Đang tải... (xem toàn văn)
Để có thể đề ra một chiến lược toàn diện phát triển cây điều, điều qua trọng là cần phải đầu tư cho công tác lai tạo, bảo tồn và phổ biến những giống điều có chất lượng vượt trội so với những giống hiện có. Muốn vậy trước hết phải đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây điều hiện có.
LỜI CẢM ƠN Tất có ngày hơm có tương lai bắt nguồn từ công lao sinh thành, dưỡng dục cha mẹ - người mà phải chịu bao vất vả, gian nan Con xin thành kính ghi khắc lịng trọn đời cơng ơn cha mẹ để đường đời sống tốt có ý nghĩa mà cha mẹ dạy dỗ Anh hai gửi lời cảm ơn đến hai em gái lo lắng giúp đỡ anh suốt trình làm đề tài tốt nghiệp Em xin chân thành gửi lòng biết ơn đến: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Ban Giám Đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố – Sinh, Trường Đại học Nơng Lâm Tp HCM Ban Chủ nhiệm Thầy – Cô thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cô Trần Thị Dung – Chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh học cô Trần Thị Kim Linh – Chủ nhiệm lớp Công Nghệ Sinh Học 27 Đã chăm lo tạo điều kiện tốt cho em suốt trình học tập Trường suốt thời gian hoàn thành đề tài Em xin trân trọng biết ơn đến: Thầy TS Bùi Minh Trí – giáo viên hướng dẫn đề tài Các anh chị: chị Liên, chị Huệ, chị Hưng, anh Thế, chị Phương, chị Hà, anh Tồn TT Phân tích Thí nghiệm Hố Sinh – Trường ĐH Nơng Lâm Tp.HCM Đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình thực khố luận tốt nghiệp iii Tơi xin gửi lời cảm ơn đến người nông dân tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu tận tình giúp đỡ thời gian thực điều tra thu thập mẫu điều Cuối xin chân thành cảm ơn người bạn lớp với giúp đỡ suốt thời gian học tập Trường thời gian làm đề tài tốt nghiệp Chúc bạn đạt điều mà ước mơ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 Nguyễn Quỳnh Anh iv TĨM TẮT NGUYỄN QUỲNH ANH, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng 9/2005, “BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐIỀU (Anacardium occidental L.) TẠI TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ AFLP” Giảng viên hướng dẫn: TS BÙI MINH TRÍ Thời gian thực từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố Sinh, trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Đề tài thực đối tượng điều trồng tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Cây điều loại công nghiệp quan trọng Việt Nam Để đề chiến lược phát triển điều lâu dài đem lại lợi ích kinh tế cao, phải có chương trình bảo tồn, phổ biến giống điều tốt, thích nghi diện rộng lai tạo giống điều có chất lượng ưu việt so với giống có Muốn trước hết phải đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều có Do đó, chúng tơi sử dụng kỹ thuật RAPD AFLP để bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều canh tác địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Các kết đạt được: Thu thập 80 mẫu điều có đặc điểm bật (về suất, đặc điểm thực vật học,…) địa bàn toàn tỉnh Thực tách chiết DNA 80 mẫu lá, kết thu 50 mẫu DNA có chất lượng đạt yêu cầu để thực kỹ thuật RAPD Thực phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11 với 50 mẫu DNA, kết có 41 mẫu thực thành cơng Nhận diện 11 band, có band đồng hình band đa hình Những band đồng hình có độ dài khoảng 550 base pairs, 900 base pairs 1050 base pairs band đặc trưng điều thực phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11 Những band đa hình có độ dài khoảng 600 v base pairs, 700 base pairs, 750 base pairs, 1.200 base pairs, 1.400 base pairs, 1.600 base pairs, 1.900 base pairs 2.300 base pairs, band 600 base pairs 700 base pairs đặc biệt, nghiên cứu thêm sử dụng thị phân tử tính trạng đáng quan tâm Qua kỹ thuật RAPD đánh giá tính đa dạng di truyền quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu mức trung bình Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP DNA điều, chọn tổ hợp primer phù hợp: - MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green) cho 36 band, có band đồng hình 35 band đa hình Chúng tơi nhận thấy có band thị phân tử - MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green) cho 14 band, có band đồng hình 13 band đa hình Có band thị phân tử vi MỤC LỤC Nội dung Trang Trang tựa .ii Lời cảm ơn iii Tóm tắt .v Mục lục vii Danh sách từ viết tắt xiii Danh sách bảng xv Danh sách hình xvii Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Hạn chế đề tài Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung điều 2.1.1 Nguồn gốc điều 2.1.2 Đặc điểm thực vật học điều 2.1.2.1 Thân cành 2.1.2.2 Hệ rễ 2.1.2.3 Lá 2.1.2.4 Hoa điều vii 2.1.3 Đặc điểm sinh thái điều 2.1.3.1 Khí hậu 2.1.3.2 Đất đai 2.1.3.3 Mật độ trồng 2.1.4 Giống điều phương pháp nhân giống 2.1.4.1 Đặc điểm thực vật học giống điều 2.1.4.2 Phương pháp nhân giống điều 2.1.5 Sản xuất điều giới 2.1.6 Sản xuất điều Việt Nam 10 2.1.7 Tình hình canh tác điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 14 2.2 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền phát thị phân tử 15 2.2.1 Giới thiệu chung tính đa dạng di truyền thị phân tử 15 2.2.1.1 Chỉ thị hình thái 16 2.2.1.2 Chỉ thị allozyme 16 2.2.1.3 Chỉ thị phân tử – thị DNA 16 2.2.2 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 17 2.2.3 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) 17 2.2.4 Kỹ thuật STS (Sequence – Tagged Sites) 17 2.2.5 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) 18 2.2.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA 18 2.2.6.1 Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD 19 2.2.6.2 Những ưu điểm kỹ thuật RAPD 22 viii 2.2.6.3 Những hạn chế kỹ thuật RAPD 22 2.2.6.4 Ứng dụng kỹ thuật RAPD 22 2.2.7 Kỹ thuật AFLP 23 2.2.7.1 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 23 2.2.7.2 Các bước kỹ thuật AFLP 24 2.2.7.3 Những ưu điểm kỹ thuật AFLP 27 2.2.7.4 Những hạn chế kỹ thuật AFLP 27 2.2.7.5 Ứng dụng kỹ thuật RAPD 27 2.2.8 So sánh kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền phát thị phân tử 28 2.2.9 Kỹ thuật PCR 28 2.2.9.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 28 2.2.9.2 Quy trình chuẩn phản ứng PCR 30 2.2.9.3 Tối ưu hoá phản ứng PCR 31 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 Vật liệu 33 3.1.1 Nguyên liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 33 3.1.1.1 Nguyên liệu 33 3.1.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 33 3.1.2 Hóa chất cần thiết 33 3.1.2.1 Hóa chất dùng cho tách chiết kiểm tra DNA điều 33 3.1.2.2 Hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR – RAPD 35 3.1.2.3 Hóa chất dùng cho kỹ thuật AFLP 35 ix 3.1.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 36 3.1.3.1.Thiết bị dụng cụ thí nghiệm cần cho tách chiết kiểm tra DNA 36 3.1.3.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật PCR – RAPD 36 3.1.3.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật AFLP 37 3.2 Phương pháp nghiên cứu 37 3.2.1 Phần thu thập mẫu 37 3.2.1.1 Phương pháp chọn mẫu 37 3.2.1.2 Phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu 38 3.2.2 Phần nghiên cứu phân tích phịng thí nghiệm 38 3.2.2.1 Phương pháp tách chiết kiểm tra DNA điều 39 3.2.2.2 Kỹ thuật RAPD 40 3.2.2.3 Kỹ thuật AFLP 43 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 4.1 Phần điều tra thu thập mẫu điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 48 4.2 Phần nghiên cứu phân tích phịng thí nghiệm 50 4.2.1 Kết tách chiết DNA 50 4.2.1.1 Kết chung 50 4.2.1.2 Một số vấn đề tách chiết DNA điều 50 4.2.2 Kết thực kỹ thuật RAPD, bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền nhận diện x số band thị phân tử 52 4.2.2.1 Kết thí nghiệm 1: Thực theo quy trình tác giả nước 52 4.2.2.2 Kết thí nghiệm 2: Giảm số chu kỳ xuống 35 chu kỳ giữ ngun thành phần hóa chất thí nghiệm 53 4.2.2.3 Kết thí nghiệm 3: Tăng số chu kỳ lên 37 chu kỳ giữ nguyên thành phần hóa chất thí nghiệm 54 4.2.2.4 Kết thí nghiệm 4: Thay đổi thành phần hóa chất, thực phản ứng PCR qua 37 chu kỳ 55 4.2.2.5 Kết thực kỹ thuật PCR – RAPD 56 4.2.2.6 Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD 61 4.2.2.7 Phân tích kết phản ứng PCR – RAPD phần mềm NTSYS 61 4.2.2.8 Đánh giá đa dạng di truyền 62 4.2.2.9 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 79 4.2.2.10 Hạn chế kết đánh giá đa dạng di truyền kỹ thuật PCR – RAPD 71 4.2.3 Kết thực kỹ thuật AFLP số mẫu DNA điều 72 4.2.3.1 Kết cắt giới hạn gắn adapter 72 4.2.3.2 Kết phản ứng nhân tiền chọn lọc 72 4.2.3.3 Kết thực phản ứng nhân chọn lọc 73 4.2.3.4 Phân tích kết AFLP số mẫu DNA điều 74 xi 4.2.3.5 Đánh giá hiệu kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD 78 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79 5.1 Kết luận 79 5.1.1 Phần thu thập mẫu 79 5.1.2 Phần tách chiết DNA 79 5.1.3 Phần kỹ thuật RAPD, đánh giá đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử 79 5.1.3 Phần kỹ thuật AFLP 80 5.2 Đề nghị 80 5.2.1 Về phương hướng phát triển canh tác điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 80 5.2.2 Về nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử điều 81 Tài liệu tham khảo 82 Phụ lục 1: Mẫu phiếu điều tra nông dân Phụ lục 2: Danh sách hộ khảo sát Phụ lục 3: Danh sách mẫu tách DNA Phụ lục 4: Danh sách mẫu thực phản ứng PCR – RAPD Phụ lục 5: Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết PCR – RAPD Phụ lục 6: Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết AFLP mẫu TT4, TT9, VT38 CD45 Phụ lục 7: Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết AFLP mẫu TT1, TT31,CD40, M78 xii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AFLP: Amplifed fragment length polymorphism A: Nucleotide có gắn base adenine T: …………………………thymine G: …………………………guanine C: …………………………cytosine bp: Base pairs – cặp base chuỗi DNA BR: Thị xã Bà Rịa CTAB: Hexadecyltrime-thylammonium-bromide CNSL: Cashew nut shell liquid ctv: cộng tác viên CIA: Chloroform-isoamylalcohol CD: Huyện Châu Đức ĐC: Đối chứng DNA: Desoxyribose Nucleic Acid dNTPs: Những loại Deoxyribose Nucleotide Triphosphate (A, T, G, C) ĐVT: Đơn vị tính EB: Extraction buffer – dung dịch ly trích DNA EDTA: Erhylenediamine-tetra acetate g: Gram LD: Huyện Long Điền mM: Mili Mol xiii ng: Nanogram NT: nghiệm thức OD: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction Pimer F: Forward primer – primer xuôi Primer R: Reverse primer – primer ngược RFLP: Restriction fragment length polymorphisms RAPD: Random amplified polymorphic DNA SSR: Simple sequences repeat (Microsatellites) SSCP: Single – strand conformation polymorphism STS: Sequence – tagged sites Ta: Nhiệt độ bắt cặp primer vào DNA khuôn TAE: Tris – Acetate – EDTA TE: Tris – EDTA Tm: Nhiệt độ nóng chảy primer TT: huyện Tân Thành U: Unit XM: huyện Xuyên Mộc μl : Microlitre μM: Micro Mol xiv DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Sản xuất nhân hạt điều giới niên vụ 1997 2000 – 2001 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất, xuất nhập nhân điều Việt Nam 11 Bảng 2.3 Thị phần xuất nhân điều Việt Nam năm 2000, 2001 2002 12 Bảng 2.4 Tình hình phát triển sản xuất điều Việt Nam dự kiến đến năm 2010 13 Bảng 2.5 Sản lượng điều tỉnh BR – VT phân theo đơn vị hành 14 Bảng 2.6 Thành phần tác dụng chất dùng để tách chiết DNA 21 Bảng 2.7 Những primer EcoRІ nhân chọn lọc 25 Bảng 2.8 Những primer MseI nhân chọn lọc 26 Bảng 2.9 So sánh kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền phát thị phân tử 28 Bảng 3.1 Thành phần cách pha EB 34 Bảng 3.2 Thành phần cách pha TE 1X 34 Bảng 3.3 Các primer sử dụng cho kỹ thuật PCR – RAPD 40 Bảng 3.4 Thí nghiệm 41 xv Bảng 3.5 Thí nghiệm 41 Bảng 3.6 Thí nghiệm 42 Bảng 3.7 Thí nghiệm 43 Bảng 3.8 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân tiền chọn lọc 45 Bảng 3.9 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân chọn lọc 47 Bảng 4.1 Kết thu thập mẫu điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 48 Bảng 4.2 Quy trình thực phản ứng PCR – RAPD 56 Bảng 4.3 Các band đa hình mối liên quan với đặc điểm lấy mẫu 60 Bảng 4.4 Kết thực AFLP số mẫu DNA điều 74 xvi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1 Ngun lý kỹ thuật RAPD 19 Hình 2.2 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 23 Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR 30 Hình 4.1 Kết tách chiết DNA điều tươi trưởng thành 50 Hình 4.2 Kết tách chiết DNA điều tươi non 51 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR – RAPD primer 11 thí nghiệm 53 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR – RAPD thí nghiệm với primer 11 (A) primer (B) 53 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm PCR – RAPD thí nghiệm với primer 11 (C) primer (D) 54 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm PCR – RAPD thí nghiệm với primer 11 (E) (F) 55 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD mẫu từ TT1 – TT13 57 Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD mẫu từ TT14 – TT25 57 xvii Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD mẫu từ TT27 – XM79 58 Hình 4.9A Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD mẫu từ TT27– CD53 58 Hình 4.9B Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR– RAPD mẫu từ XM61 – XM79 59 Hình 4.10 Màn hình phát band kết PCR – RAPD 59 Hình 4.11 Kết đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS mẫu thu huyện Châu Đức 62 Hình 4.12 Cây di truyền điều lấy mẫu huyện Châu Đức 63 Hình 4.13 Cây di truyền điều lấy mẫu huyện Xuyên Mộc 64 Hình 4.14 Cây di truyền điều lấy mẫu huyện Tân Thành 64 Hình 4.15 Cây di truyền điều lấy mẫu Thị xã Bà Rịa Thành phố Vũng Tàu 65 Hình 4.16 Cây di truyền điều lấy mẫu có đặc điểm cho suất cao 66 Hình 4.17 Cây di truyền điều lấy mẫu có đặc điểm cho hạt to 67 Hình 4.18 Cây di truyền điều lấy mẫu có đặc điểm hoa nhiều 68 Hình 4.19 Cây di truyền quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 70 Hình 4.20 Kết phản ứng cắt gắn adapter 72 Hình 4.21 Kết phản ứng nhân tiền chọn lọc 73 xviii Hình 4.22 Kết AFLP điện di máy AB sequencer 3100 73 Hình 4.23 Cây di truyền kết AFLP tổ hợp primer nhân chọn lọc thứ 76 Hình 4.24 Cây di truyền mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực RAPD 76 Hình 25 Cây di truyền kết AFLP tổ hợp primer nhân chọn lọc thứ hai 77 Hình 4.26 Cây di truyền mẫu TT1, TT31, CD40, XM78 thực RAPD 77 xix xx ... phải đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều có Do đó, chúng tơi sử dụng kỹ thuật RAPD AFLP để bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều canh tác địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng. .. 4.2.2.9 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 79 4.2.2.10 Hạn chế kết đánh giá đa dạng di truyền kỹ thuật PCR – RAPD 71 4.2.3 Kết thực kỹ thuật AFLP số... trạng đáng quan tâm Qua kỹ thuật RAPD đánh giá tính đa dạng di truyền quần thể điều tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu mức trung bình Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP DNA điều, chọn tổ hợp primer