Đang tải... (xem toàn văn)
Cacao có tên khoa học là Theobroma cacao L., một loại cây nhiệt đới được người Maya trồng cách đây hơn hai ngàn năm. Theobroma cacao L. có nguồn gốc từ Trung Mỹ, ngày nay được trồng phổ biến ở Brazil, Ghana, Indonesia, Malaysia và một số nước ở lưu vực sông Amazone (Juan Carlos Motamayor, 1999).
MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục .v Danh sách các chữ viết tắt viii Danh sách các hình .ix Danh sách các bảng .x 1. MỞ ĐẦU .1 1.1.Đặt vấn đề 2 1.2.Mục đích yêu cầu 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1. Giới thiệu tổng quan về cây cacao 3 2.1.1. Nguồn gốc cây cacao .3 2.1.2. Đặc điểm hình thái .3 2.1.3.Yêu cầu sinh thái 5 2.1.4. Các giống cacao 5 2.1.4. Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài .6 2.2. Qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật .6 2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR 8 2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR .8 2.3.2. Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR .10 2.3.2.1. DNA mẫu 10 2.3.2.2. Taq polymerase 10 2.3.2.3. Primer .11 2.3.2.4. Nhiệt độ bắt cặp .13 2.3.2.5. Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu 14 v 2.3.2.6. Các thành phần khác 14 2.3.2.7. Số lượng chu kỳ phản ứng PCR . 15 2.3.2.8. Thiết bị và dụng cụ trong phản ứng PCR . 15 2.3.3. Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết . 16 2.3.4. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR . 17 2.4. Giới thiệu về phương pháp phân tích trình tự DNA 19 2.5. Giới thiệu về Microsatellite . 20 2.5.1. Khái niệm về Microsatellite 20 2.5.2. Các loại Microsatellite 20 2.5.3. Cơ chế hình thành Microsatellite 21 2.5.4. Vai trò của Microsatellite . 22 2.5.5. Các phương pháp phát hiện Microsatellite . 24 vi 2.5.5.1.Phương pháp lai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 vii 2.5.5.2.Phương pháp PCR 24 2.5.6.Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR . 25 2.5.6.1.Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài . 27 2.5.6.2.Thiết kế primer microsatellite 28 2.5.7.Ưu, khuyết điểm của phương pháp microsatellite so vớ các phương pháp khác . 29 2.5.8. Những ứng dụng của nghiên cứu Microsatellite . 30 2.6. Các công trình nghiên cứu có liên quan . 31 2.6.1. Kiểm tra tính đồng nhất di truyền của Theobroma cacao bằng Microsatellite marker . 31 2.6.2. Nghiên cứu fingerprinting DNA của cacao sử dụng Microsatellite marker 32 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 3.1. Vật liệu . 35 3.1.1. Các giống cacao thí nghiệm 35 3.1.2. Hóa chất thí nghiệm . 37 3.1.2.1. Primer . 37 3.1.2.2. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA 38 3.1.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR 38 3.1.2.4. Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự 38 3.1.3. Thiết bị thí nghiệm 39 3.2. Phương pháp 39 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu . 39 3.2.2. Bố trí thí nghiệm 39 3.2.3. Kỹ thuật ly trích DNA . 41 3.2.4. Kiểm tra định lượng và định tính DNA 42 3.2.4.1.Định tính DNA bằng phương pháp điện di 42 3.2.4.2.Định lượng DNA bằng quang phổ kế .42 3.2.5. Qui trình phản ứng Microsatellite . 42 3.2.5.1.Phản ứng PCR với 1 cặp primer . 42 3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer 43 3.2.6.Điện di sản phẩm PCR 45 viii 3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA 45 3.2.8.Phương pháp nhận diện bằng phần mềm Cervus . 46 3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm Genetix 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1.Sản phẩm DNA li trích 50 4.2.Sản phẩm PCR 51 4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao 52 4.4.Kết quả nhận diện các mẫu được mã hóa 55 4.5. So sánh dữ liệu microsatellite 58 4.6.Kết quả phân tích multiplex PCR . 59 4.7. Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền . 61 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 63 6. PHỤ LỤC 65 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite Al: Allele bp: base pair CT: Cần Thơ CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate ix ICGD: International Cocoa Genebank Database mM: milimolar (milimol/lite) mTcCIR: microsatellite Theobroma cacao CIRAD OD: Optical density. PCR: Polymerase chain reaction pmol: picomol RNA: Ribonucleic acid Rnase: Ribonuclease SSR: Single sequence repeat Ta : Annealing tenperature (nhiệt độ bắt cặp) TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid) Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) U: Đơn vị hoạt tính USDA: United States Department of Agriculture DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Kết quả phân tích fingerprinting .32 Bảng 3.1. Các giống cacao thương mại khảo sát .36 Bảng 3.2. Primer microsatellite 37 Bảng 3.3. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR .43 Bảng 3.4. Qui trình phản ứng PCR 43 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng multiplex PCR .44 x Bảng 3.6: Qui trình phản ứng Multiplex PCR 44 Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích trong phần mềm Cervus .47 Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix 48 Bảng 3.9: Kích thước các al phân tích với mỗi loại primer .49 Bảng 3.10: Số lượng các al phân tích của mỗi quần thể với từng loại primer 49 Bảng 4.1: Dữ liệu Microsatellite với 3 primer 53 Bảng 4.2: Dữ liệu Microsatellite với 2 primer 53 Bảng 4.3: Kết quả nhận diện các mẫu mã hóa 56 Bảng 4.4: Kết quả nhận diện các mẫu mã hóa 57 Bảng 4.5: Kết quả so sánh của giống NA33 58 Bảng 4.6: Kết quả so sánh của giống AMAZ15/15 .58 Bảng 4.7: Kết quả so sánh của giống PA107 59 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 3.1: 6 quần thể với số lượng cá thể tương ứng 49 Biểu đồ 3.2: 5 primer với số lượng al tương ứng 49 Biểu đồ 4.1: Sự đa dạng di truyền của 6 quần thể cacao khảo sát 62 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Theobroma cacao 3 Hình 2.2. Nguyên tắc phản ứng PCR 9 Hình 2.3. Cấu trúc của máy ABI . 9 Hình 2.4. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân . 21 Hình 2.5. Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã . 22 xi Hình 2.6 : Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số 25 Hình 2.7 : Vùng flanking ở 2 bên trình tự microsatellite 26 Hình 2.8 :Dữ liệu microsatellite phân tích bằng điện di trên gel . 26 Hình 2.9 : Dữ liệu microsatellite phân tích tự động bằng điện di trên mao quản .27 Hình 3.1: Lấy mẫu lá cacao tại vườn 36 Hình 3.2: Đánh dấu cây được chọn .36 Hình 3.3: Giai đoạn nghiền mẫu .41 Hình 3.4: DNA tiếp tục được tinh sạch .41 Hình 3.5: Đĩa bơm mẫu .46 Hình 3.6: Lắp capillary vào máy .46 Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm li trích DNA .50 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7 .51 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR .51 Hình 4.4: Giống PBC 159 có 1 al dropping 246 với primer mTcCIR15 .54 Hình 4.5: Các chỉ tiêu để kiểm tra mức độ đồng nhất di truyền .55 Hình 4.6:So sánh kết quả của 2 mẫu multiplex PCR giống nhau ở primer mTcCIR8 Hình 4.7:Kết quả phân tích mẫu CT3 bằng phương pháp kết hợp 3 sản phẩm PCR riêng biệt với 3 primer mTcCIR7, mTcCIR15 và mTcCIR11 .60 xii . Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích trong phần mềm Cervus.........47 Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix................. Vùng flanking ở 2 bên trình tự microsatellite. ....................................... 26 Hình 2.8 :Dữ liệu microsatellite phân tích bằng điện di trên gel.............................