Trần Liên Hà, 2006 Nghiên cứu công nghệ sản xuất