Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa và phôi vô tính từ nuôi cấy noãn ở một số giống cây ăn quả có múi
NGHIÊN CỨU TẠO MƠ SẸO PHƠI HỐ VÀ PHƠI VƠ TÍNH TỪ NI CẤY NỖN Ở MỘT SỐ GIỐNG CÂY ĂN QUẢ CĨ MÚI Hà Thị Th 1 , Trần Thị Hạnh 1 ,Nguyễn Hồng Chiên 1 , Đỗ Năng Vịnh 1 , Vũ Văn Vụ 2 1 Viện di truyền nơng nghiệp, 2 Đại học Quốc gia Hà Nội I. Đặt vấn đề: Hiện nay, ni cấy mơ sẹo phơi hố (ký hiệu EC - embryogenic callus) là một kỹ thuật cơ bản trong tạo giống citrus. Callus phơi hố đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu phát sinh hình thái phơi vơ tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng, ni cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể (Grosser et al, 2000), nghiên cứu chuyển gen và bảo quản nguồn gen (Kunitake and Mu, 1995).Tái sinh cây từ mơ sẹo phơi hố ở các giống cam, Grosser và cộng sự đã tạo ra nhiều dạng đột biến ổn định, như chín sớm hoặc muộn hơn, khơng hạt, chất lượng được nâng cao (Grosser et al., 2000). Để tạo callus phơi hố có nguồn gốc từ phơi tâm (Nucellar) in vitro ở citrus người ta có thể ni cấy nỗn đã thụ tinh hoặc chưa thụ tinh. Callus phơi hố còn được tạo ra khi ni cấy các hạt lép của quả chín từ 8 đến 15 tháng tuổi kể từ khi hoa tung phấn (Starrantino and Russo, 1980). Ngồi ra callus phơi hố đã được tạo ra từ ni cấy mơ hoặc cơ quan khác như từ bao phấn (Hidaka and Omura, 1989), từ chân nhuỵ cái (Style) ở chanh tây (Limon). Carimi và cộng sự đã nghiên cứu ni cấy đầu nhuỵ cái (Stigma) và chân nhị cái (Style) của nhiều giống citrus khác nhau để tạo callus phơi hố và tái sinh cây (Carimi et al., 1995; De Pasquale et al. 1994). Kết quả cho thấy các lồi C.limon, C.medica và Cam ngọt cho kết quả tạo callus và tái sinh phơi tốt nhất. Mục tiêu nghiên cứu của chúng tơi là xây dựng quy trình tạo nguồn mơ sẹo phơi hố, từ đó tạo phơi vơ tính và tái sinh cây phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống khơng hạt và vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai. II. Nguyên liệu và phương pháp: a/ Nguyên liệu: Các giống cây ăn quả có múi địa phương và nhập nội khác nhau như: Bưởi Phúc Trạch (Citrus grandis), Cam Vân Du, Olinda Valencia, Navel, Cam Sành (C. nobilis), Quýt Chum, Quýt Đường canh (C. reticulata) và quýt lai Murcott đã được sử dụng trong nghiên cứu. Mẫu nuôi cấy: noãn trước và sau thụ phấn ở các độ tuổi khác nhau (từ 1 đến 8 tuần tuổi). Cách làm như sau: Bầu nhuỵ lấy nuôi cấy một ngày trước khi hoa nở. Sau khi hoa được thụ phấn, nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành quả non. Quả non của các giống trên được thu hái ở 1, 2, 3, đến 8 tuần tuổi kể từ sau khi hoa tung phấn. Từ bầu nhuỵ cái và quả non đã được khử trùng, tách lấy noãn (noãn sau thụ phấn phát triển thành hạt non) để nuôi cấy trên các môi trường khác nhau. Nỗn được ni cấy trên đĩa Petri, mỗi đĩa chứa 16 nỗn. Mỗi lơ thí nghiệm với 60 quả hoặc bầu nhuỵ. Riêng với quả non có độ tuổi 6, 7, 8 tuần, chúng tơi tiến hành tách bỏ vỏ lụa ở bên ngồi của hạt non, sau đó tách loại bỏ phơi non rồi mới cấy vào đĩa mơi trường. Tất cả các thao tác trên được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi. b/ Mơi trường và điều kiện ni cấy ni cấy: Theo kết quả nghiên cứu ni cấy bầu nhuỵ và nỗn ở quả non của một số giống citrus thì mơi trường MT (Murashige & Tucker) là mơi trường thích hợp nhất cho tạo callus phơi hố (Đỗ Năng Vịnh, 2002). Vì vậy chúng tơi tiến hành thí nghiệm ni cấy nỗn và hạt non trên nền mơi trường này. +Mơi trường tạo callus phơi hố: - MT + các nồng độ khác nhau của Kinetine: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 ( mg/l) + 500mg/l Malt extract + 50g/l đường + 5,0g/l thạch. - MT + các nồng độ khác nhau của BAP: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 (mg/l) + 500mg/l Malt extract + 50g/l đường + 5,0g/l thạch. + Mơi trường lỏng lắc nhân sinh khối callus phơi hố: MT + BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) + 30g/l đường + 500mg/l Malt extract + 1,0g/l glutamin + Mơi trường tạo phơi: • G1: MT + 1,0mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch • G2: MT + 1,5mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch • BG: MT + 1,0mg/l GA3 + 0,2mg/l BAP + 5,0g/l thạch + Mơi trường nẩy mầm phơi vơ tính: MS hoặc MT + 30g/l đường, khơng có chất điều hồ sinh trưởng. Mơi trường được chỉnh đến pH= 5,8. Nỗn được ni trên đĩa petri (15mm dày x 60mm đường kính) chứa 12 ml mơi trường thạch, để trong tối. Nhân mô sẹo phôi hoá: mô sẹo được nhân trên môi trường đặc (thời gian 1tháng), sau đó chuyển sang môi trường lỏng ( 2 tuần ) rồi lại nhân tiếp trên môi trường đặc. Nhân mô sẹo trong tối ở nhiệt độ (25 - 27 o C). Quá trình phôi hoá của mô sẹo và nảy mầm của phôi xảy ra trong điều kiện có chiếu sáng 2400 Lx và thời gian chiếu sáng là 8 h/ngày. III. Kết quả và thảo luận 1.Tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng Để tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng, chúng tôi tiến hành khử trùng quả non với hai loại hoá chất Ca(ClO) 2 ở nồng độ 6% và HgCl 2 ở nồng độ 0,01%. Kết quả cho thấy với các chất khử trùng khác nhau và trong khoảng thời gian khác nhau thì tỉ lệ tạo mẫu sạch là khác nhau. Khử trùng bằng Ca(ClO) 2 ở nồng độ 6% trong thời gian 10 và 15 phút cho tỉ lệ mẫu sạch tương ứng là 62,4% và 87,8%. Khử trùng bằng HgCl 2 nồng độ 0,01% trong thời gian 5 và 10 phút, tỉ lệ tạo mẫu sạch tương ứng là 65,5% và 93%. Như vậy, khử trùng bằng HgCl 2 cho tỉ lệ mẫu sạch rất cao nhưng sau đó mẫu nhanh chóng bị thâm đen. Hiện tượng này không thấy xuất hiện khi khử trùng bằng Ca(ClO) 2 . Vì vậy chúng tôi đã chọn chất khử trùng thích hợp cho quả non là Hypoclorit canxi - Ca(ClO) 2 ở nồng độ 6% trong thời gian 15 phút. 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi noãn bầu nhuỵ trước và sau thụ phấn lên khả năng tạo callus phôi hoá(EC). Trước khi hoa nở 1-2 ngày (trước khi thụ phấn) noãn được tách ra để nuôi cấy. Sau khi hoa được thụ phấn, cánh hoa và nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành quả non. Kích thước của noãn tăng dần, sự tăng kích thước là kết quả của quá trình phân bào xảy ra ở các mô khác nhau, trong đó có lớp tế bào phôi tâm (nucellar), phôi hữu tính nhị bội và nội nhũ tam bội thể. Kết quả noãn phát triển thành hạt non. Sau khoảng 2-5 tháng nuôi cấy, chúng tôi quan sát phản ứng tạo callus phôi hoá từ noãn và hạt non ở các giống khác nhau. Đối với nuôi cấy noãn trước thụ phấn, chúng tôi chỉ thu được callus dạng cứng, màu vàng mà không thu được callus phôi hoá ở tất cả các giống. Đối với hạt non (từ quả non) có độ tuổi từ 1-8 tuần tuổi, chúng tôi đã thu được callus phôi hoá ở các giống cam Vân du, cam Sành, quýt Đường canh và quýt Chum. Riêng với giống bưởi Phúc Trạch, chúng tôi chưa thành công trong việc tạo callus phôi hoá mà chỉ thu được dạng callus cứng, màu vàng trắng. Mô sẹo phôi hoá tạo được từ noãn (hoặc noãn đã được phân hoá thành hạt non) đã được nhiều tác giả khẳng định là có nguồn gốc từ mô phôi tâm (Buttton and Bornman,1971; Gmitter and Moore,1986). Trong một số trường hợp, mô sẹo phôi hoá đã được tạo ra từ nội nhũ,tuy nhiên tỷ lệ cây tái sinh từ nội nhũ hạt non rất thấp (Gmitter et al.,1991). Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm ở các giống khác nhau, kết quả thu được được thể hiện ở bảng 1, Biểu đồ 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy lên sự phát sinh callus phôi hoá Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy lên sự phát sinh callus Hình ảnh các dạng mô sẹo nhận được từ nuôi cấy mô noãn sau thụ phấn từ 1-8 tuần tuổi Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 6 đối với cam Vân Du (12,5%) và rất thấp ở các độ tuổi 3 (0,9%), tuổi 1 (1,3%), tuổi 2 (1,7%), tuổi 4 (1,35%) và tuổi 5 (1,46) ; Với Cam Sành tỉ lệ tạo mô sẹo phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 2 (35,5%) và thấp nhất ở tuổi 3, 4 (tương ứng là 3,6%; 4,2%); ở quýt Chum tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 1 (58,2%) và thấp nhất ở tuổi 8 (5,6%); Cũng giống như quýt Chum, ở quýt Đường Canh tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 1 (63,5%), tỉ lệ này cũng khá cao ở tuổi 7 và tuổi 8 (56,7% và 59,5%). [...]... 7) Trên môi trường G2 và BG, phôi vô tính thu được có dạng cụm phôi, nhiều lá mầm và phát sinh nhiều dạng hình thái phôi không rõ ràng (Ảnh 8) Việc nghiên cứu tạo ra tính đồng nhất của mô sẹo phôi hoá và những điều kiện môi trường tối ưu để tạo hàng loạt phôi vô tính có độ đồng đều cao từ các giống citrus khác nhau cần được tiếp tục nghiên cứu 6 Nghiên cứu sự nảy mầm của phôi vô tính Phôi vô tính thu... hoá thu nhận từ nuôi cấy trên môi trường đặc và môi trường lỏng của các giống đã được chuyển vào môi trường tạo phôi Sau khoảng 2 tháng chúng tôi nhận được phôi vô tính có lá mầm phát triển Một số phôi có cấu trúc tương tự như phôi 2 lá mầm của hạt hữu tính Với hai giống cam Vân du và N14-N10, môi trường tạo phôi thích hợp nhất là môi trường G1 ở môi trường này, phôi vô tính thu được có dạng hai lá... mạnh,chỉ có một rễ ở mỗi phôi (ảnh 9 và 10) .Cây con ra vườn ươm đạt tỷ lệ sống trên 90 % IV Kết luận: Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu ở trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1 Tỷ lệ tạo callus phôi hoá từ nuôi cấy noãn và hạt non phụ thuộc vào tuổi quả Cam Vân Du ở 6 tuần tuổi, cam Sành 2 tuần tuổi, quýt Chum và quýt Đường Canh ở tuần tuổi 1,7 và 8 cho tỷ lệ tạo callus phôi hoá cao nhất Đối với noãn. .. được từ hai giống cam Vân du và N14-10 được cấy trên hai loại môi trường cơ bản MS và MT không có phytohormon để phôi nảy mầm thành cây con Sau 15 ngày, chúng tôi thu được kết quả như sau: trên môi trường MT phôi có tạo rễ nhưng rễ vẫn còn ngắn và có dạng cụm rễ Với dạng rễ như thế, ở cam quýt, cây sẽ khó sống khi đem ra trồng ở vườn ươm Ngược lại, trên môi trường MS phôi ra rễ rất nhanh và sớm tạo cây. .. cho phép tạo ra khối lượng lớn sinh khối mô sẹo phôi hoá đồng nhất trong thời gian ngắn .Nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc cho thấy Môi trường MT bổ sung Malt extract 500mg/l, đường 3%, và BAP thích hợp với nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá.Tuy nhiên các giống khác nhau thích hợp với các nồng độ khác nhau của BAP 4 Nghiên cứu tạo phôi vô tính từ callus phôi hoá ở các giống khác nhau Callus phôi hoá... BAP ở nồng độ cao (2mg/l), tuy nhiên, quýt Chum và quýt Đường canh lại thích hợp ở nồng độ thấp hơn Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của Kinetine đến tỉ lệ tạo callus phôi hoá ở các giống khác nhau Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của BAP đến tỉ lệ tạo callus phôi hoá ở các giống khác nhau 4 Nghiên cứu quy trình nhân sinh khối callus phôi hoá bằng nuôi cấy lỏng lắc Mô sẹo thường có biểu hiện lão hoá khá nhanh khi nuôi cấy. .. trưởng đối với tạo callus phôi hoá ở một số giống citrus Môi trường MT được nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở cây ăn quả có múi (Murashige and Tucker, 1969; Gmitter et al.,1990; Kunitake and Mu,1995) Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với hai loại phytohormon khác nhau là Kinetine và BAP ở các nồng độ khác nhau để tìm ra chủng loại và nồng độ phytohormon thích hợp nhất cho việc tạo. .. 3%, và BAP thích hợp với nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi hoá.Tuy nhiên các giống khác nhau thích hợp với các nồng độ khác nhau của BAP 4 Callus phôi hoá có xu hướng tạo phôi vô tính trên môi trường có hàm lượng BAP thấp Trên môi trường có BAP nồng độ cao hơn các phôi có xu hướng phát triển không bình thường 5 Phôi vô tính với lá mầm phát triển đã nảy mầm thành cây con khoẻ mạnh khi được nuôi cấy trên... tỉ lệ tạo callus phôi hoá cao hơn so với Kinetine ở cả 4 giống trên Tỉ lệ tạo callus phôi hoá cao nhất là ở giống quýt Đường canh 33,2% (ở nồng độ 0,5mg/l BAP); tiếp đó là các giống cam Vân du 31,9% (2,0mg/l BAP), cam Sành 29,3% (2,0mg/l BAP), quýt Chum 27,6% (1,0mg/l BAP) Điều này cho thấy BAP là loại phytohormon thích hợp cho việc tạo callus phôi hoá ở một số giống citrus Các giống cam Vân du và cam... nồng độ phytohormon thích hợp nhất cho việc tạo callus phôi hoá ở các giống khác nhau Kết quả thí nghiệm được trình bày ở biểu đồ 2 và 3 Kết quả cho thấy Kinetine có hiệu quả tương đối thấp lên quá trình tạo callus phôi hoá ở cả 4 giống trên Tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất mới là 15,3% (nồng độ 2,0mg/l K) ở giống quýt Đường canh Với các giống còn lại tỉ lệ này còn thấp hơn: cam Vân du 9,5% (nồng . với tạo callus phôi hoá ở một số giống citrus. Môi trường MT được nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở cây ăn quả có múi (Murashige. 4. Nghiên cứu tạo phôi vô tính từ callus phôi hoá ở các giống khác nhau. Callus phôi hoá thu nhận từ nuôi cấy trên môi trường đặc và môi trường