Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 20 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường. Bài 4. Định lượng Bacillus cereus 4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5 0 C – 50 0 C, tối ưu ở 35 0 C – 40 0 C; pH dao động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn. 4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng nh ấ t b ằ ng Stomacher, đ ộ pha loãng 10 -1 Pha loãng đến các độ pha loãng 10 - 2 , 10 - 3 Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch MYP, ủ ở 30 0 C, 24 gi ờ Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc) cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 30 0 C, 24 giờ Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên men glucose, th ử nghi ệ m VP. Kết luận B. cereus Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 21 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com 4.3 Cách tiến hành và tính kết quả Mẫu phân tích: tôm khô, khối lượng 50g cho 1 lớp Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú BPW (Buffered Pepton Water) Pepton: 10g NaCl : 5g Na 2 HPO 4 : 3.5g KH 2 PO 4 : 1.5g 1000 ml nước cất pH 7.2 ± 0.2 Phân phối cho mỗi tổ 50ml BPW trước khi khử trùng. (buổi 4) MYP (Mannitol-Egg Yolk-Polymycin) Môi trường cơ bản Cao thịt: 1g Pepton: 10g Mannitol: 10g NaCl: 10g Phenol red (1% trong ethanol 90%): 2.5ml Agar: 15g Nước cất: 900 ml Dung dịch Polymixin 0.1% Hòa tan 500 000 đơn vị polymixin B sulfate trong 50ml nước cất. Lọc vô trùng và cất trong tối 4 0 C cho đến khi dùng. Egg yolk emulsion 50% (sản phẩm thương mại) Môi trường cuối cùng Môi trường cơ bản: 225ml (ở 50 0 C) Dung dịch Polymixin B: Môi trường cơ bản đem khử trùng, để nguội 50 0 C. Sau đó trộn các thành phần còn lại Phân phối 100ml MYP cho mỗi tổ (12.5ml/petri). (buổi 4) Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 22 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com 2.5ml Egg yolk emulsion (lòng đỏ trứng): 12.5ml PRG (Phenol Red Glucose Broth) Proteose peptone No. 3: 10 g NaCl: 5 g Beef extract (optional): 1 g Dextrose: 5 g Phenol red (7.2 ml of 0.25% solution): 0.018 g 1000 ml nước cất pH 7.4 ± 0.2 Phân phối 30ml PRG cho mỗi tổ (3ml/ống nghiệm) (buổi 4) MR-VP Both (Glucose Phosphate) Môi trường 1: Buffered peptone-water powder: 7g Glucose: 5g K 2 HPO 4 : 5g Môi trường 2: Casein Pancreatic Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g pH 6.9 ± 0.2 Môi trường 3: Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g pH 7.5 ± 0.2 1000ml nước cất. pH 6.9 ± 0.2 Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân phối 10ml/ống nghiệm. Kiểm tra lại môi trường cung cấp nào để pha môi trường. (buổi 4) Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 23 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 121 0 C trong 15 phút. Bước 3: Pha loãng mẫu Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường BPW đồng nhất để có độ pha loãng 10 -1 , đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút. Mẫu tiếp tục pha loãng thành 10 -2 , 10 -3 . Bước 4: Phát hiện bằng môi trường chọn lọc Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng trên môi trường thạch MYP, ủ ở 30 0 C, 24 giờ. Do B. cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B. cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa chứng tỏ lecithinase được tạo thành. Chọn 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định. Bước 5: Các thử nghiệm khẳng định - Nhuộm Gram: nhỏ 1 giọt nước cất lên phiến kính sạch; dùng que cấy vòng lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn chuyển vào giọt nước trên phiến kính, khuấy nhẹ. Cố định vệt bôi trên phiến kính bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ vài giọt methyl violet lên vệt bôi, giữ yên 20 giây. Rửa sạch phẩm nhuộm bằng nước. Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I 2 lên vệt bôi, để yên 1 phút. Rửa bằng cồn 95% đến vừa mất màu. Rửa lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch safranin 30 giây. Rửa sạch bằng nước. Thấm nước dư bằng giấy lọc. Quan sát vi khuẩn bằng vật kính 100X nhúng trong dầu, Gram dương có màu xanh tía, Gram âm có màu đỏ hồng. - Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh PRG, ủ ở 35 0 C, 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Lắc ống nghiệm thật mạnh và quan sát sự phát triển thông qua độ đục và sự chuyển màu từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sự sinh acid từ glucose trong điều kiện kỵ khí. Hình 18: khuẩn lạc B. cereus trên MYP Hình 19: nhuộm gram B. cereus Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 24 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com - Thử nghiệm VP (xem bài 3) Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm. Hình 20: thử nghiệm lên men glucose. Ống a: đối chứng. Ống b: không lên men glucose. Ống c: lên men yếu. Ống d: lên men m ạ nh. . Page | 24 Homepage: http://lethuylinh.weebly.com - Thử nghiệm VP (xem bài 3) Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Vi khuẩn. hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này. khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm.