ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Vũ Thanh Trà NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : 1. PGS.TS. Chu Hoàng Mậu 2. TS. Trần Thị Phương Liên Thái Nguyên - 2012 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực. Một số kết quả đã được công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận án Vũ Thanh Trà ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Trần Thị Phương Liên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nông Văn Hải và các cán bộ Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học, TS. Nguyễn Thị Bình, ThS.NCVC Nguyễn Thị Thanh Tuyết và các cán bộ Bộ môn Miễn dịch Thực vật - Viện Bảo vệ Thực vật, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn gia đình và những người thân đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm nghiên cứu sinh. Công trình được thực hiện và hoàn thành với việc sử dụng các trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Hóa sinh protein, Phòng Công nghệ tế bào thực vật (Viện Công nghệ Sinh học); Phòng thí nghiệm Di truyền học, Phòng thí nghiệm Công nghệ gen (Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên). iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các từ viết tắt v Danh mục các bảng vii Danh mục các hình viii MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Cây đậu tương và và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương 1.1.1. Cây đậu tương 1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương 1.2. Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 9 1.2.2. Tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương 1.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền ở cây đậu tương 1.3.1. Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái 1.3.2. Phương pháp sử dụng chỉ thị hoá sinh học 1.3.3. Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA 1.4. Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 1.5. Các nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Vật liệu 33 2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh 2.1.2. Hóa chất 2.1.3. Máy mọc và thiết bị 2.1.4. Mồi của phản ứng RAPD và SSR 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo 4459 1111 2 223333 44 iv 2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa sinh 2.2.3. Các phương pháp phân tích đa hình di truyền DNA 2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương nghiên cứu 3.2. Phân tích đặc điể̉m hóa sinh hạt của các giống đậu tương nghiên cứu 58 3.2.1. Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipid trong các hạt của các giống đậu tương nghiên cứu 3.2.2. Phân tích tính hàm lượng và thành phần amino acid trong hạt của một số giống đậu tương 3.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt 64 3.3.1. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử RAPD 3.3.2. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉ thị phân tử SSR 3.4. Phân tích tính đa hình protein lá của một số giống đậu tương phản ứng khác nhau vớ́i bệnh gỉ sắt 3.4.1. Kết quả phân tích sự đa hình protein ở lá của một số giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE 3.4.2. Lập bản đồ hệ protein của lá đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều 3.4.3. Nghiên cứu tính đa hình protein của các giống đậu tương bằng kỹ thuật điện di hai chiều KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99 1. Kết luận 99 2. Đề nghị 100 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 4 4 455 667 77 79 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µl 2DE AFLP APS AUDPC Microliter Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều Amplified fragment length polymorphism - Đa dạng chiều dài các phân đoạn được nhân bản Ammonium persulfate Area Under Disease Progress Curve Avr protein Avirulence protein – Protein không nhiễm bệnh từ mầm bệnh AVRDC Bp CHAPS Cm CTAB DNA dNTPs DTT EDTA ESI-Q TRAP EtBr HPLC IAA IEF IMA INTSOY IPG IRRI Kb Asian Vegetable Research Devlopment Center -Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan Base pair 3-[(3- Cholamidoppropyl)dimethylammonio] Centimeter Cetylmethylammonium bromide Deoxyribonucleic acid Deoxynucleotide Triphosphates Dithiothreitol Ethylendiamine tetra acetic acid Elecspray ionization Q Trap - Phương pháp khối phổ sử dụng tính năng bẫy ion kết hợp nguồn ion hóa bằng cách phun chùm điện tử Ethidium bromide High-performance liquid chromatography-Sắc ký lỏng hiệu năng cao Indole-3-acetamide Isoelectric Focusing – Phương pháp điện di theo điểm đẳng điện Institute of Tropical Agriculture -Viện Nông nghiệp nhiệt đới, Nigeria International Soybean Program -Chương trình nghiên cứu đậu tương Quốc tế, Hoa Kỳ Immobile pH gradient - Dải gradient pH cố định International Rice Research Institute- Viện nghiên cứu lúa quốc tế, Philippin Kilo base vi kDa mA MAS ml MS/MS NST OD PCR PEG PIC PMSF PR protein QTL R gen R protein RAPD RFLP RNA SAR SDS SDS- PAGE SSR TAE TCA TEMED UPGMA V w/v Kilo Dalton MiliAmpe Marker Assisted Selection -Chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử Mililiter Mass spectrometry/ Mass spectrometry - khối phổ liên tục Nhiễm sắc thể Optical Density - Mật độ quang học Polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase Polyethylene glycol Polymorphic Information Content-Hàm lượng thông tin đa hình Phenylmethanesulphonylfluoride Pathogenesis-related protein - protein liên quan đến mầm gây bệnh. Quantitative Trait Loci- Các locus tính trạng số lượng Resistant gen – gen kháng bệnh Resistant protein - protein kháng bệnh Ramdom amplified polymorphism DNA - DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên Restriction fragment length polymorphism - đa hình về chiều dài phân đoạn cắt hạn chế Ribonucleic acid Systemic acquired resistance – Sự kháng bệnh có hệ thống Sodium dodecyl sulfate SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis -Điện di biến tính trên gel polyacrylamide có SDS Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản Tris acetate EDTA Trichloracetic acid N,N,N’,N’ Tetramethylethylenediamine Phương pháp phân nhóm Volt Weight/volume vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 20 mồi RAPD Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi SSR Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide Bảng 3.1. Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipit trong hạt của 50 giống đậu tương Bảng 3.3. Thành phần của các amino acid của 20 giống đậu tương Bảng 3.4. Tỷ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu Bảng 3.5. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR Bảng 3.6. Danh sách các protein của lá đậu tương giống DT2000 được nhận diện bằng phương pháp khối phổ Bảng 3.7. Đa dạng mức độ biểu hiện của các protein giữa mẫu thí nghiệm và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh (DT12 và VMK) Bảng 3.8. Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác nhau giữa thí nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh DT12 và VMK Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh gỉ sắt mẫn cảm với bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và giống kháng (DT2000, CBU8325) Bảng 3.10. Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm với và giống kháng bệnh gỉ sắt 3 334455 6 6 7 8 9 99 9 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình 1.2. Hình 1.3. Hình 1.4. Hình 2.1. Hình 2.2. Hình 3.1. Hình 3.2. Hình 3.3. Hình 3.4. Hình 3.5. Hình 3.6. Hình 3.7. Mặt sau lá đậu tương bị nhiễm bệnh gỉ sắt (A) và hình ảnh bào tử nấm gỉ sắt với độ phóng đại 400 lần (A) Hình ảnh nấm gây bệnh gỉ sắt ở đậu tương P. pachyrhizi chụp dưới kính hiển vi điện tử Mô hình hoạt động của protein kháng bệnh ở nấm Sơ đồ phân tách protein bằng diện di 2DE Hình ảnh cây thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry Lá của các giống đậu tương với 3 mức độ phản ứng với bệnh gỉ sắt Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18 Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân nhóm UPGMA Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C) Satt 005 (D) của 50 giống đậu tương Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR Hình ảnh điện di SDS-PAGE 12,5% của protein chiết từ lá đậu tương VMK, CBU8325 đối chứng và nhiễm bệnh ở hai giống đậu tương DT12 và VMK 9 ngày tuổi 1111445666777 [...]... sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau 2 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Đánh giá được khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh gỉ sắt nhằm phát hiện các giống kháng và nhiễm mới 2.2 Xác định được sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA của các giống đậu tương nghiên cứu 3 2.3 So sánh đa hình protein, lập được bản đồ điện di protein lá đậu tương, sơ bộ... bệnh gỉ sắt cũng như cơ chế phân tử của hiện tượng này Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng cao Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự đa dạng di. .. đặc trưng về protein giữa giống kháng và giống nhiễm 3 Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương - Xác định hàm lượng protein, lipid và thành phần amino acid trong hạt của các giống đậu tương nghiên cứu - Phân tích sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử RAPD và SSR - Lập bản đồ điện di protein lá đậu tương và định danh hệ protein... gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá trình phát triển bệnh, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tích phản ứng bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt cũng như đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương có khả năng kháng. .. tôi mong muốn nghiên cứu tìm hiểu và lập bản đồ hệ protein của lá đậu tương, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo 1.2 Bệnh gỉ sắt và tính kháng bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương 1.2.1 Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng kể về năng suất ở các nước trồng đậu tương Hầu hết... giống cây có năng suất cao, có khả năng chống chịu bệnh để đưa vào sản xuất mở rộng di n tích gieo trồng và nâng cao chất lượng hạt, đáp ứng được nhu cầu đậu tương trong nước cũng như phục vụ xuất khẩu Do đó, nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương mới có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao là một giải pháp mang tính chiến lược cho sự phát triển bền vững Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ. .. gen kháng bệnh và các hệ thống bảo vệ là rất phức tạp do có sự tham gia của nhiều gen khác nhau Một số nghiên cứu sàng lọc giống đã được tiến hành để phát hiện các giống đậu tương có khả năng kháng/ chống chịu với nấm gây bệnh P pachyrhizi [58], [79] Các nghiên cứu về gen cho thấy năm gen Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 và Rpp5 đã được phát hiện và mô tả là có khả năng liên quan đến tính kháng đối với một số. .. phương pháp điện di một chiều, hai chiều và nhận di n protein trên hệ sắc ký-khối phổ Đồng thời phân tích, so sánh sự đa dạng thành phần protein lá của một số giống đậu tương nhiễm và kháng bệnh gỉ sắt 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây đậu tương và đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương 1.1.1 Cây đậu tương Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây thuộc họ đậu (Fabaceae) Chi Glycine có hai chi phụ... nhiên chưa có một giống đậu tương nào có phổ kháng rộng với tất cả các chủng nấm P pachyrhizi và hiện nay phần lớn các giống đậu trên thị trường được trồng ở Mỹ đều khá mẫn cảm với bệnh gỉ sắt [102] 1.2.2.2 Tính kháng một phần bệnh gỉ sắt ở đậu tương Các dòng mang tính kháng một phần hoặc các dòng chậm bị bệnh gỉ sắt đã được xác định và mô tả dựa trên thời gian ủ bệnh và số lượng cụm bào tử hạ có trong... Chúng có thể do một hoặc một số gen trội quyết định và được di truyền cho thế hệ sau theo các quy luật di truyền cơ bản hoặc có thể là di truyền theo qui luật tương tác đa gen Ví dụ, trong 3 cặp lai (UPSL 13 x Brogg, UPSL 85 x Harelec, UPSL - 3 x Clacrk 63), các giống làm mẹ là những giống kháng cả bệnh gỉ sắt và bệnh virus gây vàng lá, các giống làm bố là các giống năng suất cao và mẫn cảm với bệnh Sự . cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau . 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Đánh giá được khả năng phản ứng của các giống đậu tương với bệnh gỉ sắt. trong hạt của một số giống đậu tương 3.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt 64 3.3.1. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng. NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Vũ Thanh Trà NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ