TS CHU HOÀNG MẬU CƠ SỞ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Lời nói đầu .4 Chương 1: HỆ GENE §1 KHÁI NIỆM HỆ GENE (GENOME) §2 AXIT NUCLEIC §3 ADN VÀ TÁI BẢN ADN 11 §4 ARN VÀ CƠ CHẾ PHIÊN MÃ 19 THẢO LUẬN 23 Chương 2: ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE CỦA SINH VẬT PROKARYOT VÀ EUKARYOT 25 §1 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE Ở PROKARYOT 25 §2 CẤU TRÚC PHÂN ĐOẠN GENE Ở EUKARYOT 25 §3 MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN 27 THẢO LUẬN 32 Chương 3: MỐI LIÊN HỆ GIỮA ADN, ARN, PROTEIN 33 §1 THÔNG TIN DI TRUYỀN VÀ MẬT MÃ DI TRUYỀN 33 §2 PROTEIN 39 §3 Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEIN .42 §4 ĐIỀU HỒ BIỂU HIỆN GENE 45 THẢO LUẬN 49 Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 50 §1 ENYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME HOẶC ENZYME CẮT HẠN CHẾ (RESTRICTION ENDONUCLEASE - RE) .50 §2 CÁC NHĨM ENZYME KHÁC .57 §3 ENZYME NUCLEASE 60 THẢO LUẬN 61 Chương 5: XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA PROTEIN VÀ ĐẶC TÍNH Ở SINH VẬT .62 §1 MỘT SỐ LOẠI PROTEIN CHỨC NĂNG 62 §2 QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ PROTEIN 66 §3 KĨ THUẬT PHÂN TÍCH PROTEIN 67 §4 KĨ THUẬT PHÂN TÍCH ENZYME 74 §5 NGHIÊN CỨU RIPS BẰNG WESTERN BLOT 77 THẢO LUẬN 78 Chương 6: KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ GENE SINH VẬT 79 §1 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN 79 §2 LAI PHÂN TỬ 83 §3 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA ADN 85 §4 RFLP TECHNOLOGY (Kĩ thuật phân tích tượng đa hình độ dài phân đoạn ADN) .87 THẢO LUẬN 91 Chương 7: PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (POLIMERASE CHAIN REACTION - PCR) 92 §1 PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (PCR) 92 §2 PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN NGẪU NHIÊN (RANDQM AMPLIFIED PQLIMORPHIC DAN - RAPD) 99 §4 PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CHIỀU DÀI CÁC PHÂN ĐOẠN ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN CÓ CHỌN LỌC 106 THẢO LUẬN 108 Chương 8: TẾ BÀO CHỦ VÀ VECTOR 109 §1 TẾ BÀO CHỦ 109 §2 VECTOR 111 §3 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ 122 THẢO LUẬN 125 Chương 9: PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE 126 §1 PHÂN LẬP GENE 126 §2 TÁCH DÒNG GENE .127 §3 BIỂU HIỆN GENE 139 THẢO LUẬN 151 Tài liệu tham khảo .152 cơng trình tác giả cộng tác viên công bố 155 CƠ SỞ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ .162 Lời nói đầu Sinh học phân tử đại phát triển mạnh trở thành nịng cốt Cơng nghệ sinh học Ở Việt Nam, thành tựu nghiên cứu Sinh học phân tử áp dụng kĩ thuật phân tử nghiên cứu Khoa học sốngvà Công nghệ sinh học có nhiều đóng góg việc chăm sóc, bảo vệ sức khoẻ người; đánh giá tài nguyên sinh vật; chọn giống sản xuất nông lâm ngư nghiệp Sinh học phân tử môn Sinh học đại, giảng dạy nhiều trường đại học có đóng góp định đào tạo lớp người có tri thức Cơng nghệ sinh học góp phần vào nghiệp Cơng nghiệp hố, đại hoá Cơ sở phương pháp Sinh học phân tử biên soạn từ nhiều tài liệu, giảng cơng trình nghiêm cứu Sinh học phân tử đại tác giả nước, nhằm cung cấp kiến thức nguyên lí ứng dụng Sinh học phân tử, làm tài liệu cho nghiên cứu, giảng dạy học tập môn trường đại học Cuốn Cơ sở phương pháp Sinh học phân tử cấu trúc chương: Chương Hệ gene Chương Đặc điểm cấu trúc gene sinh vật Prokaryot Eukryot Chương Mối liên hệ ADN, ARN, Protein Chương Enzyme sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử Chương Xác định mối liên quan protein đặc tính sinh vật Chương Kĩ thuật sinh học phân tử tích hệ gene sinh vật Chương Phản ứng chuỗi polimerase (PCR) Chương Tế bào chủ Vector Chương Phân lập gene, tách dòng phân tử biểu gene Tác giả trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng, TS Lương Thị Hồng Vân đọc góp ý cho thảo, xin cảm ơn đóng góp Hội đồng nghiệm thu đánh giá giáo trình trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên cảm ơn ý kiến đóng góp q báu đơng đảo nhà khoa học Trong trình biên soạn chắn có sai sót, tác giả mong nhận góp ý bạn đọc Mọi đóng góp xin gửi Khoa Sinh - Kĩ thuật Nông nghiệp trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Tác giả Chương 1: HỆ GENE Tóm tắt: Sự đời sinh học phân tử đánh dấu thời điểm mà Oatsơn Cric (1953) phát cấu trúc ADN Trải qua 40 năm (1953 2000) sinh học phân tử đạt thành tựu vĩ đại mà đỉnh cao phát triển khám phá chất sinh học sống cấp độ phân tử xây dựng kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng váo thực tiễn Geneomics Proteomics vấn đề đặc biệt quan tâm mà sở lĩnh vực phát cấu trúc chức axit nucleic, đặc điểm genome nhân, genome ti thể, genome lạp thể Những điểm khác cấu trúc chức hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống nghiên cứu người Cùng với cấu trúc ADN ARN cịn có đặc điểm q trình tái ADN phiên mã quan tâm, sở kĩ thuật sinh học phân tử - thao tác ADN ARN Nội dung chương đề cập đến sở sinh học phân tử Nội dung chương gồm vấn đề bản: (1) Khái niệm hệ gene; (2) Axit nucleic; (3) ADN vá tái ADN, (4) ARN chế phân mã §1 KHÁI NIỆM HỆ GENE (GENOME) Quá trình sinh trưởng phát triển sinh vật trải qua nhiều giai đoạn tất q trình phụ thuộc vào điều khiển gene Cấu trúc, chức tế bào định trực tiếp protein, sản phẩm cuối biểu gene Quá trình thể hoạt động gene qua protein, bị ảnh hưởng lớn yếu tố ngoại cảnh ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, cộng sinh tương tác gene hệ gene tế bào Như vậy, thành phần hệ gene tế bào sống có tương tác với có mối quan hệ với yếu tố môi trường Trong tế bào, bên cạnh genome nhân, hệ thống di truyền phân bố lục lạp, ti thể plasmid (vi khuẩn) Các quan tử tham gia vào trình sinh tổng hợp protein tế bào Tế bào đơn vị cấu trúc chức thể sống, tế bào đơn vị di truyền Hệ gene toàn hộ gene tế bào thể sinh vật, hệ gene hứa tồn thơng tin di truyền đặc trưng cho loài, cho cá thể loài Ở sinh vật Prokaryot hệ gene gồm toàn gene tế bào; Eukaryot hệ gene gồm toàn gene tế bào đơn bội (n) Tế bào đơn bội có hệ gene, sinh vật tế bào lưỡng bội có hai hệ gene, sinh vật đa bội có nhiều hệ gene Hệ gene sinh vật Eukaryot bao gồm hệ gene nhân (genome nhân), hệ gene ti thể (genome ti thể), hệ gene lục lạp (genome lục lạp) Hệ gene Prokaryot có thành phần gồm đoạn ADN khơng giống nhau; cịn hệ gene Eukaryot có ba thành phần ADN không giống nhau: Các đoạn ADN lặp lại nhiều (chiếm khoảng 25%), đoạn ADN lặp lại (30%) đoạn ADN khơng lặp lại (45%) 1.1 Hệ gene nhân Hệ gene nhân genome lớn tế bào xét mặt khối lượng số lượng gene mã hoá ADN nhân xếp gọn nhiễm sắc thể liên kết với protein chứa histone không chứa histone ADN có vai trị mã hố thơng tin di truyền, cịn protein bảo vệ tham gia điều khiển chép, phiên mã xác Q trình phát triển động, thực vật nhân đôi vật chất di truyền phân cho tế bào tế bào phân chia Tế bào thực vật chứa lượng lớn ADN, khối lượng thay đổi theo lồi Arabidosis thaliana có lượng ADN nhỏ (0.07 picogram) Allium cepa có lượng ADN nhiều 33,5 pg/ haploid genome (hệ gene đơn bội) 1.2 Hệ gene lục lạp Cho đến năm 1962, người ta khám phá ADN ribosom có lục lạp Như vậy, lục lạp lạp thể chứa tất máy cần thiết để tự biểu hoạt động gene Hệ gene lục lạp toàn gene lục lạp hay tồn lượng thơng tin di truyền chứa ADN lục lạp Lượng ADN lục lạp lớn, chiếm tới 15% tổng lượng ADN thể thực vật, ribosom chiếm 60% lượng ribosom tế bào, ADN lục lạp cấu tạo phân tử có cấu trúc mạch vịng, có trọng lượng phân tử 83 - 128 x 106, gần 85% phân tử ADN mạch đơn ADN lục lạp làm khuôn phiên mã tổng hợp mARN chloroplast Ở phân tử mARN có khoảng 20 nucleotit, chúng thực tổng hợp protein chỗ chloroplast Ribosom chloroplast 70S bao gồm 30S 50S Sau tổng hợp xong protein vận chuyển đến nơi mà lục lạp cần thiết Về hệ thống di truyền lục lạp tương tự với hệ thống di truyền sinh vật Prokaryot Do có nhiều tranh luận, có phải vật liệu di truyền sinh vật tiền nhân nguồn gốc ADN lục lạp? Ngoài ADN lục lạp không chứa số gene đặc trưng cho sinh vật có nhân thật Điều tìm thấy ADN thuốc ngô Ribosom lục lạp giống ribosom sinh vật Procariot: 70S cấu tạo tiểu phần 50S 30S Ribosom E coli lục lạp thực vật có đặc tính miễn dịch giống Thơng qua việc nghiên cứu sản phẩm biểu gene protein, người ta phát hệ gene lục lạp hệ gene nhân tế bào thực vật có mối quan hệ chặt chẽ - Genome lục lạp khơng có khả tổng hợp tất protein có chúng - Phần lớn polipeptid lục lạp tổng hợp genome nhân tế bào - Những polipeptid chuyển vào lục lạp theo chế sau dịch mã thực qua vỏ lục lạp - Hệ thống di truyền lục lạp điều khiển tổng hợp protein cần cho phát triển chúng với số lượng khoảng 100 polipeptid Bảng 1.1 Kích thước số ADN lục lạp (ct ADN), ADN nhân vi khuẩn Kích thước (bp) Kích thước vịng ( μ m) ≈ 200 x 103 - Trực khuẩn E-coli (chromosome) 3,8 x 106 - Trùng roi (Euglena) (ct ADN) 1,4 x 105 44 - 44 Thuốc (Tabaco) (ct ADN) 1,6 x 105 - Ngô (Maize) (ct ADN) 1,36 x 105 43 Đậu xanh (mungbean) (ct ADN) 1,21 x 105 39 AND Plasmid - Polipeptid mã hoá tổng hợp ARN lục lạp đảm nhiệm chức quan tử liên quan đến trình quang hợp Ở lúa người ta xác định vị trí gene quan trọng điều khiển trình quang hợp rbcl, atpBE, pSbA, pstA, psbA Các gene đóng vai trị quan trọng q trình sinh tổng hợp protein hệ thống quang hoá II 1.3 Hệ gene ti thể (Mitochondria Genome) Để nghiên cứu hệ gene ti thể điều quan trọng thu ADN ti thể Có thể lấy ví dụ lúa theo Salech cộng (1989), phương pháp phân tích ADN ti thể gồm bước sau: - Li tâm với tốc độ chậm để loại bỏ nhân, lục lạp thành phần khác tế bào - Li tâm với tốc độ nhanh để tách ti thể - Li tâm với tốc độ chậm để lấy nhân, lục lạp thành phần khác - Xử lí ADN- ase I để phân giải chất ADN nhân dính ti thể - Làm ti thể - Tách chiết mtADN từ ti thể (mtADN) Như người ta thu ADN mitochondria tinh phục vụ cho công tác nghiên cứu mtADN thể khác biệt lớn mặt kích thước hình dạng Đối với động vật, mtADN có dạng vịng kích thước xấp xỉ 15 - 20kb Ngược lại mtADN thực vật có nhiều dạng (vịng.,thẳng vầ(cc dạng khác), có kích thước lớn nhiều: bắp cải 200kb, loại dưa 2500 kb Do genome ti thể thực vật tương đối lớn gồm vài phân tử ADN Lượng mtADN thực vật chiếm khoảng 0,5 - 1% lượng ADN tế bào đóng vai trị sống cịn cho phát triển sinh sản thực vật Chức mtADN giống ctADN Nó có khả mã hoóatổng hợp số lượng nhỏ pohlieptid quan trọng.,phục vụ cho hoạt động Những sản phẩm mà mtADN điều khiển tổng hợp tiểu phần cytochromoxydaza, tiểu phần phức chất cytochrom bc số thành phần khác (Andre, 1991) Ngoài mtADN cịn đóng vai trị quan trọng tượng bất dục đực tế bào chất (CMS) Đây đặc tính khai thác sản xuất dịng lai nhiều trồng lúa, ngơ Spruill cộng (1981) ngơ có khác mtADN tế bào thường tế bào có tượng CMS Khi phân tích sản phẩm protein mtADN CMS có khả tổng hợp chuỗi peptid 130000 MW, khả tổng hợp chuỗi polipeptid 21000 MW nguyên sinh chất tế bào bình thường Mặt khác người ta cịn thấy tượng bất dục tế bào chất liên quan đến phân tử ADN giống plasmid tìm thấy ti thể Chẳng hạn ngô tế bào chất CMS có mang hai phân tử AND mạch thẳng với kích thước 6,2 kb 5,2 kb Việc sử dụng code mã hóa tổng hợp protein mtADN có điểm cần lưu ý: hệ thống hoạt động mã di truyền thơng thường code UGA cung cấp tín hiệu kết thúc trình tổng hợp chuỗi polipeptid, ADN ti thể lại code tryptophan Ngược lại ADN nhân code CGG mã hố cho tryptophan ti thể lại mã hố arginin Ngồi người ta phát dạng mARN genome ti thể trồng gọi ARN - Editing Đây vấn đề thể tiến hoá thực vật bậc cao, giúp cho có khả thích nghi với điều kiện ngoại cảnh §2 AXIT NUCLEIC 2.1 Axit nucleic vật chất di truyền Axit nucleic bao gồm axit deoxyribonucleie (ADN) axit ribonucleic (ARN) đáp ứng tiêu chuẩn vật chất di truyền Có nhiều chứng chứng tỏ axit nucleic vật chất di truyền cấp độ phân tử Axit nucleic hấp thụ tia tử ngoại cực đại bước sóng 260nm điều phù hợp cách xác với bước sóng mà tia tử ngoại gây đột biến tối đa tế bào, protein bước sóng 280nm - Năm 1928 F Grifflth phát thấy nòi phế cầu khuẩn S, khuẩn lạc nhẵn có vỏ bọc polisaccharid (vi khuẩn gây viêm phổi) vi khuẩn Diplococus pneumoniae làm chuột chết tiêm vào thể chuột Trong khuẩn lạc R (khuẩn lạc khơng có vỏ bọc polisaccharid) khơng gây độc hại Hỗn hợp phế cầu khuẩn R sống phế cầu khuẩn S chết làm cho chuột bị viêm phổi, chết từ máu chúng phân lập vi khuẩn S sống Như tác nhân từ phế cầu khuẩn biến nạp làm cho phế cầu khuẩn R thành S Người ta chứng minh rằng: ADN tách từ vi khuẩn S đưa vào vi khuẩn R gây nên biến đổi kiểu R → S, phát khẳng định ADN vật chất di truyền Năm 1944 O T Avery, Mc Leod Mc Carti chứng minh tác nhân biến nạp ADN Phế cầu khuẩn S bị xử lí protease ARNaza hoạt tính biến nạp cịn: phế cầu khuẩn S bị xử lí ADN-aza hoạt tính biến nạp khơng cịn Hình 1.1 Sơ đồ chứng minh vật chất di truyền ARN Năm 1957, H Fraen Kel - Conrat B Singer công bố thí nghiệm virut đốm thuốc có lõi ARN vỏ protein, có hai dạng a b Các thí nghiệm lắp ráp lõi ARN dạng với protein dạng ngược lại thành công tạo virut có vỏ lõi thuộc hai dạng khác Sau đem gây nhiễm vào thuốc lá, kết virut phân lập từ vết đốm mang vỏ protein lõi ARN thuộc dạng dạng lõi ARN mang nhiễm vỏ protein Như thông tin di truyền chứa đựng ARN protein 2.2 Axit nucleic virut, Prokaryot Eukaryot Virut vật chất sống cấu tạo đơn giản, gồm lõi axit nucleic vỏ protein Vật chất di truyền virut có hai loại: ADN ARN Đa số loài virut sống kí sinh, xâm nhập vào tế bào vật chủ (có tồn virut hay A nucleic) Virut sống kí sinh tế bào Prokaryot gọi phage hay bacteriophage (thực khuẩn thể) Một số virut có lõi ARN chủ yếu kí sinh thực vật, cịn virut kí sinh động vật tế bào Prokarvot đa số có lõi ADN NST phải tạo mơi trường vật lí phân tử ADN hoạt động, tác động qua lại với hệ thống trao đổi chất tế bào Hệ thống xếp cách tổ chức, bố trí ADN NST tổ chức sinh vật chưa có nhân thức sinh vật nhân chuẩn có khác nào? Người ta sử dụng ba hướng để nghiên cứu tổ chức ADN đối tượng sinh vật khác nhau, việc sử dụng thiết bị kĩ thuật kính hiển vi điện tử, nhiễu xạ tia X, xử lí enzyme biến đổi cấu trúc NST Đối với sinh vật Prokaryot, tổ chức ADN NST dạng nucleoid (vùng nhân) Vùng nhân chứa ADN ADN gấp cuộn thành nhiều vịng xoắn: ADN dạng siêu xoắn, tính chất siêu xoắn chịu kiểm sốt enzyme topoisomerase Ví dụ E coli ADN có kích thước 300 μ m co ngắn kích thước dài 25 μ m tiếp tục co ngắn kích thước cịn 1,5 μ m Cách xếp phát nhờ enzyme ribonuclease deoxyribonuclease Prokaryot chứa ADN trần, chuỗi kép, dạng vịng, ngồi vật chất di truyền cịn plasmid (chiếm l-2%) E coli có phân tử ADN dạng vòng chứa 30004000 gene Đối với sinh vật Eukaryot, ADN tế bào có nhân, ti thể lạp thể chủ yếu ADN nằm nhiễm sắc thể nhân tế bào ADN nhân có dạng mạch kép, chủ yếu B-ADN ADN ti thể ADN lục lạp có dạng kép vịng Tổ chức ADN nhiễm sắc thể dạng nucleosome (thể nhân) Mỗi nucleosome gồm phân tử ADN protein (kiềm) gọi histon Histon gồm phân tử (octamer) Phân biệt loại histon với tỉ lệ gần H1, H2A, H2B, H3, H4 Trong có phân tử H3, phân tử H4 liên kết với vùng trung tâm; phân tử H2A, phân tử H2B liên kết vùng 10 Các nucleosome nối với đoạn nucleotit (ADN) dài 15 100 cặp nucleotit NST có cấu trúc xoắn theo nhiều bậc: tập hợp nhiều nucleosome thành sợi có cấu trúc xoắn (100Å), sợi tiếp tục xoắn thành solenoit (sợi nhiễm sắc) có đường kính là: 250Å: solenoit cuộn xoắn lần tạo nên ống rỗng có đường kính 2000Å; ống rỗng cuộn xoắn lần thành sợi chromatit có đường kính 6000Å §3 ADN VÀ TÁI BẢN ADN 3.1 Đặc điểm cấu trúc phân tử ADN Hàm lượng ADN nhân tế bào đặc trưng cho loài phụ thuộc số lượng nhiễm sắc thể nhân ADN đại phân tử, có khối lượng chiều dài lớn Ở sinh vật Prokaryot nhiễm sắc thể có thểcó nhiều phân tử ADN, sinh vật Eukaryt nhiễm sắc thể có phân tử ADN Bảng 1.2 Hàm lượng ADN số loài sinh vật Tế bào lưỡng bội (2n) Tế bào đơn bội (n) Người 6,6 pg ADN 3,3 pg ADN Ruồi giấm pg ADN pg ADN picogram (pg) ADN = 0,965 109 bp = 6,1.1011 dalton = 29cm Người ta phân biệt dạng ADN B, A Z, C, D Các dạng AND khác chiều xoắn, chiều cao chu kì xoắn, số cặp nucleotit chu kì 11 Bảng 1.3 So sánh đặc điểm số loại AND Dạng AND Chiều xoắn Số cặp nucleotit chu kì Góc xoắn (0) Đường Chiều cao Dạng kính chu kì thiết điện (Å) xoắn B Phải 10 36 20 34 Tròn A Phải 11 32,7 23 28 Tròn Z Trái 12 30 18 37,1 C Phải 9,3 38,6 20 31 D Phải - - - zigzac Tròn Bát giác Oatsơn Cric (1953) xây dựng mơ hình B-ADN (phổ biến nhất), chuỗi xoắn kép gồm mạch polinucleotit xoắn theo chiều từ trái sang phải Mơ hình Oatsơn Crick lí giải chức ADN bảo đảm cho việc tái sinh trình tự chép gian kì điều chỉnh việc tổng hợp enzyme protein Đây mốc thời gian đánh dấu đời ngành sinh học phân tử ADN ARN polime gồm nhiều monomer nối với nhau, monomer gọi nucleotit (ở ADN gọi deoxynucleotit, ARN ribonucleotit) Mỗi deoxynucleotit ribonucleotit gồm thành phần bazơ nitơ ( purin pirimidin) đường pentose axit photphoric Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo phân tử đường deoxyribose ribose Các bazơ purin (kích thước khoảng 7Å) gồm Adeine (A); Guanine (G); cịn bazơ pirimidin (kích thước khoảng 5Å) gồm Thymine (T); Cytosine (C); Uracil (U) 12 Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc loại bazơ nitơ Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo deoxynucleotit Kết nghiên cứu Chargaff phân tích hàm lượng bazơ purin pirimidin ADN thấy tỉ lệ Adenine Thymine tỉ lệ Guanine Cytosine (A = T; G = C) ADN gồm hai chuỗi polinucleotil, mạch polinucleotit có nhiều nucleotit liên kết với mối liên kết phosphodieste Các bazơ đối diện hai mạch đơn liên kết với mối liên kết hydro theo nguyên tắc bổ sung (A - T; G - C) Hai mạch polinucleotit ADN có chiều ngược nhau: 13 ⎯→ 5'P 3'OH ⎯ ⎯→ 3'OH 5'P ⎯ Tính đặc trưng phân tử ADN phụ thuộc vào yếu tố: số lượng, thành phần trình tự xếp nucleotit ADN, phụ thuộc nghiêm ngặt vào trình tự nucleotit Kích thước phân tử ADN tính bp (base pair- cặp bazơ) kb (kilobase - kb = 1000 bp), tính đặc hiệu nucleotit bazơ, nói đến axit nucleic bazơ thường dùng thay cho nucleotit Hình 1.5 Sơ đồ chuỗi polinucleotit B-ADN 3.2 Tái ADN 3.2.1 Các kiểu tái ADN Người ta đưa giả thuyết kiểu tái ADN: Kiểu bảo toàn: Chuỗi ADN mẹ giữ nguyên, ADN tổng hợp từ nguyên liệu (chưa có chứng tự nhiên) Kiểu phân tán: ADN ban đầu đứt đoạn nhỏ, đoạn nhỏ làm khuôn để tổng hợp đoạn nhỏ khác Các đoạn nhỏ nối lại với thành ADN Kiểu bán bảo tồn: Meselson Stahl chứng minh 1958 E coli sử dụng đồng vị phóng xạ N15 Mathew Meselson Franklin Stahl (Mỹ - California) tiến hành thí nghiệm ni E Coli với nguồn N15, chứng minh chế tái ADN 3.2.2 Hệ enzyme tái ADN 14 • Ba loại enzyme ADN-polimerase E Coli - ADN-poIimerase I: giữ vai trò tái ADN, dễ sửa chữa - ADN-poIimerase II: xác định bắt đầu tổng hợp ADN - ADN-poIimerase III: điều khiển tổng hợp ADN, thực nhiệm vụ chủ yếu gia tăng chiều dài sợi • Ba loại enzyme ADN - polimerase Eukaryot - ADN-polimerase α (120.000 - 300.000 dalton) có chức tái ADN nhân - ADN-polimerase β (30.000 - 50.000 dalton) sửa đổi ADN - ADN-polimerase γ (150.000 - 300.000 dalton) tái hệ gene ti thể 3.2.3 Cơ chế tái ADN theo Okazaki -Tái nửa gián đoạn (Semidiscontinous replication ) 3.2.3.1 Hiện tượng duỗi xoắn Hiện tượng có tham gia loại protein SSB (Single Strand Binding) bám vào sợi đơn ADN trạng thái mở xoắn, SSB bám vào bazơ chạc tái có 250 SSB 3.2.3.2 Khởi đầu tái ARN mồi (primer) ARN polimerase hoạt động tổng hợp đoạn ARN mồi ngắn tạo đầu 3'OH tự do, sau ADN polimerase III hoạt động tái Đối với E coli primer tạo enzyme primase 3.2.3.3 Kéo dài, loại bỏ mồi hình thành phân đoạn Okazaki Sau ARN mồi tổng hợp, ADN-polimerase I hoạt động loại bỏ mồi nhờ cắt từ (5' - 3') thay vào đoạn ADN (hình thành phân đoạn Okazaki) Mỗi phân đoạn Okazaki có 1000 - 2500 bazơ Các phân đoạn Okazaki nối với ADN-ligase Sợi ADN tổng hợp cách nối phân đoạn okazaki gọi sợi chậm (lagging strand) sợi tổng hợp không liên tục (gián đoạn); sợi tổng hợp liên tục khuôn sợi ADN có chiều 3' - 5' Cơ chế tái ADN có sợi tổng hợp liên tục sợi tổng hợp gián đoạn gọi tái nửa gián đoạn - Mạch ADN tổng hợp theo chiều 5' - 3', mạch polinucleotit tổng hợp liên tục mạch tổng hợp gián đoạn- Mỗi bước 15 trình tái có tham gia loại enzyme tương ứng - Quá trình liên kết với nucleotit thực theo nguyên Ltc bổ sung (A - T, G - C ) - Có tham gia primer (ARN mồi) - Mỗi ADN tạo thành chứa mạch cũ mạch (bán bảo tồn) Hình 1.6 Tái ADN theo Okazaki 3.2.4 Tái ADN virut - Các phage (virut kí sinh vi khuẩn) mang ADN sợi sợi, virut ARN có loại ARN sợi mang ARN sợi - Cơ chế tái ADN sợi virut Φ x 174 (nghiên cứu nhiều nhất) kí sinh vi khuẩn E coli (hình 1.7) Hình 1.7 Tái virut Φ 174 16 Chỉ có sợi (+) tái có sợi RF làm khuôn tổng hợp sợi (+) 3.2.5 Tái ADN tế bào sinh vật Prokaryot 3.2.5.1 Tái ADN vịng Prokaryot Ở E coli, q trình tái xuất phát từ điểm ori (origine) gọi điểm xuất phát triển khai hai phía Ở E coli có điểm xuất phát chép ori nên ADN thành đơn vị chép (replicon) Prokaryot thường có replicon (hình 1.8) Hình 1.8 Đơn vị tái (replicon) Prokaryot 3.2.5.2 Tái kiểu lăn đai thùng (Rolling circle ) - E coli F+ F- tiếp hợp Yếu tố F truyền từ F+ sang F- F- biến thành F+, ADN vòng plasmid tái theo kiểu lăn đai thùng tạo thành ADN vòng tế bào nhận F- Hình 1.9 Tái kiểu lăn đai thùng (rolling circle) 3.2.6 Tái tế bào sinh vật Eukaryot Ở sinh vật Eukaryot sinh sản tế bào trình sinh trưởng phân nhân phân bào mang tính chu kì, q trình gọi chu kì tế bào (cell cycle) Chu kì tế bào gồm pha: Pha G1 (Gap 1) tiếp sau pha phân chia, nhiễm sắc thể tháo xoắn trở 17 dạng sợi mánh xảy q trình tổng hợp chất cho nhân đơi ADN diễn hàng loạt biến đổi dẫn đến khởi đầu cho chép ADN Pha S (Synthesis): vật chất di truyền chất nhiễm sắc nhân đơi, q trình tái ADN, chứng chứng tỏ chép ADN sinh vật nhân chuẩn diễn theo kiểu nửa gián đoạn sinh vật nhân sơ Các enzyme cần thiết cho chép ADN sinh vật nhân chuẩn bao gồm nhóm ADN-polimerase có ADN polimerase α , ADN-polimerase β ADN-polimerase γ Theo quan niệm nay, sinh vật nhân chuẩn bậc cao nói chung α - polimerase sử dụng chép ADN nhân, β polimerase hoạt động enzyme sửa chữa, γ -polimerase chuyên trách chép ADN ti thể Hình 1.10 Các kiện diễn mức phân tử chu kì tế bào M Pha phân chia G1: Pha sau phân chia, chuẩn bị tổng hợp chất, chuẩn bị tổng hợp ADN S: Pha tổng hợp diễn q trình tái ADN G2: Pha trước phân chia tế bào, diễn tổng hợp tubulin cubuin Bắt đầu phân chia; Kết thúc phân chia;3 Xuất nhân tố cảm ứng tổng hợp ADN Ở sinh vật nhân chuẩn, NST có nhiều đơn vị chép (Replication Unit) cịn gọi replicon, replicon có điểm khởi đầu hai điểm kết thúc trình chép Các NST sinh vật nhân chuẩn bao gồm ADN histon nằm thể nhân Những chứng cho thấy gene mã hoá histon mã tạo để tổng hợp số lượng histon cần thiết cho hình thành thể nhân pha S 18 Pha G2 (Gap 2): nhiễm sắc thể chuẩn bị cho nguyên phân Một kiện quan trọng G2 nơi tổng hợp protein tubulin, cubulin trùng hợp hoá để tạo vi ống máy thoi sắc để phân li NST nguyên phân Pha M (Mitosis): Diễn trình nguyên phân tế bào, đặc điểm nguyên phân có biến đổi lớn chức cấu trúc tế bào Ở Eukaryot có số lượng ADN lớn, tái ADN phức tạp tốc độ chậm (50 nucleotit/giây) Tái Eukaryot có nhiều replicon nhiều điểm ori 3.2.7 Sửa sai tái Hướng chép ADN thực theo chiều từ 5'-3' hướng sửa chữa sai sót tái lại diễn theo chiều từ 3'-5' Enzyme ADN-polimerase I, III có hoạt tính exonuclease (enzyme có hoạt tính cắt nucleotit đầu tự ADN), có nucleotit lắp sai ADN-polimerase cắt bỏ nucleotit sai theo hướng 3'-5' Hình 1.11 Tái Eukaryot (nhiều replicon) Trong trường hợp ADN trạng thái khơng tái có xấp xỉ 20 loại enzyme rà sốt dọc NST để tìm ADN có biến đổi cấu trúc, enzyme kiểm sốt sai sót liên kết hố trị, số enzyme khác phát sai sót bắt cặp bazơ khơng bổ sung Tổng số có xấp xỉ 50 enzyme chuyên phát sửa sai sót ADN §4 ARN VÀ CƠ CHẾ PHIÊN MÃ 4.1 Cấu trúc chức ARN 4.1.1 Các loại ARN ARN thông tin (iARN; mARN) cấu tạo từ mạch poliribonucleotit phổ biến có từ khoảng 600-1500 ribonucleotit Phân tử mARN có ba mở đầu (AUG), sau đến ba quy định axit amin thứ nhất, thứ hai cuối ba kết thúc (UAA, UGA, UAG) Phân tử mARN có chức truyền đạt thông tin di truyền từ ADN nhân tế bào đến tế bào chất trực tiếp tham gia tổng hợp protein Hàm lượng mARN ít, chiếm vài % 19 ARN tổng số tế bào ARN vận chuyển - ARN hoà tan (tARN; sARN): Cấu tạo từ mạch poliribonucleotit, có khoảng 75-100 ribonucleotit, khối lượng phân tử 26000 dalton Hàm lượng tARN chiếm khoảng 10-20% ARN tổng số Phân tử tARN có cấu trúc xoắn tạo thùy tròn, thùy mang ba đối mã, thùy nhận biết enzyme gắn với axit amin đầu tARN Một đầu mút mang axit amin kết thúc ACC, đầu mút GGG Chức tARN kết hợp với axit amin để tổng hợp protein Phân tử tARN có chức tham gia tổng hợp protein tiếp nhận liên kết Hình 1.12 Mơ hình cấu trúc không gian cấu trúc phân tử tARN ARN ribosom chiếm phần lớn tế bào, khoảng 80% hàm lượng ARN tổng số Các phân tử rARN với protein cấu tạo nên ribosome Bản chất hoá học ribosome nucleoprotein, gần 36% protein 64% rARN 4.1.2 Cấu trúc ARN Các loại ARN có chuỗi poliribonucleotit, ribonucleotit gồm thành phần (H3PO4; C5H10O5; bazơ nitơ: A, U, G, C) Các ribonucleotit liên kết với mối liên kết phosphodieste, để tạo thành chuỗi poliribonucleotit, có chiều 5' → 3' Tất loại ARN tổng hợp từ khuôn mẫu ADN có cấu tạo sợi đơn Phân tử ARN virut genome chúng, có chức trì truyền đạt thơng tin di truyền Riêng retrovirut mang ARN sợi kép 4.2 Cơ chế phiên mã 4.2.1 Phiên mã sinh vật nhân sơ 4.2.1.1 ARN-polimerase sinh vật nhân sơ Ở E coli, ARN-polimerase có hệ số lắng 11S - 13S khối lượng phân tử 500.000 dalton; từ enzyme ARN polimerase nhân tố sigma ( σ ) kết hợp 20 với enzyme lõi khác Hình 1.13 Enzyme ARN -polimerase Nhân tố σ đóng vai trị quan trọng việc tổng hợp ARN, giúp cho enzyme lõi khởi đầu tổng hợp ARN điểm đặc thù - gọi điểm khởi đầu (promotor), thiếu nhân tố trình tổng hợp ARN xảy điểm ngẫu nhiên phân tử ADN Đoạn nhận biết (recognition sequence) gồm 35 cặp bazơ nằm trước điểm khởi đầu promotor Đoạn để ARN-polimerase nhận biết đoạn gồm nucleotit gọi prinow, nằm cách điểm phiên mã - bazơ Hộp prinow sợi đối khn (antitemplate) có cơng thức chung là: 5' TAT phun AT purin 3' 4.2.1.2 Các giai đoạn trình phiên mã Quá trình phiên mã Prokaryot bao gồm bước: khởi đầu, kéo dài kết thúc 1) ARN-polimerase lõi nhân tố nhận biết bám vào trình tự khởi động (promotor) ADN polimerase trượt dọc gene (3' - 5') xúc tác biến tính cục sợi ADN lộ sợi khuôn tổng hợp ARN 2) Quá trình tổng hợp ARN bắt đầu sợi ARN sinh theo chiều 5' - 3' 3) Đoạn kết thúc tín hiệu cho ARN-polimerase dừng phiên mã Đoạn kết thúc gồm phần: phần có tỉ lệ GC cao loại bazơ T sợi antitemplate 4.2.1.3 Đặc điểm Sản phẩm trình phiên mã sợi đơn ARN ADN dãn xoắn cục bộ, có sợi làm khn tổng hợp ARN gọi sợi có ý nghĩa (strand sense) Nguyên liệu ribonucleotit triphotphat : ATP, GTP, CTP, UTP gọi chung NTP, enzyme xúc tác ARN-polimerase ARN tổng hợp theo chiều 5' - 3', enzyme ARN-polimerase di chuyển theo chiều 3' - 5' sợi strand sense 4.2.2 Phiên mã sinh vật Eukaryot 21 4.2.2.1 ARN polimerase • ARN-poIimerase I: enzyme khơng bị ức chế a-amanitin (chất ức chế tổng hợp ARN), chuyên trách việc phiên mã gene để tổng hợp rARN (28S, 58S 18S) • ARN-polimerase II: enzyme bị ức chế α - amanitin, cần cho tổng hợp mARN • ARN-polimerase III: enzyme bị ức chế α - amanitin nồng độ cao, phiên mã tổng hợp tARN 4S, rARN 5S 4.2.2.2 Các đoạn kiểm soát phiên mã Hộp TATA hộp Goldberg - Hogness vị trí cách cặp bazơ phiên mã khoảng 30 cặp bazơ phía trước coi đoạn khởi đầu Đoạn kết thúc cịn nghiên cứu ít, đoạn kết thúc không dài 21 bazơ, nấm men có trình tự là: TTTTATA 4.2.2.3 Các giai đoạn q trình phiên mã Eukaryot • Giai đoạn khởi động: chịu kiểm tra trình tự đặc biệt "hộp TATA" (TATA box) nằm trước vị trí bắt đầu phiên mã khoảng 25 - 35 nucleotit ARN-polimerase II hoạt động phiên mã nhờ nhiều nhân tố TF có chất protein (trascription factor) cho phép khởi động phiên mã • Giai đoạn kéo dài: phân tử ARN tổng hợp từ mạch khuôn ADN Q trình nhờ nhân tố TF IIS • Giai đoạn kết thúc: phiên mã kết thúc trước điểm gắn đuôi poli A xa Kết thúc phiên mã có liên quan đến cấu trúc kẹp tóc tiếp sau trình tự giàu GC 4.2.2.4 Diễn biến trình phiên mã 1) Gắn chóp: pre mARN tạo dài 20 - 30 bazơ đầu 5'P nối thêm 7-methylguanosine liên kết 5'P - 5'P Bản phiên mã tiền mARN gồm exon intron 2) Thêm đuôi poli A: đoạn ngắn mARN bị cắt bazơ adenine nối vào thành đuôi poli A 3) Splicing: cắt rời intron nối exon nhờ phức hợp ribonucleoprotein (SnRNP) nhân, tạo cấu trúc không gian thuận tiện cho đầu exon gần xúc tác phản ứng cắt nối hình thành ARN trưởng thành 22 Hình 1.14 Sơ đồ giai đoạn trình phiên mã Eukayot 4.2.2.5 Đặc điểm phiên mã Eukaryot • ARN-polimerase II chịu trách nhiệm tổng hợp mARN, loại enzyme khác tổng hợp rARN tARN • mARN, rARN tARN chứa thông tin dạng gene • Q trình phiên mã phức tạp, đầu 5' mARN có gắn thêm "chóp" (cap: chóp, chụp đèn) 7-methylguanosine, cịn cuối mARN có "đi" poliadenine dài 100 - 200 A Chóp - Methylguanosine poliA có tác dụng bảo vệ ARN, ngồi poliA cịn tín hiệu nhận biết mã kết thúc trình dịch mã Bản phiên mã tiền mARN (premessager ARN-Pre-ARN) bao gồm đoạn intron exon, sau sau intron bị cắt bỏ tạo thành mARN trưởng thành THẢO LUẬN Phân biệt khái niệm: genome, genome nhân, genome ti thể, genome lạp thể Đặc điểm vật chất di truyền Virut, Prokaryot, Eukaryot Vấn đề cấu trúc hệ gene ti thể Những ứng dụng nghiên cứu hệ gene ti thể trồng người Đặc điểm cấu trúc chức ADN ARN Cơ chế tái ADN Tái ADN Virut, Prokaryot, Eukaryot Tái ADN tái ADN lại cần phải có primer? Tại primer trình tự ARN? Đặc điểm chế phiên mã Prokaryot, Eukaryot Vấn đề phiên mã 23 ngược ứng dụng thực tiễn 24 ... PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ .16 2 Lời nói đầu Sinh học phân tử đại phát triển mạnh trở thành nịng cốt Cơng nghệ sinh học Ở Việt Nam, thành tựu nghiên cứu Sinh học phân tử áp dụng kĩ thuật phân. .. 10 9 §2 VECTOR 11 1 §3 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ 12 2 THẢO LUẬN 12 5 Chương 9: PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE 12 6 ? ?1 PHÂN... môn Sinh học đại, giảng dạy nhiều trường đại học có đóng góp định đào tạo lớp người có tri thức Cơng nghệ sinh học góp phần vào nghiệp Cơng nghiệp hố, đại hoá Cơ sở phương pháp Sinh học phân tử