i CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho Thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm và TS. Nguyễn Văn Duy - Phó Giám đốc - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin cám ơn quý Thầy Cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm và Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua. Xin cám ơn các Thầy Cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. iii MỤC LỤC CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 4 1.1.1. Vi khuẩn lactic 4 1.1.2. Bacteriocin 9 1.1.3. Cá giò 13 1.1.4. Các biến đổi của cá sau khi chết 16 1.1.5. Các nguyên tắc bảo quản thực phẩm 21 1.1.6. Một số phương pháp bảo quản nguyên liệu thủy sản 24 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ VI SINH VẬT ĐỂ BẢO QUẢN NGUYÊN LIỆU 30 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 30 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 33 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1. VẬT LIỆU 36 2.1.1. Mẫu cá giò 36 2.1.2. Chủng vi khuẩn lactic T8 36 2.1.3. Chủng vi khuẩn chỉ thị 36 2.1.4. Thiết bị chuyên dụng 37 2.1.5. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 37 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.2.1. Hoạt hóa và nuôi cấy các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 39 2.2.2. Thu nhận dịch bacteriocin thô 40 2.2.3. Xác định hoạt độ bacteriocin 40 iv 2.2.4. Xác định độ bền của bacteriocin 42 2.2.5. Đánh giá tác động của bacteriocin trên cá giò trong quá trình bảo quản 44 2.2.6. Đánh giá sự biến đổi hoạt tính của dịch bacteriocin thô sau quá trình bảo quản cá giò 49 2.2.7. Xây dựng quy trình công nghệ bảo quản cá giò tươi nguyên liệu bằng bacteriocin 49 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 50 3.1. Thu nhận dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic T8 50 3.2. Xác định phổ ức chế vi sinh vật của dịch bacteriocin thô thu được 51 3.3. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô từ chủng lactic T8 53 3.3.1. Độ bền của bacteriocin với enzyme protease 53 3.3.2. Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô 55 3.3.3. Độ bền pH của dịch bacteriocin thô 56 3.4. Đánh giá tác động của dịch bacteriocin thô trên cá giò nguyên liệu tươi trong quá trình bảo quản 57 3.4.1. Tác động của dịch bacteriocin thô lên chỉ tiêu cảm quan của cá giò tươi 57 3.4.2. Tác động của dịch bacteriocin thô lên chỉ tiêu hóa học 59 3.4.3. Tác động của dịch bacteriocin thô lên chỉ tiêu vi sinh vật của cá giò tươi 61 3.5. Đánh giá sự biến đổi của dịch bacteriocin thô sau quá trình bảo quản cá giò 64 3.6. Xây dựng quy trình công nghệ bảo quản cá giò tươi nguyên liệu bằng dịch bacteriocin thô 74 3.6.1. Cơ sở xây dựng quy trình bảo quản cá giò tươi nguyên liệu 74 3.6.2. Quy trình bảo quản cá giò tươi nguyên liệu 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 1. KẾT LUẬN 77 2. KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN 88 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng phân loại bacteriocin 11 Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100 gram cá giò nguyên liệu 16 Bảng 3.1. Đường kính vòng kháng của dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic T8 với các vi khuẩn đích 51 Bảng 3.2. Đường kính vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T8 sau khi xử lý nhiệt và pH 55 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính của dịch bacteriocin thô sau thời gian bảo quản cá giò 64 Bảng 3.4. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò tươi nguyên con 67 Bảng 3.5. Tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 73 vi DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình ảnh tế bào của một số chủng vi khuẩn lactic 5 Hình 1.2. Cấu trúc của colicin – Một loại bacteriocin từ E. coli 9 Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin từ vi khuẩn lactic (LAB) 11 Hình 1.4. Cá giò 14 Hình 2.1. Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic T8 trên môi trường MRS 36 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình hoạt hóa và nuôi cấy vi khuẩn 39 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá chất lượng cá giò trước và sau khi bảo quản bằng dịch bacteriocin thô 46 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xây dựng quy trình bảo quản cá giò 49 Hình 3.1. Mối quan hệ giữa khả năng sinh trưởng tính theo mật độ quang và khả năng sinh bacteriocin tính theo đường kính vòng kháng khuẩn của chủng T8 nuôi trên môi trường MRS 50 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic T8 52 Hình 3.3. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng vi khuẩn T8 với enzym proteinase K trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1. 53 Hình 3.4. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng vi khuẩn T8 với enzym α- chymotrypsin trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1 54 Hình 3.5. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T8 sau khi xử lý các nhiệt độ khác nhau. 55 Hình 3.6. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T8 sau khi xử lý ở pH 2-12 56 Hình 3.7. Biểu đồ so sánh điểm cảm quan của mẫu cá giò nhúng dịch bacteriocin 57 Hình 3.8. Biểu đồ so sánh độ cứng tương đối của mẫu cá giò nguyên con bảo quản bằng bacteriocin và mẫu đối chứng 58 Hình 3.9. Biểu đồ so sánh độ cứng tương đối của mẫu da cá giò bảo quản bằng bacteriocin và mẫu đối chứng 59 Hình 3.10. Đồ thị so sánh hàm lượng protein của mẫu cá giò nhúng dịch. 59 Hình 3.11. Đồ thị so sánh hàm lượng NH 3 của mẫu cá giò nhúng dịch bacteriocin 60 vii Hình 3.12. Khuẩn lạc Vibrio mọc trên môi trường TCBS từ các mẫu cá giò có nhúng dịch bacteriocin thô 61 Hình 3.13. Khuẩn lạc Vibrio mọc trên môi trường TCBS từ các mẫu cá giò đối chứng 62 Hình 3.14. Đồ thị so sánh sự gia tăng mật độ tế bào tương đối của mẫu cá giò nhúng dịch bacteriocin. 63 Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn hoạt độ dịch bacteriocin thô trong quá trình bảo quản cá giò nguyên liệu tươi 64 Hình 3.16. Khả năng kháng Bacillus của dịch bacteriocin theo thời gian bảo quản 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày 65 Hình 3.17. Hình ảnh vòng kháng vi khuẩn Vibrio của dịch bacteriocin thô dùng bảo quản cá giò sau 3, 5, 7 ngày 66 Hình 3.18. Tổng vi khuẩn lactic trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 67 Hình 3.19. Khuẩn lạc vi khuẩn lactic của mẫu đối chứng (A) và mẫu bảo quản bằng dịch bacteriocin thô (B) sau 3 ngày 68 Hình 3.20. Khuẩn lạc vi khuẩn lactic của mẫu đối chứng (A) và mẫu bảo quản bằng dịch bacteriocin thô (B) sau 5 ngày 69 Hình 3.21. Khuẩn lạc vi khuẩn lactic của mẫu đối chứng (A) và mẫu bảo quản bằng dịch bacteriocin thô (B) sau 7 ngày 70 Hình 3.22. Tổng vi khuẩn hiếu khí của mẫu đối chứng (A) và mẫu nhúng dịch bacteriocin thô (B) tại thời điểm bắt đầu bảo quản (0 ngày) 72 Hình 3.23. Tổng vi khuẩn hiếu khí của mẫu đối chứng (A) và mẫu nhúng dịch bacteriocin thô (B) sau 5 ngày bảo quản 72 Hình 3.24. Tổng vi khuẩn hiếu khí của mẫu đối chứng (A) và mẫu nhúng dịch bacteriocin thô (B) sau 5 ngày bảo quản 72 Hình 3.25. Tổng vi khuẩn hiếu khí của mẫu đối chứng (A) và mẫu nhúng dịch bacteriocin thô (B) sau 7 ngày bảo quản 73 Hình 3.26. Biểu đồ so sánh tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 73 Hình 3.27. Sơ đồ quy trình bảo quản cá giò tươi nguyên liệu bằng dịch bacteriocin từ vi khuẩn lactic T8 75 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Cfu Colony Forming Units (đơn vị hình thành khuẩn lạc) DNA Deoxyribonucleic acid (axit Deoxyribonucleic) EMP Embden – Mayerhorf – Parnas LAB Lactic Acid Bacteria (vi khuẩn lactic) MAP Modified Atmosphere Packaging (phương pháp bao gói có điều chỉnh khí quyển) MRS De Man, Rogosa, Sharpe PE Poly Ethylen RNA Ribonucleic acid (axit Ribonucleic) RV Rappaport Vassiliadis TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TSA Tryptone Soya Agar TSB Trypton Soy Broth XLD Xylose Lysine Desoxycholate Agar 1 MỞ ĐẦU Trong các năm qua, ngành thuỷ sản Việt Nam đã có những bước phát triển mạnh mẽ và trở thành một ngành có kim ngạch xuất khẩu xếp hàng thứ ba ở Việt Nam, chỉ sau Dầu khí và Dệt may. Kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam năm 2005 đạt mức 2,6 tỷ USD, năm 2007 là 3,752 tỷ USD, năm 2009 là 4,251 tỷ USD và năm 2010 là gần 5 tỷ USD. Tuy thế, nguyên liệu thủy sản sau thu hoạch chủ yếu chỉ được bảo quản bằng các phương pháp truyền thống như ướp đá, ướp muối, đông lạnh …Đặc điểm mau ươn hỏng, nhanh giảm chất lượng của nguyên liệu thủy sản và mong muốn kéo dài thời gian bảo quản đã khiến cho nhiều ngư dân sử dụng các hóa chất như borat (hàn the), urea … để bảo quản nguyên liệu thủy sản gây mất an toàn thực phẩm và ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học là phải tìm ra một giải pháp bảo quản thích hợp, tiện lợi để hỗ trợ cho người dân thay thế cho các phương pháp bảo quản bằng các phụ gia độc hại hiện đang được người dân sử dụng một cách lén lút. Nhiều nghiên cứu hiện nay cho thấy có nhiều chất sinh học - có nguồn gốc từ tự nhiên có khả năng ức khuẩn nên có thể sử dụng trong bảo quản khá tốt, không độc hại với người tiêu dùng và được xem như là phương pháp tiềm năng, có nhiều lợi thế. Theo hướng sử dụng các hoạt chất sinh học, sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong bảo quản được xem là có nhiều ưu điểm nổi bật về tính an toàn và hiệu quả bảo quản thực phẩm, nhất là đối với các thực phẩm thủy sản tươi sống [21], [39], [40]. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic nhằm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi” với mong muốn thử nghiệm chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, không độc hại trong bảo quản nguyên liệu thủy sản. Trên cơ sở đó phát triển hướng ứng dụng này trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm thủy sản vì sự phát triển an toàn, bền vững của cộng đồng. Mục tiêu của đề tài: Thu nhận dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic, khảo sát các đặc tính của dịch bacteriocin làm cơ sở cho việc sử dụng trong bảo quản cá giò nguyên liệu tươi. 2 Nội dung của đề tài: đề tài có một số nội dung chủ yếu sau 1) Thu nhận dịch bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic. 2) Xác định hoạt độ, phổ ức chế vi sinh vật của dịch bacteriocin thô. 3) Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin thô (pH, nhiệt độ, enzyme). 4) Đánh giá tác động bảo quản của dịch bacteriocin thô trên cá giò trong quá trình bảo quản (chất lượng cảm quan, thành phần hóa học, các chỉ tiêu vi sinh vật). 5) Đánh giá sự biến đổi của dịch bacteriocin thô sau khi bảo quản cá giò nguyên liệu tươi. 6) Xây dựng quy trình công nghệ bảo quản cá giò tươi nguyên liệu bằng dịch bacteriocin thô. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Đề tài lần đầu thu nhận bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic nuôi tại phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang và thử nghiệm sử dụng bacteriocin trong bảo quản cá giò nguyên liệu. Vì vậy kết quả nghiên cứu của đề tài là nguồn dẫn liệu khoa học về việc sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong bảo quản cá giò nguyên liệu, làm cơ sở cho các nghiên cứu để xây dựng quy trình công nghệ bảo quản cá giò bằng bacteriocin thô từ vi khuẩn lactic cũng như các nghiên cứu bảo quản nguyên liệu thủy sản khác. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở để các doanh nghiệp thủy sản sử dụng phương pháp mới trong bảo quản nguyên liệu thủy sản tươi bằng cách dùng bacteriocin - chất bảo quản sinh học an toàn với người sử dụng trong bảo quản nguồn nguyên liệu thủy sản tươi tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là cơ sở để các cơ quan quản lý thủy sản khuyến cáo người dân sử dụng các chất bảo quản mới, có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại thay thế cho các phụ gia bảo quản độc hại trong bảo quản nguyên [...]... 79, 80, 81] Tuy nhiên tại Vi t Nam hầu như chưa có những nghiên cứu đầy đủ về vi c sử dụng các chất bảo quản có nguồn gốc sinh học để bảo quản thực phẩm, đặc biệt là thủy sản – loại nguyên liệu rất dễ bị hư hỏng khi bảo quản không đúng cách Trước tình hình đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic ứng dụng trong bảo quản cá giò nguyên liệu tươi 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN... sữa, sau đó tiếp tục cho lên men lactic với nồng độ muối loãng Tùy loại phomat mà trong quá trình ủ chín người ta sử dụng các loài vi sinh vật khác nhau Các loại vi sinh vật thường được sử dụng để làm chín phomat là vi khuẩn propionic, nấm mốc… Vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong vi c muối chua rau quả Muối chua rau quả nhằm hai mục đích cơ bản: bảo quản nguyên liệu và làm tăng giá trị dinh dưỡng,... động của bacteriocin từ vi khuẩn lactic (LAB) 12 b) Đặc điểm sinh học của bacteriocin Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong bảo quản thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là sử dụng một số protein của vi khuẩn làm thuốc kháng sinh Trong số đó, bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã và đang được quan tâm nhiều hơn cả Bacteriocin có bản chất là peptide kháng khuẩn, được... chút các vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn đường ruột nhưng vẫn tương tự như hệ vi sinh vật ở cá ôn đới  Sự xâm nhập của vi sinh vật: Thịt của cá sống khỏe mạnh hoặc cá vừa đánh bắt là vô trùng vì hệ thống miễn dịch của cá ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn trong thịt cá Khi cá chết, hệ thống miễn dịch bị suy giảm và vi khuẩn được tự do sinh sôi phát triển Trên bề mặt da, vi khuẩn định cư phần lớn ở các... ổn dịnh, dễ hòa tan trong nước, không làm cho nguyên liệu biến mùi, không làm mục dụng cụ bảo quản, phải có hiệu lực sát trùng mạnh, giá thành hạ và cách sử dụng đơn giản Các hóa chất thường được dùng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản: Muối vô cơ, acid chất hữu cơ Tùy từng loại hóa chất mà có cách sử dụng khac nhau: 27  Muối vô cơ Bảo quản nguyên liệu bằng muối vô cơ như: Calcium hypochlorite (Ca(OCl)2),...3 liệu thủy sản tươi nhằm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Kết quả nghiên cứu của đề tài nếu được áp dụng sẽ góp phần làm giảm thiểu vi c ngộ độc thực phẩm thủy sản do sử dụng các chất độc hại trong bảo quản Tính mới của đề tài Hiện nay, phần lớn các loại thực phẩm bảo quản bằng các chất bảo quản hóa học được cho là có ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người sử dụng [13], [39] Vấn... acetic và axit lactic Các vi khuẩn lên men lactic trong thực phẩm chủ yếu là vi khuẩn lên men lactic dị hình Phương trình tạo thành axit lactic: C6H12O6 —> CH3COOH + CO2 + C2H5COOH Đa số vi khuẩn lactic không thể tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình, chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ một số ít loài vi khuẩn lactic có... bằng cách chế thành nước đá hoặc pha thành dung dịch Nếu chế thành nước đá thì cứ một lớp đá rồi một lớp cá ướp, còn khi pha thành đung dịch ta ngâm cá nguyên liệu trong thời gian 2 ÷ 5 phút sau đó mang bảo quản lạnh  Acid Các loại acid thường dùng để bảo quản nguyên liệu thủy sản là: Acid boric (đã bị cấm sử dụng) , acid chlohytric, acid acetic, acid lactic Dùng acid để giữ tươi nguyên liệu có 3 cách:... tránh mọi va chạm, giữ cá được yên tĩnh [2] e Bảo quản cá nguyên liệu bằng chất kháng sinh Truớc đây, chất kháng sinh được phát triển và sử dụng rộng rãi trong bảo quản nguyên liệu Nhưng thời gian gần đây người ta phát hiện thấy chất kháng sinh có khả năng gây ra các phản ứng có hại cho người sử dụng, vì vậy nó được nghiên cứu sử dụng thận trọng hơn, thậm chí kháng sinh bị cấm sử dụng ở một số quốc gia... được sử dụng hạn chế trong bảo quản nguyên liệu tùy theo quy định của các nước Các chất hữu cơ thường dùng như: Acid dehydro acetic (DHA) và muối natri của nó…được sử dụng dưới dạng chế thành nước đá hoặc pha thành dung dịch c Bảo quản bằng cách dùng chất chống oxy hóa Trong quá trình bảo quản nguyên liệu cá và các sản phẩm thủy sản khác hay sinh ra sản phẩm ôi khét, ôi thối nguyên nhân là do hiện tượng . sánh tổng vi khuẩn hiếu khí trên cá giò nguyên liệu tươi nguyên con 73 Hình 3.27. Sơ đồ quy trình bảo quản cá giò tươi nguyên liệu bằng dịch bacteriocin từ vi khuẩn lactic T8 75 viii . nguồn dẫn liệu khoa học về vi c sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic trong bảo quản cá giò nguyên liệu, làm cơ sở cho các nghiên cứu để xây dựng quy trình công nghệ bảo quản cá giò bằng bacteriocin. sản tươi sống [21], [39], [40]. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài Thử nghiệm sử dụng bacteriocin từ vi khuẩn lactic nhằm bảo quản cá giò nguyên liệu tươi với mong muốn thử nghiệm