i SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía gia đình thầy cô và bạn bè. Nhờ đó mà tôi đã hoàn thành đồ án được như mong muốn, nay cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến: Trước hết là ThS. Lê Phương Chung, người trực tiếp hướng dẫn đề tài. Trong suốt thời gian thực hiện, thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quá trình làm đồ án và hoàn thành đồ án đúng định hướng ban đầu. Sau đó, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Văn Duy, Viện phó, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đồ án này. Đồng thời bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo môi trường thuận lợi, cung cấp đầy đủ thiết bị, dụng cụ cho tôi thực hiện đề tài một cách xuyên suốt. Sau cùng, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè, chị Nguyễn Minh Nhật, và các anh chị cao học. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Chúc tất cả mọi người sức khỏe thành đạt. ii SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT vi LỜI MỞ ĐẦU 2 Chƣơng I. TỔNG QUAN 4 1.1. Bacteriocin 4 1.1.1 Khái niệm 4 1.1.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin 4 1.1.3 Phân loại 6 1.1.4 Tính chất của bacteriocin 13 1.1.5 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 15 1.1.6 Sinh tổng hợp bacteriocin 16 1.2. Tôm hùm 19 1.2.1 Phân bố 20 1.2.2 Tập tính 20 1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng 21 1.2.4 Đặc điểm sinh sản 22 1.2.5 Giá trị của tôm hùm 22 1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của bacteriocin 23 Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Mẫu tôm hùm 28 2.1.3 Chủng chỉ thị 28 2.1.4 Môi trường hóa chất và thuốc thử 28 iii SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang 2.1.5 Thiết bị chuyên dụng 29 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật 32 2.2.2 Tuyển chọn chủng sinh bacteriocin 34 2.2.3 Xác định đặc điểm của chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 38 Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu tôm Hùm 44 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập 45 3.3 Xác định hoạt tính bacteriocin 47 3.4 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 48 3.5 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn 50 3.5.1 Khả năng chịu muối 50 3.5.2 Thử catalase 51 3.5.3 Tính di động 52 3.5.4 Khả năng sinh hơi 53 3.6 Định danh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử 53 Chƣơng IV : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54 4.1 Kết luận 54 4.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 58 iv SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại I 5 Bảng 1.2 : Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại II 6 Bảng 1.3: Phân loại bacteriocin theo Jack [16] 9 Bảng 1.4: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [20] 12 Bảng 1.5: Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn 14 Bảng 3.1: Chủng vi khuẩn phân lập được 44 Bảng 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn 46 Bảng 3.4: Khả năng chịu muối của N14 50 v SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc của nisin 7 Hình 1.2 : Cấu trúc sakacin P 10 Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của bacteriocin 16 Hình 1.4: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I 18 Hình 1.5: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II 19 Hình 1.6: Tôm hùm Bông 22 Hình 2.1: Quy trình thực hiện 31 Hình 2.2: Trình tự pha loãng 32 Hình 2.3: Quy trình thử tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với chủng chỉ thị 35 Hình 2.4: Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri 36 Hình 2.5 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính bacteriocin 37 Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định đặc điểm vi khuẩn 38 Hình 3.1: Các chủng vi khuẩn ở nồng độ 10 -3 44 Hình 3.2: Kết quả của 12 chủng nổi bật đối kháng với chủng Bacillus B1.1 45 Hình 3.3 : Thử nghiệm với enzyme proteinase K và α-chymotripsin 48 Hình 3.4 : Hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn N14 49 Hình 3.5 : Khả năng chịu muối của chủng N14 51 Hình 3.6 : Khả năng sinh catalase của N14 52 Hình 3.7 : Khả năng di động của chủng N14 52 Hình 3.8 : Khả năng sinh hơi của chủng N14 53 vi SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT STT Kí hiệu viết tắt Nghĩa 1 TSB Tryptone Soya Broth 2 TSA Tryptone Soya Agar 3 BC Bacterial Cellulose 4 LAB Lactic Acid Bacteria 5 ATP Adenosine Triphosphate 6 DNA Acid Deoxyribo Nucleic 7 HPK Histidine protein kinase 8 RR Response regulator 2 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang LỜI MỞ ĐẦU Vào thời kỳ khai sinh ra vi sinh học hiện đại ngày nay, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện ra chất kháng sinh. Từ thế kỷ 17, một thầy thuốc Hoàng gia Anh đã biết cách chữa bệnh bằng cách dùng rêu áp lên vết thương, hay dùng mẫu bánh mì để chữa trị thương tích. Đến những năm của thế kỷ 18, thuật ngữ ―chất kháng sinh‖ lần đầu tiên được Pasteur và Joubert sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh, và một số nhà khoa học khác đã phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của một vài chủng vi sinh vật. Vào năm 1929, khi Alexander Fleming tìm ra thuốc kháng sinh penicillin từ nấm Penicillium notanum, có khả năng ức chế vi khuẩn sự sinh trưởng của các loại vi khuẩn, được ứng dụng để chữa trị các bệnh nhiễm trùng trên phạm vi rộng. Việc tìm ra thuốc kháng sinh của Alexander Fleming đã mở ra bước ngoặc mới cho y học loài người. Chỉ với một số lượng rất nhỏ nhưng hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật của penicillin rất cao. Thuốc kháng sinh không chỉ được ứng dụng trong điều trị bệnh cho người, mà còn dùng điều trị bệnh cho vật nuôi, tăng trọng cho vật nuôi và cả trong bảo quản thực phẩm (như chlotetracycllin dùng để bảo quản thịt; tetracycline, oromycine… để bảo quản sản phẩm nhằm ngăn chặn quá trình thối rữa của thịt cá, tôm). Tuy nhiên do lạm dụng quá mức kháng sinh đã dẫn đến khả năng kháng thuốc ở vi sinh vật nên việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm cần phải đi theo một hướng mới, hiệu quả hơn. Không những thế, trong những năm gần đây, khi người tiêu dùng đã nhận thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối với sức khỏe và chuộng các loại thực phẩm chế biến không bổ sung chất bảo quản hóa học tổng hợp vì tính an toàn cho thực phẩm. Và từ yêu cầu cao về chất lượng, tính an toàn của thực phẩm từ phía người tiêu dùng cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về an toàn thực phẩm trong sản xuất, chế biến, bảo quản đã thúc đẩy nghiên cứu rộng rãi các chất có khả năng bảo quản thực phẩm có nguồn góc tự nhiên. 3 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang Xuất phát từ những yêu cầu đó, việc tiếp tục tìm ra những chất kháng khuẩn mới trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược và chăn nuôi, và trong công nghệ thực phẩm. Một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng bacteriocin, một nhóm các hợp chất có bản chất là peptide, nguồn gốc từ vi sinh vật và có khả năng kháng khuẩn mà không gây ra tác động kháng thuốc ở vi sinh vật. Ngoài ra, bacteriocin cũng không gây dị ứng cho con người, an toàn với sức khỏe. Đó là một sự lựa chọn được xem là có nhiều ưu điểm và hiệu quả nhất. Vì thế, tôi chọn tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập đƣợc từ tôm hùm ở Khánh Hòa ”, giúp làm phong phú thêm bộ sưu tập chủng vi sinh vật sinh chất kháng khuẩn, tạo ra nhiều sự lựa chọn cho việc tuyển chọn chủng, và hiểu được đặc tính của các chủng này để tăng khả năng sinh bacteriocin. Đề tài nhằm các mục đích chính sau đây: - Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng kháng khuẩn từ tôm hùm. - Sàng lọc các chủng vi sinh vật phân lập từ tôm hùm có khả năng sinh bacteriocin. - Xác định các đặc điểm của vi sinh vật sàng lọc được. - Định danh vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được bằng phương pháp sinh học phân tử. 4 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang Chƣơng I. TỔNG QUAN 1.1. Bacteriocin Nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên cứu của Gratia và cộng tác viên vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của Escherichia coli (colicin V) và thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến những năm 1950. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Ba chủng vi khuẩn Gram (+) được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.;Listeria sp. và Staphylococcus sp. Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho thấy có sự gia tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin. Từ thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu bacteriocin, định hướng như một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm[12],[23]. 1.1.1 Khái niệm Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein được tổng hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym proteinase, lipase. 1.1.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm : - Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương. - Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram âm ở chỗ là: việc tạo 5 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm . Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn Gram âm, điển hình là E. coli sinh tổng hợp colicin. Tuy nhiên những nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương cũng đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo cung cấp những thông tin về vấn đề này. Ba chủng vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là Bacillus sp.;Listeria sp. và Staphylococcus sp. Ngày nay thì các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này dùng trong bảo quản thực phẩm là an toàn với người sử dụng, không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi proteinase trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người. Thêm vào đó chúng hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền. Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh acid hữu cơ và sinh bacteriocin kháng khuẩn kháng nấm. Bảng 1.1: Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại I Bacteiocin Vi khuẩn Nisin A Nisin Z Mutacin 1140 Carnocin U149 Cytolysin Lacticin 481 Lactocin S Salivaricin A Mersacidi Lactococcus lactis (nhiều chủng) Lactococcus lactis (nhiều chủng) Streptococcus mutans JH1000 Carnobacterium piscicola 149 Enterococcus faecalis DS16 Lactococcus Lactis CNRZ481 Lactobacillus sake L45 Streptococcus Salivarius 20P3 Bacillus spp [...]... loài thuộc họ tôm hùm Gai (Palinuridae), 9 loài thuộc họ tôm Mũ Ni (Scyllaridae) và 4 loài thuộc họ Nephropidae Trong đó, một số loài thuộc họ tôm hùm Gai được nuôi phổ biến hiện nay như tôm hùm Bông (tôm hùm Sao, tôm hùm SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang 20 Hèo), tôm hùm Đá (xanh chân ngắn), tôm hùm Đỏ (hùm lửa), tôm hùm Sỏi (xanh chân dài, hùm ghì), tôm hùm Tre (Tề Thiên) Hệ thống phân loại tôm hùm Ngành Arthropoda... Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.2 Mẫu tôm hùm Mẫu tôm hùm được thu mua ở trại tôm Bình Ba, Khánh Hòa Tôm hùm sử dụng cho thí nghiệm có kích thước khoảng 27cm, nặng 600g Mẫu tôm được bảo quản sống đưa về phòng thí nghiệm và tiến hành phân lập vi sinh vật từ máu, nội tạng, và cơ thịt 2.1.3 Chủng chỉ thị Các chủng chỉ thị là chủng Bacillus B1.1 đại diện cho nhóm vi khuẩn... pneumoniae và Escherichia coli Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường có SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang 25 ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường mà vi c sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan-tsai của Đài Loan Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình... đoạn phát triển và tùy vào từng loài mà chúng phân bố theo độ sâu khác nhau Ở giai đoạn trưởng thành tôm hùm bông thường phân bố ở độ sâu từ 20m trở lên, ở giai đoạn ấu trùng và con non chúng thường phân bố ở các bãi rạn, đá san hô ở độ sâu từ 2 - 10m nước Tôm hùm thường sống ở các bãi rạng đá, rạng san hô nơi có nhiều hang hốc, khe rãnh ven biển Chúng có tập tính sống quần tụ chủ yếu là ở tầng đáy với... 2004, nhóm tác giả Todorov, Van và Dicks thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus Plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia Barley Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum được phân lập từ bia barley (kích thước phân tử 10kDa) ức chế sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casein, Pseudomonas... dựa vào protein miễn dịch đặc trưng, LanI Trong khi kiểu miễn dịch khác dựa vào vật chuyên chở nhiều thành phần riêng biệt (Lan EFG) Bacteriocin sẽ nhận biết được những vi sinh vật sinh bacteriocin nhờ sự không có mặt của những thụ thể đặc biệt và kết quả là chúng không bám được vào tế bào vi sinh vật đó[14] 1.1.5 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 1.1.5.1Phạm vi hoạt động Phạm vi hoạt động của bacteriocin. .. dịch Bacteriocin có khối lượng phân tử lớn, thành phần cấu tạo là protein và nhiều bacteriocin có tính kháng nguyên cao Tuy nhiên, hiện nay chỉ có duy nhất một vài bài báo cáo nghiên cứu tính kháng nguyên của bacteriocin sinh bởi vi khuẩn Gram dương Megacin A-216 là một kháng nguyên và tế bào cũng sinh ra một kháng thể có khả năng chống lại ảnh hưởng giết chính nó Vi c nghiên cứu những kháng thể đến bacteriocin. .. ích, và ứng dụng trong cuộc sống nhờ các tính chất đặc trưng của chúng Song còn nhiều vấn đề liên quan đến bacteriocin chưa được sáng tỏ Vì vậy, thúc đẩy các nhà khoa học bắt tay vào nghiên cứu lĩnh vực này Và vi c nghiên cứu và phát triển các loài vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin có phổ kháng khuẩn lớn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực là vấn đề mà nhiều nhà khoa học trong nước và. .. Phân loại Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên vi c phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng là trình tự chuỗi amino acid [20] Trong đó, phương pháp phân loại được. .. 2009, pinto và cộng sự đã nghiên cứu mô tả đặc tính chống vi khuẩn Listeria của bacteriocin phân lập từ động vật có vỏ, kháng sinh tiềm năng kiểm soát chất lượng thủy sản không lên men Tháng 11/2009, Satish Kumar R, Arul V thuộc khoa Công nghệ sinh học trường đại học Pondicherry, Ấn Độ đã tách chiết một loại bacteriocin từ chủng Streptococus phocae PI80 phân lập bởi tôm thẻ chân trắng Ấn Độ được đặt tên . chọn được xem là có nhiều ưu điểm và hiệu quả nhất. Vì thế, tôi chọn tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập đƣợc từ tôm. hùm có khả năng sinh bacteriocin. - Xác định các đặc điểm của vi sinh vật sàng lọc được. - Định danh vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được bằng phương pháp sinh học phân. khả năng sinh bacteriocin. Đề tài nhằm các mục đích chính sau đây: - Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng kháng khuẩn từ tôm hùm. - Sàng lọc các chủng vi sinh vật phân lập từ tôm hùm