XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI Tóm Tắt Mở đầu: Tám kiểu gen siêu vi viêm gan B (HBV) xác định (Từ A đến H) dựa vào khác % gen HBV, phân bố kiểu gen khác châu lục, nước khác Việc xác định kiểu gen HBV ngày quan tâm kiểu gen HBV có liên quan đến biểu triệu chứng lâm sàng, diễn tiến bệnh đáp ứng với điều trị viêm gan siêu vi B Bên cạnh đó, vấn đề phát đột biến kháng thuốc, đặc biệt đột biến kháng Lamivudine điều trị HBV giữ vai trò quan trọng để từ có lựa chọn thuốc hiệu điều trị viêm gan siêu vi B Mục tiêu phương pháp: Chúng ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) hệ thống OpenGene với thuốc thử TruGene (Bayer) việc xác định kiểu gen đột biến kháng thuốc Lamivudine công bố HBV Trong thời gian từ tháng 8/2004 đến tháng 5/2006, phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, chúng tơi thực giải trình tự chuỗi cho 122 trường hợp bệnh nhân Việt Nam viêm gan siêu vi B mãn tính điều trị Lamivudine Kết quả: Nam chiếm 97 trường hợp (79,5%), nữ 25 trường hợp (20,5%), với tuổi trung bình bệnh nhân 33,9 ± 10,4 Tất trường hợp HBVDNA [+], HBeAg [+] 100 trường hợp (82,0%) HBeAg [-] 22 trường hợp (18,0 %) Chỉ có kiểu gen HBV kiểu gen B C, kiểu gen B 76 trường hợp (62,3 %) kiểu gen C 46 trường hợp (37,7 %) Tổng cộng có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng Lamivudine, tỷ lệ kiểu đột biến sau: L180M & M204I (11,5%); L180M & M204V (36,1%); L180M, M204V & V173L (0,8%); L180M, M204V & V207I (0,8%); M204I (12,3%); M204I & V207I (0,8%); M204V (1,6%) Trong 76 trường hợp kiểu gen B có 49 trường hợp (64,5%) có đột biến kháng Lamivudine, 46 trường hợp kiểu gen C có 29 trường hợp (63,0%) có đột biến kháng Lamivudine Tất bệnh nhân điều trị Lamivudine với thời gian điều trị trung bình 2,5 ± 0,9 năm với số trường hợp tương ứng cho điều trị 1, 2, 3, năm 18, 41, 45, 18 trường hợp Tỷ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau 1, 2, 3, năm điều trị Lamivudine 27,8%; 63,4%; 71,1%; 83,3% Kết luận: Qua kết bước đầu đạt thấy kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ vai trị quan trọng việc xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B việc nhận diện đột biến kháng thuốc Lamivudine để từ có phác đồ điều trị tối ưu ABSTRACT APPLYING SEQUENCING TO IDENTIFY HEPATITIS B VIRUS GENOTYPES AND Background: Hepatitis B Virus (HBV) can be classified into genotypes A through H based on an intergroup divergence of 8% or more in the complete nucleotide sequence, and the different distribution of various genotypes in different continents, countries The identification of HBV genotypes are more concerned as it is HBV genotypes relating to clinical manifestation, activity of liver disease as well as treatment responses of Hepatitis B Additionally, the discovery of resistance to medicines in HBV treatment plays a very important role from which we can have an appropriate and effective choice in Hepatitis B treatment Objective and methods: We have applied the Sequencing by OpenGene system with Trugene HBV Genotyping kit (Bayer) to identify Hepatitis B Virus Genotypes and Lamivudine – resistant mutation From August 2004 to May 2006, in MEDIC laboratory, we have implemented sequencing for 122 cases Vietnamese with Chronic Hepatitis B on Lamivudine treatment Results: 97 cases are males (take 79.5%) and 25 cases are females (take 20.5%), medium age: 33.9±10.4 All cases are HBVDNA [+] in which: 100 cases are HBeAg [+] (82.0%) and 22 cases are HBeAg [-] (18.0%) There are only two genotypes of HBV: genotype B and genotype C, in which 76 cases are genotypes B (62.3%) and 46 cases are genotype C (37.7%) Totally there are 78 cases (63.9%) mutations with following established proportion and types: L180M & M204I (11.5%); L180M & M204V (36.1%); L180M, M204V & V173L (0.8%); L180M, M204V & V207I (0.8%); M204I (12.3%); M204I&V207I (0.8%); M204V (1.6%) There are 49 cases mutations in 76 cases of genotypes B (64.5%) and 29 cases in 46 cases of genotypes C (63.0%) All patients are on Lamivudine treatment with average time is 2.5±0.9 years, the corresponding number of patients in treatment period of 1, 2, 3, year are 18, 41, 45, 18 The proportion of developing mutations after 1, 2, 3, years of treatment with Lamivudine is 27.8%; 63.4%; 71.1%; 83.3% Conclusions: We have found that - with above preliminary results the sequencing plays a very important role in identifying Hepatitis B Virus Genotypes and Mutations From those results we can approach an optimal treatment course Đặt vấn đe Những tiến điều trị viêm gan siêu vi B (HBV) góp phần đáng kể việc hạn chế biến chứng bệnh Cho đến có loại thuốc điều trị HBV FDA (Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm Mỹ) công nhận Interferone, Lamivudine, Adefovir Entecavir1,6,7,10,17, Lamivudine xem thuốc uống lựa chọn Tuy nhiên q trình điều trị Lamivudine có vấn đề phát sinh: Vấn đề đột biến kháng Lamivudine HBV, tỉ lệ đột biến kháng xảy ngày cao tăng theo thời gian dùng thuốc Lamivudine1,6,18,19 Một vấn đề ngày quan tâm kiểu gen HBV (HBV Genotype) Khác với kiểu gen siêu vi viêm gan C (HCV) có vai trị quan trọng việc đánh giá điều trị đặc hiệu vai trị kiểu gen HBV chưa rõ ràng Sự phân bố kiểu gen HBV thay đổi tùy theo vùng địa dư, châu lục hay nước có kiểu gen vượt trội khác nhau4,8 Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử dùng để xác định đột biến kháng thuốc HBV xác định kiểu gen HBV Chúng sử dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) để đồng thời vừa xác định đột biến kháng thuốc Lamivudine HBV vừa xác định kiểu gen HBV, khảo sát kiểu gen vượt trội người Việt Nam đánh giá loại tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị Lamivudine Mục tiêu nghiên cứu là: (1) Xác định kiểu gen HBV bệnh nhân Việt Nam; (2) Khảo sát kiểu đột biến tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine bệnh nhân điều trị Lamivudine liên tục Đối tượng - phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân người Việt Nam, chẩn đoán viêm gan siêu vi B mãn tính điều trị liên tục Lamivudine Các bệnh nhân chia làm nhóm với thời gian điều trị liên tục Lamivudine tương ứng 1, 2, 3, năm Có xét nghiệm HBVDNA dương tính Khơng bị đồng nhiễm siêu vi viêm gan C Kỹ thuật thực Kỹ thuật giải trình tự chuỗi Huyết bệnh nhân tách lưu ống mẫu tinh sạch, mẫu chưa thực lưu nhiệt độ – 200C DNA HBV tách chiết theo nguyên tắc hấp thụ hạt Silicate (Phương pháp BOOM) rửa Ethanol 70% Thực phản ứng trùng hợp chuỗi (PCR) thuốc thử TruGene HBV Genotyping (Bayer), máy luân nhiệt Bio-Rad theo hướng dẫn nhà sản xuất Sau kiểm tra có sản phẩm khuếch đại (Amplicons) điện di thạch Agarose tiếp tục thực phản ứng cắt đoạn (Clip reaction) theo hướng dẫn nhà sản xuất máy luân nhiệt, tiếp tục thực điện di thạch Acrylamide với hệ thống OpenGene Tín hiệu tự động thu nhận từ hệ thống điện di phần mềm máy tính xếp trình tự chuỗi mẫu, trình tự chuỗi so sánh với thư viện gen (Gene Librarian) có sẵn cung cấp nhà sản xuất (Bayer) Kết thu nhận kiểu gen HBV đột biến kháng Lamivudine công bố HBeAg Kỹ thuật thực theo phương pháp điện hóa phát quang, thuốc thử hãng Abbott, thực máy Architect (Abbott) Phương pháp nghiên cứu Cắt ngang Thống ke Phần mềm SPSS for Win, Ver 7.5 Kết qua Tổng số có 122 trường hợp thực giải trình tự chuỗi: - Tuổi nhỏ 10, lớn 63 với độ tuổi trung bình 33,9 ± 10,4 - Nam có 97 trường hợp chiếm 79,5% nữ có 25 trường hợp chiếm 20,5% Kiểu gen HBV 122 trường hợp: Chỉ có kiểu gen HBV xác định kiểu gen B C Trong kiểu gen B 76 trường hợp (62,3%) kiểu gen C 46 trường hợp (37,7%) Kết HBeAg Tất 122 trường hợp có HBVDNA dương tính, HBeAg âm tính 22 trường hợp (18%) HBeAg dương tính 100 trường hợp (82%) Kết HBeAg kiểu gen khác ghi nhận Bảng Tỉ lệ HBeAg kiểu gen B, C Kiểu gen B Số lượng Kiểu gen C Số Phần trăm lượng Phần trăm HBeAg 12 15,8% 10 21,7% 64 84,2% 36 78,3% âm tính HBeAg dương tính Kiểu gen HBV đột biến kháng Lamivudine Bảng Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine kiểu gen HBV Kiểu gen B Kiểu gen C Số Số % lượng Không Phần trăm lượng 27 35,5% 17 37% 49 64,5% 29 63% có đột biến kháng Lamivudine Có đột biến kháng Lamivudine Các kiểu đột biến kháng Lamivudine tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị Tổng cộng có 78 (63,9%) trường hợp có đột biến kháng Lamivudine Bảng Tỷ lệ loại đột biến kháng Lamivudine tỉ lệ phần trăm L L1 L1 L1 oại đột 80M, 80M, biến 80M, M M204V M204V M204V M204I 80M, L1 204I M 204I, M 204V V207I & V173L & V207I S 14 44 1 15 T 11, 36, 0.8 0,8 12 0, 1,6 ố lượng ỉ lệ % ,3 Ghi chú: L (Leucine); M (Methionine); I (Isoleucine); V (Valine) Có nhóm bệnh nhân khảo sát dựa thời gian điều trị Lamivudine, số lượng bệnh nhân sau 1, 2, 3, năm điều trị Lamivudine tương ứng 18, 41, 45, 18 trường hợp Thời gian điều trị Lamivudine trung bình 2,5 ± 0,9 năm Bảng Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine thời gian điều trị Lamivudine năm năm năm năm S S S S Ph ố Ph ố ần trăm lượng Ph ố ần trăm lượng Ph ố ần trăm lượng ần trăm lượng Kh ơng có đột biến kháng Lamivudi ne 2% 72, 6% 36, 9% 28, 16, 7% Có đột biến 27, kháng 8% 4% 63, 1% 71, 83, 3% Lamivudi ne Bàn luận Kiểu gen HBV Có cách phân loại HBV Kiểu huyết (Serotype) kiểu gen (Genotype) Trước người ta phân HBV thành kiểu huyết adr, adw, ayr ayw dựa vào kháng nguyên kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg) Tuy nhiên ý nghĩa kiểu huyết chưa nghiên cứu nhiều Với phát triển sinh học phân tử, ngày người ta phân loại HBV dựa vào nghiên cứu gen HBV phân HBV thành loại đặt tên từ A đến H dựa vào khác 8% tồn bộ gen HBV4,6,8 Có nhiều kỹ thuật dùng để xác định kiểu gen HBV8,13 kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing), đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP), phản ứng lai đoạn dò (LiPA), phản ứng trùng hợp chuỗi với đoạn mồi đặc hiệu (PCR with Specific Primers), phản ứng miễn dịch gắn men (Enzyme-linked immunoassay) Kỹ thuật dùng để xác định kiểu gen HBV kỹ thuật giải trình tự chuỗi bên cạnh việc xác định kiểu gen HBV cịn tìm đột biến kháng Lamivudine lần thực giải trình tự chuỗi Vai trị kiểu gen HBV chưa nghiên cứu nhiều có nhiều nghiên cứu với số liệu nhỏ, rãi rác công bố với kết không phù hợp nhau, điều khác với vai trò kiểu gen HCV vấn đề điều trị viêm gan siêu vi C4,11,23 Kiểu gen HBV phân bố châu lục vùng lãnh thổ khác khác Kiểu gen HBV chủ yếu Đông Nam Á kiểu gen B C4,14, điều phù hợp với kết với 122 trường hợp thực giải trình tự chuỗi có 76 trường hợp (62,3%) kiểu gen B 46 trường hợp (37,7%) kiểu gen C Trong 122 trường hợp thực giải trình tự chuỗi (HBV DNA dương tính) chúng tơi ghi nhận HBeAg âm tính 22 trường hợp (18%) HBeAg dương tính 100 trường hợp (82%) Có vài nghiên cứu công bố cho thấy kiểu gen B HBV có thải trừ HBeAg cao so với kiểu gen C4,5,16 Tuy nhiên kết chúng tơi (Bảng 1) khơng có khác biệt rõ rệt tỉ lệ HBeAg âm tính kiểu gen B C (15,8% 21,7%) Vai trò kiểu gen HBV diễn tiến bệnh viêm gan siêu vi B nghiên cứu, kết cho thấy kiểu gen C dường làm cho rối loạn chức gan nhiều kiểu gen B kiểu gen C dễ diễn tiến đến xơ gan nhiều kiểu gen B4,6,8,11 Mối liên hệ kiểu gen HBV ung thư tế bào gan ghi nhận: Kiểu gen B thường kết hợp với phát triển ung thư tế bào gan người trẻ tuổi, nghiên cứu khác lại cho thấy kiểu gen C thường kết hợp với ung thư tế bào gan có tỉ lệ tái phát ung thư tế bào gan cao sau phẫu thuật cắt bỏ ung thư tế bào gan so với kiểu gen B4,6,15 Anh hưởng kiểu gen HBV với đáp ứng điều trị Lamivudine chưa nghiên cứu nhiều, nghiên cứu cho thấy dường bệnh nhân kiểu gen B dễ phát triển đột biến kháng Lamivudine kiểu gen khác4, kiểu gen D có đột biến kháng Lamivudine cao kiểu gen A2 Kết chúng tơi ghi nhận (Bảng 2) tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine kiểu gen B (64,5%) kiểu gen C (63%) gần Do vấn đề ảnh hưởng kiểu gen HBV cần phải nghiên cứu lâu dài số lượng bệnh nhân nhiều Các kiểu tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine bệnh nhân điều trị Lamivudine Lamivudine thuốc uống lựa chọn điều trị viêm gan siêu vi B mãn tính có nhiều ưu điểm giá thành chấp nhận được, an tồn, tác dụng phụ, dễ sử dụng (Dùng đường uống), nhiên có nhược điểm mà ngày nhiều người quan tâm vấn đề đột biến kháng Lamivudine siêu vi viêm gan B tỉ lệ đột biến kháng thuốc Lamivudine tăng theo thời gian sử dụng Lamivudine Vị trí đột biến kháng Lamivudine xảy vùng C (Domain C) đoạn gen chép ngược (RT: Reverse Transcriptase) HBV chủ yếu kiểu YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate), Methionine thay Valine, Isoleucine Serine (Đột biến rtM204V/I/S) Những đột biến khác liên quan đến kháng Lamivudine đột biến thay Leucine thành Methionine vùng B (Domain B) đột biến rtL180M; Đột biến V173L; Đột biến V207I3,9,12,19,20,21,24 Trong 122 trường hợp giải trình tự chuỗi có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng Lamivudine Có nhiều kiểu đột biến kháng Lamivudine, chủ yếu đột biến vị trí 204 có kèm không đột biến rtL180M, V173L, V207I Kết chúng tơi cho thấy có nhiều dạng đột biến kháng Lamivudine (Bảng 3) chiếm nhiều đột biến rtL180M M204V (36,1%) Lamivudine dùng điều trị viêm gan siêu vi B thường với thời gian điều trị kéo dài, tối thiểu phải năm Nhiều nghiên cứu công bố cho thấy tỉ lệ xuất đột biến kháng Lamivudine HBV lại tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine Theo Guan R cộng sự, tỉ lệ xuất đột biến kháng Lamivudine sau năm điều trị Lamivudine 14%, tỉ lệ tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine 38%, 49%, 66% 69% tương ứng với thời gian điều trị Lamivudine 2, 3, 4, năm1 Một nghiên cứu khác T-T Chang cộng cho thấy tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine sau năm điều trị Lamivudine 17%, tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine 2, 3, năm tương ứng 40%, 57%, 67%22 Kết khảo sát tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine nhóm bệnh nhân có điều trị liên tục Lamivudine với nhóm thời gian điều trị khác (Bảng 4) cho thấy tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau năm điều trị Lamivudine 27,8%, tỉ lệ tăng dần theo nhóm có thời gian điều trị Lamivudine tăng dần 2, 3, năm 63,4%, 71,1% 83,3% So sánh với cơng trình cơng bố thấy tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau thời gian điều trị Lamivudine nghiên cứu cao Có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng đến việc xuất đột biến kháng Lamivudine trình điều trị, nhiên có yếu tố quan trọng làm cho tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine cao vấn đề sử dụng thuốc Lamivudine có theo hướng dẫn bác sĩ điều trị không, điều trị Lamivudine thành nhiều đợt khác trước bệnh nhân đưa vào nhóm nghiên cứu Kết cho thấy tỉ lệ cao đột biến kháng Lamivudine, việc phát đột biến kháng Lamivudine kịp thời giữ vai trò quan trọng trình điều trị viêm gan siêu vi B Lamivudine để từ thay đổi thuốc điều trị thích hợp nhằm đạt mục tiêu điều trị Kết luận Kiểu gen HBV Việt Nam chủ yếu B C, nhiên vai trò kiểu gen HBV diễn tiến bệnh đáp ứng điều trị chưa biết rõ Các kiểu đột biến kháng Lamivudine nhóm bệnh nhân chúng tơi đa dạng, đặc biệt tỉ lệ đột biến kháng thuốc Lamivudine cao tăng dần theo thời gian dùng thuốc Lamivudine Qua kết bước đầu đạt chúng tơi thấy kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ vai trị quan trọng áp dụng xét nghiệm thường qui việc xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B việc nhận diện đột biến kháng thuốc Lamivudine để từ có phác đồ điều trị tối ưu  ... thuốc HBV xác định kiểu gen HBV Chúng tơi sử dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) để đồng thời vừa xác định đột biến kháng thuốc Lamivudine HBV vừa xác định kiểu gen HBV, khảo sát kiểu. .. 83,3% Kết luận: Qua kết b? ?ớc đầu đạt chúng tơi thấy kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ vai trò quan trọng vi? ??c xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B vi? ??c nhận diện đột biến kháng thuốc Lamivudine để... b? ??nh nhân kiểu gen B dễ phát triển đột biến kháng Lamivudine kiểu gen khác4, kiểu gen D có đột biến kháng Lamivudine cao kiểu gen A2 Kết ghi nhận (B? ??ng 2) tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine kiểu