Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu ảnh hưởng của axit phytic đang được đánh giá toàn diện, nhằm giải quyết các vấn đề liên quan đến sức khỏe con người, dinh dưỡng động vật, quản lý dinh dưỡn sản phẩm nông nghiệp.
1 CHƢƠNG LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây lúa (Oryza sativa L.) loại lƣơng thực ni sống 50% dân số giới Trƣớc đây, với điều kiện vật chất thiếu thốn, lƣơng thực không đủ ăn ngƣời ta có nhu cầu đƣợc ăn no Nhƣng ngày mức sống ngƣời dân ngày đƣợc nâng cao nhu cầu ăn no đƣợc thay đổi, việc ăn ngon, có dinh dƣỡng cao dần trở nên nhu cầu quan trọng ngƣời Trong đó, cân dinh dƣỡng phần ăn vấn đề lớn dân số giới Ở nƣớc phát triển thiếu dinh dƣỡng khoáng chƣa đƣợc quan tâm nhƣ: Sắt (Fe), kẽm (Zn) Các chất đóng vai trị quan trọng thể ngƣời, sắt kim loại tham gia vào thành phần hóa học hồng cầu Thiếu sắt dẫn đến tình trạng thiếu máu ảnh hƣởng phần lớn đến trẻ em phụ nữ giai đoạn mang thai Trong đó, kẽm cần thiết cho thể, thiếu kẽm làm cho thể suy yếu, bệnh tật, gây tử vong gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển thể Ở trẻ em, phụ nữ mang thai phụ nữ giai đoạn cho bú sữa có nguy thiếu kẽm cao lúc thể có nhu cầu kẽm cao cho phát triển, sinh sản đề kháng với bệnh nhiễm trùng Brown Wuehler (2000) ƣớc tính khoảng 95,4% (+/- 2,1) dân số Nam Á khoảng 71,2% (+/- 14,2) dân số Đông Nam Á đứng trƣớc nguy thiếu kẽm Trong tỷ lệ Mỹ Canada chiếm khoảng 0,9 % (+/- 0,2 ) Hạt ngũ cốc họ đậu nguồn thực phẩm tiêu thụ dân số giới Nguồn thực phẩm giàu axit phytic (myo-inositol-1,2,3,4,5,6hexakisphotphate), thành phần dự trữ photpho hạt Axit phytic, phytate photpho đƣợc tìm thấy lƣợng đáng kể loại hạt trồng (John N.A Lott ctv, 2000) Axit phytic tồn hạt thƣờng dạng phức hợp muối phytate hay phytin kali , magie, canxi nên chứa ion kim loại khác nhƣ canxi (Ca), sắt (Fe) kẽm (Zn) Ở pH sinh lý, axit phytic dạng đa ion tích điện âm gây ảnh hƣởng đến ion mang điện tích dƣơng Khi thức ăn đƣợc hấp thu chúng kết hợp với kim loại khoáng quan trọng, cạnh tranh với hấp thu thành ruột non tạo nên thiếu sắt kẽm thể ngƣời Vì nghiên cứu ảnh hƣởng axit phytic đƣợc đánh giá toàn diện, nhằm giải vấn đề liên quan đến sức khỏe ngƣời, dinh dƣỡng động vật, quản lý dinh dƣỡng sản phẩm nông nghiệp 1.2.Mục tiêu đề tài Nghiên cứu đánh giá hàm lƣợng axit phytic số giống lúa địa phƣơng giống lúa đột biến để tìm dịng có hàm lƣợng axit phytic thấp phục vụ cho công tác chọn giống lúa giàu dinh dƣỡng 1.3 yêu cầu Pha đƣợc dung dịch hóa chất cho phản ứng sinh hóa Thành thạo ly trích DNA lúa Nắm vững kỹ thuật PCR Các thao tác nấu gel đƣa mẫu DNA vào giếng Nhuộm gel đọc điện di CHƢƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Axit phytic Axit phytic este photphate inositol, có cơng thức phân tử myoinositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphat ( IP6 ) thành phần phopho ( P ) thực vật, đƣợc tích lũy hạt túi phấn Hình 2.1.Cấu trúc inositol D ký hiệu vị trí cacbon Inositol hay cịn gọi hexahydroxyclohexan, có dạng đồng phân lập thể giống với cấu trúc glucose Inositol thành phần nhiều photphoglycerid tế bào Vì inositol có mặt mơ nên cịn đƣợc gọi Meso- hay myoinositol, đồng phân quan trọng Myo-inositol tiền chất chu trình photphatidylinositol Inositol dạng photphat ổn định với enzym phân hủy thể P P P P P P Hình 2.2 Cấu tạo lập thể axit Phytic Axit phytic tạo phức với ion kim loại nhƣ : Canxi (Ca), Kẽm (Zn), Sắt (Fe), Magie (Mg) hay tạo phức với protein thành hợp chất gọi Phytin hay phytate Hình 2.3.Công thức cấu tạo muối Phytate 2.2 Đặc điểm axit Phytic vai trị Axit Phytic chất kiềm mạnh, đặc biệt với cation đa hố trị cation đơn hóa trị (Graf, 1986) Muối gọi phytate (hay phytin), thông thƣờng chiếm khoảng đến vài phần trăm trọng lƣợng khô nhiều hạt vài trƣờng hợp chiếm khoảng 50-80% lƣợng photpho tổng hạt (Lott,1984) Khơng có hạt trƣởng thành mà khơng có phytate khơng có số mơ hạt định nhƣ nội nhũ chứa tinh bột hạt ngũ cốc Phytate có hạt phấn (Jackson ctv.,1982; Helsper ctv., 1984), bào tử túi (DeMaggio Stetler, 1985) mô sinh dƣỡng nhƣ rễ, cuống (Roberts Loewus, 1968; Brearly Hanke, 1996 ) Bảng 2.1 Sự phân bố Phytate hạt số trồng Ở lúa lúa mì Ngơ Đậu castor Đậu hà lan Mầm: 10% Mầm: 90% Phôi: 3% Lá mầm: 89% Aleurone: 90% Aleurone: 10% Nội nhũ: 97% Mầm: 2,5% Nội nhũ: Nội nhũ: Vỏ hạt: 0,1% Sự tổng hợp vai trò sinh lý phytate hạt gần đƣợc xem lại Greenwood (1989), Lásztity (1990), Loewus (1990), Raboy (1990 ), Lott ctv (1995 ) Raboy Gerbasis ( 1996 ) Axit phytic đƣợc tổng hợp tế bào nơi đƣợc dự trữ , liên quan đến lƣới nội chất, di chuyển túi nhỏ đến thể protein hình thành để dự trữ (Greenwood Bewley, 1984 ) Và thể protein phát triển, túi nhỏ cách kết tụ thành dạng lớn dạng cầu bề mặt giàu electron gọi globoid Nơi xuất tƣơng quan tốt kích thƣớc tần xuất cầu tỷ lệ ( Mg + Ca )/K mô hạt trƣởng thành sở trọng lƣợng khô (Lott ctv.,1985,1994; Lott Ockenden, 1986) Tỷ lệ ( Mg + Ca )/ K cao tần xuất xuất cầu cao Ở hạt có nồng độ K cao, Phytate bị phân tán hỗn hợp protein (Prattley Stanley, 1983) Ngƣời ta cho yếu tố giống nhƣ Ca Mg tạo thành cation đa trị, gắn với nhóm photphate mang điện tích âm axit phytic gần Những cầu nối yếu tố tạo nên globoid Globoid khơng phải cấu trúc dự trữ tĩnh mà hoạt động nhƣ hạt trao đổi ion thay đổi thành phần trình tạo hạt nảy mầm hạt Nói chung, mà hạt hình thành lƣợng K gia tăng globoid lƣợng Ca giảm (Ogawa ctv.,1979) Trong suốt trình nảy mầm hạt lƣợng K globoid giảm nhanh chóng nguyên tố cation hai trị ba trị có xu hƣớng tăng cách hữu hiệu ( Lott ctv.,1995;Beecroft Lott, 1996; Pitterman ctv.,1996; Wada Lott, 1997) Ngƣời ta phát suốt trình nảy mầm, số tế bào mầm xác định, globoid phát triển gấp bốn lần hạt khô (Pitt Lott, 1996) 2.2.1 Axit phytic trồng Axit phytic nguồn dự trữ Photpho thể thực vật Axit phytic kết hợp với cation tạo thành dạng muối, gọi phytate hay phytin Phytate có số vai trò định hạt mầm, vai trị sau có ý nghĩa nhất.Vai trò rõ phytate nguồn dự trữ inositol, photphate, K, Mg, Ca, Mn, Fe Zn cho mầm (Batten Lott, 1986 ; Lott Buttrose, 1978a, 1978b ;Chen Lott, 1992; Wada Lott, 1997) Những hợp chất dự trữ đƣợc giải phóng cho mầm phát triển hoạt động phytase (Chen Pan, 1977) Vai trò thứ hai điều khiển lƣợng photphate vơ hạt phát triển mầm ( Strother, 1980 ) Hiện nhà khoa học nông nghiệp chọn tạo giống trồng có hàm lƣợng axit phytic thấp, đặc biệt tạo hạt dùng làm lƣơng thực thực phẩm Tuy nhiên vấn đề đƣợc đặt liệu phát triển cá thể trồng có hàm lƣợng axit phytic thấp có ảnh hƣởng đến tính trạng nơng học khơng nhƣ: suất trồng, khả sinh trƣởng phát triển trồng…, đặc biệt vùng mà đất đai có hàm lƣợng photpho thấp (Graham welch ,1996) Tuy nhiên nghiên cứu cho thấy trồng có tính trạng axit phytic thấp lƣợng photpho tổng chúng mức bình thƣờng, không ảnh hƣởng đến khả hấp thụ P từ đất suất trồng (Raboy, 1996) Ngoài dạng đột biến axit phytic thấp cịn có khả ngăn không cho hạt tổng hợp P thành axit phytic 2.2.2 Axit phytic với ngƣời, vật nuôi môi trƣờng 2.2.2.1 Ảnh hƣởng axit phytic ngƣời Axit phytic có thực phẩm đƣợc làm từ nguyên liệu nhƣ ngũ cốc, gạo, họ đậu làm ngăn cản hấp thu ion kim loại nhƣ sắt (Fe 3+), Magie (Mg2+ ), Canxi (Ca2+), kẽm (Zn2+) Sự hấp thu ion kim loại tạo thiếu hụt vi khoáng lƣợng cần thiết Ở trẻ em dinh dƣỡng khoáng đặc biệt quan trọng giai đoạn cai sữa Giai đoạn thể phát triển nhanh chóng nhu cầu cần ion cao Lúc ngƣời ta thƣờng cho trẻ ăn loại cháo bột Do hấp thu ion trẻ đƣợc lấy từ cháo bột chủ yếu hàm lƣợng ion có sữa mẹ thấp.Vì thức ăn cháo bột có hàm lƣợng axit phytic cao dẫn đến thiếu ion khoáng cho trẻ Phytate cịn có khả ảnh hƣởng đến tiêu hóa tinh bột, protein liên kết với tinh bột, Ca (hoạt hóa enzym amylase) Phytate cịn tạo phức với protein ức chế enzym trypsinogen 2.2.2.2 Ảnh hƣởng axit phytic vật nuôi môi trƣờng Tháng 12 năm 2002 quan bảo vệ môi trƣờng Mỹ đƣa quy định việc quản lý nguồn chất thải chăn ni Trong vịng 30 năm qua nhà chăn ni thay đổi từ hình thức trang trại nhỏ, thiếu tập trung đến trang trại lớn tập trung Và lƣợng lớn chất thải chăn nuôi đƣợc thải ngồi mơi trƣờng Vấn đề đặt gia tăng việc hấp thu dinh dƣỡng tối đa thú để giảm lƣợng dinh dƣỡng thải ngồi mơi trƣờng tạo cân dinh dƣỡng nông trại Khoảng 85% Photpho (P) có thực phẩm có nguồn gốc từ ngũ cốc dùng làm thức ăn cho heo khơng đƣợc sử dụng Photpho liên kết dạng Phytate photphat (Veum ctv., 2001) Heo thiếu enzym tiêu hóa phytase giữ vai trị việc giải phóng photpho liên kết từ vịng phytate inositol Vì lƣợng lớn P vô thƣờng đƣợc sử dụng để bổ sung vào phần ăn cho heo, đáp ứng nhu cầu P cho thể phát triển Tuy nhiên phần ăn đƣợc cung cấp thêm P vô cơ, lƣợng photpho mà heo không sử dụng (liên kết hợp chất phytate) đƣợc thải vào môi trƣờng không đƣợc quản lý tốt gây nên thiệt hại tiềm tàng cho mơi trƣờng Động vật Các đá trầm tích Photphat Thực vật ĐẤT Sự kết cấu lai hóa đá Granit Thủy Nguyên Apatit Đá Macma (Nguồn: Vũ Văn Vụ ctv.,2000 Sinh lý học thực vật.) Hình 2.4 Sơ đồ chu trình photpho tự nhiên Ở gà nhƣ động vật dày đơn khác (trong có heo) khơng thể tiêu hóa đƣợc axit phytic đƣợc cho ăn với phần có chứa ngơ đậu nành Kết chúng thải axit phytic khỏi thể chúng dạng phân có chứa P Nếu nhƣ đậu nành, ngô, gạo chứa lƣợng axit phytic thấp chúng thải lƣợng P phân Hiện nhà công nghệ sinh học tạo giống ngô, đậu nành, gạo có hàm lƣợng axit phytic thấp nhằm làm giảm nhiễm P có phân Ngồi mục tiêu tạo hạt có hàm lƣợng axit phytic thấp, ngành công nghệ sinh học sản xuất đƣợc enzym phytase có nguồn gốc vi sinh vật biến đổi gen dùng làm nguồn bổ sung vào phần ăn Phytase enzym làm phá vỡ cấu trúc phytate Enzym đƣợc sản xuất mức giới hạn động vật có vú, nhƣng đƣợc tạo nhiều vi khuẩn Sự thêm phytase vào phần ăn thú dày đơn cho thấy khả sử dụng P (Nelson ctv., 1968; Cromwell ctv., 1991), nhƣ khoáng chất khác ( Biehl ctv., 1995; Radcliffe ctv., 1995; Simpson Wise, 1990), protein amino axit (Johnston, 2000; johnston ctv., 2004) gia tăng Bằng việc sử dụng enzym phytase bổ sung vào phần ăn cho động vật giúp làm giảm hàm lƣợng Photpho có phân So với cơng nghệ sinh học ứng dụng chăn ni cơng nghệ sinh học ứng dụng thực vật chiếm ƣu Tuy nhiên nhà công nghệ sinh học nông nghiệp tạo đƣợc giống heo biến đổi gen tạo enzym phytase có nƣớc bọt tiêu hóa đƣợc axit phytic có thức ăn, chuyển từ dạng photpho khơng tiêu hóa đƣợc sang dạng photpho sử dụng đƣợc Vì lƣợng photpho phân đƣợc thải giảm đáng kể, khoảng 64% đến 67% Phân gà đƣợc thải ngồi mơi trƣờng nguồn phân bón cho trồng Tuy nhiên, nhiều P có phân khơng thể sử dụng đƣợc cho trồng nhanh chóng bị gắn kết đất Điều đặc biệt với phytate Nếu nhƣ trồng sử dụng photpho đất cách hữu hiệu, ngƣời ta dùng phân gà bón cho trồng mà không gây ảnh hƣởng có khơng đáng kể mơi trƣờng Các nhà công nghệ sinh học nghiên cứu tạo giống trồng sử dụng photpho đất có nguồn gốc từ phân cách hiệu nhằm giảm bớt ô nhiễm môi trƣờng lƣợng phân thải chăn nuôi 2.3 Công nghệ sinh học phân tử lúa Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử thực vật khơng giải vấn đề khó khăn cải tiến giống trồng, an toàn lƣơng thực thực phẩm, phát triển kinh tế mà bảo đảm bảo tồn, đa dạng hóa nguồn gen bền 10 vững Cơng nghệ sinh học đóng vai trị nhƣ công cụ sẵn sàng phục vụ cho nhà chọn giống thực vật, nhằm ứng dụng tạo nhiều định hƣớng để gia tăng sản lƣợng, đa dạng hóa trồng sử dụng sản phẩm nguồn gen nông nghiệp ngày phát triển bền vững (IAEA, Wienna, 2002) Sự phát triển không ngừng với nhiều kỹ thuật đại ngày đƣợc cải tiến, đƣợc nhà chọn giống nhà sinh học phân tử ứng dụng Các ứng dụng việc chọn vật liệu để tạo các tổ hợp lai, thiết lập hay liên kết đồ gen tính trạng quan trọng có ý nghĩa kinh tế qua di truyền số lƣợng (QTL) Thiết lập đồ QTL liên kết gen dựa chọn lọc nhờ vào đánh dấu phân tử (MAS) ứng dụng quần thể hồi giao, quan hệ phả hệ quần thể cận giao Thông qua so sánh hệ thống gen sinh vật, phƣơng pháp đánh dấu phân tử cho phép khám phá tìm đa dạng sinh học tiến hóa sinh vật (IAEA, Wienna, 2002) Chiến lƣợc chọn giống nhờ vào đánh dấu phân tử phƣơng pháp tác động mạnh đến hiệu chọn giống Các đánh dấu có kết kỹ thuật cao sở PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm đánh giá kiểu gen tính trạng mục tiêu đƣợc giới ủng hộ từ năm 1995 Chọn giống sở đánh dấu phân tử từ nguyên lý chứng minh, đánh dấu liên kết với gen nằm vị trí (locus) nhiễm sắc thể vị trí phản ánh đƣợc đặc tính mong muốn Các đánh dấu đƣợc chia thành hai nhóm: đánh dấu sở PCR đánh dấu thăm dị lai DNA ( Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999) Các kỹ thuật đánh dấu phân tử nhƣ RFLP, AFLP, RAPD, SSR, ISSR, AFL, SCAR STS cho phép chọn lọc trực tiếp nhiều tính trạng quần thể F2, quần thể cận giao, dòng đơn bội kép dòng tái tổ hợp (IAEA, Wienna, 2002) Ứng dụng đánh dấu phân tử lúa (Oryza sativa L.) thành công chọn giống chống chịu số sâu bệnh hại quan trọng nhƣ lập đồ gen kháng bệnh đạo ôn (Yu ctv.,1991), gen kháng bệnh bạc (Mc couch, 1991), lập đồ gen kháng rầy nâu (Nguyễn Thị Lang ctv., 2002), gen kháng sâu đục thân (Tan ctv., 1993) Đánh dấu phân tử RFLP đƣợc ứng dụng để thiết lập đồ gen lúa Bản đồ phủ 12 35 165 cá thể đƣợc phân tích là: 5, chiếm tỷ lệ 3,03 % Số cá thể biểu tính axit phytic cao giống OMCS 2000 đột biến 96,97 % 120 96.97 89.73 100 80 OM1490 60 OMCS2000 40 10.27 20 3.03 axit phytic thấp axit phytic cao Biểu đồ 4.1 Biểu đồ thể phần trăm số cá thể biểu tính axit phytic thấp cao giống OM 1490 đột biến OMCS 2000 đột biến hệ M3 Tuy nhiên cá thể đƣợc ghi nhận có hàm lƣợng axit phytic thấp biểu tính axit phytic thấp khơng đồng mức hạt phân tích Do việc đánh giá tính axit phytic thấp thơng qua mức theo thang photpho chuẩn cần thiết Việc tính tốn dựa số hạt thể màu tổng số hạt phân tích Việc thể phần trăm số hạt biểu tính trạng axit phytic thấp theo mức cho ta thấy đƣợc mức độ biểu tính axit phytic cá thể quần thể 100 80 60 40 OM1490 20 OMCS2000 Mức Mức Mức Mức Mức Biểu đồ 4.2 Biểu đồ thể phần trăm tính trạng axit phytic thấp theo mức thuộc quần thể OM 1490 OMCS 2000 hệ M3 36 Qua biểu đồ hình 4.14 cho thấy số hạt biểu tính axit phytic thấp (mức 2, mức 3, mức 4, mức 5) cá thể đột biện thuộc quần thể OM 1490 cao cá thể đột biến thuộc quần thể OMCS 2000 4.1.2.2 So sánh với kết hệ M2 đƣợc nghiên cứu trƣớc Theo T.S Nguyễn Thị Lang cộng tác viên nghiên cứu hàm lƣợng axit phytic hệ M2 tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp thuộc quần thể OM 1490 chiếm 4,3 % quần thể đột biến OMCS 2000 0,81% Nhƣ tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp hệ M3 tăng lên 5,97 quần thể đột biến OM 1490 2,22 quần thể OMCS 2000 12 10 10.27 OM1490 4.3 3.03 OMCS2000 0.81 Thế hệ M2 Thế hệ M3 Biểu 4.3 Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp M2 M3 thuộc quần thể OM 1490 4.1.2.3 Quần thể lúa đột biến OM 1490 hệ M4 Chọn ngẫu nhiên 40 dòng thuộc quần thể đột biến OM 1490 hệ M4 để phân tích đặc tính axit phytic thấp thơng qua phản ứng sinh hóa Các cá thể biểu tính axit phytic thấp đƣợc so sánh với thang photpho chuẩn Sau phân tích tính trạng axit phytic thấp 40 dịng đƣợc cho nảy mầm, ly trích DNA đƣợc phân tích PCR với marker RM207 marker RM202 Marker RM 207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp nhiễm sắc thể số gen lúa Marker RM 202 khơng có tác dụng giải thích tính trạng axit phytic thấp nhiên marker cho thấy biểu tính đa hình dịng đột biến 37 Hình 4.8 Kết phân tích thể photphat tự hệ M4 Các cá thể đƣợc ghi nhận có hàm lƣợng axit phytic thấp : 311-19; 328-1; 158-18; 144-2; 8-1; 8-3; 18-1; 122-1; 166-15 thuộc quần thể OM 1490 Qua kết phân tích hình 4.8, cá thể 311-19; 328-1 biểu tính axit phytic thấp với hạt biểu tính axit phytic thấp mức hạt phân tích cá thể Các cá thể 158-18 có hạt biều tính phytic axit thấp tƣơng đƣơng mức 2, cá thể 144-2 biểu tính axit phytic thấp với hạt tƣơng đƣơng mức 2, cá thể 8-1 biểu tính axit phytic thấp với hạt thể màu tƣơng đƣơng mức 3, cá thể 8-3 với hạt thể màu mức hạt mức 3, cá thể 18-1 thể tính phytic axit thấp với hạt tƣơng đƣơng mức 2, cá thể 122-1 thể tính axit phytic thấp với hạt mức hạt thể mức cá thể 166-15 thể tính axit phytic thấp với hạt tƣơng đƣơng mức Qua kết phân tích phƣơng pháp sinh hóa cho thấy số cá thể biểu tính axit phytic thấp 40 dịng phân tích, chiếm tỷ lệ 22,5 % số cá thể biểu tính axit phytic cao chiếm 77,5% So với hệ M3 số cá thể biểu tính axit phytic thấp tăng 12,23 % 38 OM1490 25 20 15 10 22.5 10.27 Thế hệ M3 OM1490 Thế hệ M4 Biểu đồ 4.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp hệ M3 M4 thuộc quần thể đột biến OM 1490 OM1490, M4 100 80 60 40 20 77.5 OM1490, M4 22.5 axit phytic thấp axit phytic cao Biểu đồ 4.5 Biểu đồ thể phần trăm số cá thể biểu tính axit thấp cao thuộc quần thể đột biến OM 1490 hệ M4 4.2.Đánh giá tính trạng axit phytic thấp Marker SSR 4.2.1Trên quần thể lúa mùa lúa cao sản Chúng tiến hành kiểm tra kiểu gen marker SSR với marker RM 207 cá thể biểu tính axit phytic thấp cá thể dùng làm đối chứng nhƣ dạng OM1490 OMCS2000 chƣa đƣợc đột biến, lúa hoang ,Lpa-1, Xie Q Zao Cá thể OM1490 OMCS2000 chƣa đƣợc đột biến đối chứng cho tính trạng axit phytic cao Cá thể lúa hoang, Lpa-1, Xie Q Zao cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp chúng đƣợc dùng làm đối chứng cho tính trạng axit phytic thấp Marker RM 207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp nằm nhiễm sắc thể số Marker RM 207 cho thấy khác biệt cá thể 39 có hàm lƣợng axit phytic cao cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp Dựa vào dịng đối chứng cao hàm lƣợng axit phytic nhƣ OM 1490 OMCS 2000 dạng bố mẹ chƣa đƣợc gây đột biến (lane lane 3) đối chứng thấp hàm lƣợng axit phytic nhƣ giống Lpa-1, giống lúa hoang, Xie Qing Zao (lane 2, lane 11, lane 12), dòng khác đƣợc ghi nhận nhƣ sau: Các dịng có biểu tính axit phytic thấp OM 2718, OM 4498, lúa vàng Theo kết nghiên cứu trƣớc kích thƣớc band hình điện di dòng 250 bp Các dòng khác biểu tính axit phytic thấp thử nghiệm phƣơng pháp sinh hóa nhƣng khơng ghi nhận qua phân tích marker phân tử : OM 2490 (lane 4), nếp tóc (lane 5), OM 5731 (lane 6), Tám xoan (lane 7) Tuy nhiên đa hình nầy chƣa thấy rõ tách kiểu gen nghiên hàm lƣợng phytic acid thấp hay cao Do hàm lƣợng phytic acid hạt gạo có liên quan đa gen khó đánh giá đơn gen vài marker cần phải nghiên cứu phối hợp di truyền số lƣợng để tách đa gen nầy 250bp Hình 4.9:Kết phân tích microsatellite với primer RM 207 quần thể lúa mùa cao sản 1: OM 1490 , 2: Lpa -1 , 3: OMCS 2000, 4: OM 2490 , 5: Nếp tóc ;6: OM 5731, 7: Tám xoan -93, 8: OM 2718, 9:OM 4498, 10: lúa Vàng , 11: lúa hoang , 12 : Xie Qing Zao 40 4.2.2 Trên quần thể đột biến OM 1490 hệ M Bốn mƣơi dòng M4 đƣợc đánh giá kiểu gen thông qua hai marker RM 207F-R RM 202F-R Hai marker nầy đƣợc liên kết nhiễm sắc thể số nhiễm sắc thể số 11 theo thứ tự Bảng 4.1.Các cá thể đƣợc ký hiệu theo số điện di: 39-1 15 1-13 29 11-2 2-1 16 61-1 30 27-10 12-14 17 129-2 31 107-1 60-1 18 335-9 32 44-2 80-1 19 249-1 33 328-1* 166-15* 20 158-18* 34 8-1* 69-2 21 144-2* 35 338-20 * 8-3 22 15-1 36 18-1* 20-1 23 173-2 37 336-1 10 100-2 24 103-2 38 261-10 11 61-2 25 38-1 39 187-1 12 131-2 26 222-1 40 338-1 * 13 122-1 27 171-1 14 311-19* 28 137-1 ( Dấu “*” ký hiệu cá thể biểu tính axit phytic thấp qua phân tích sinh hóa) Bảng 4.5 Các cá thể thuộc quần thể OM 1490 hệ M4 Đối với marker RM 202 marker liên kết với nhiễm sắc thể số 11 , nhiên ghi nhận có đa hình dịng đột biến Do marker nầy số liệu tham khảo để giải thích cho gen đột biến nhƣng khơng giải thích rõ hàm lƣợng phytic acid cao thấp (hình 4.10 4.11) Để phân tích marker liên kết với gen hàm lƣợng phytic thấp cao , tiếp tục dùng marker RM 207F-R để chạy PCR Sản phẩm PCR đƣợc chạy điện di gel agarose với nồng độ 3% Kết ghi nhận băng hình cho thấy đa hình hình 4.12 4.13 Mặc dù khơng có thang DNA chuẩn điện di để xác định kích thƣớc đa hình nhƣng với so sánh với đối chứng mà có tính trạng axit phytic cao phân tích sinh hóa nghiên cứu trƣớc Lang cộng năm 2004 băng hình giải thích cho tính trạng axit phytic thấp có kích thƣớc 250 bp So sánh kiểu gen kiểu hình marker RM 207 quần thể M4 ghi nhận hai cho liên kết phù hợp bảng 66,67 % 41 Hình 4.10 Kết phân tích microsatellite với primer RM 202 quần thể lúa đột biến OM 1490 hệ M4 Hình 4.11 Kết phân tích microsatellite với primer RM 202 quần thể lúa đột biến OM 1490 hệ M4 250bp Hình 4.12 Kết phân tích microsatellite với primer RM 207 quần thể lúa đột biến OM 1490 hệ M4 Ở hình 4.12 cho thấy đa hình thể với hai băng hình 34 36 tƣơng đƣơng với hai cá thể 8-1 18-1 Hai băng hình giải thích cho tính trạng axit 42 phytic thấp phân tích kiểu gen với marker RM207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp nhiễm sắc thể số Các băng hình cịn lại thể tính trạng axit phytic cao phân tích kiểu gen 250bp 250bp Hình 4.13 Kết phân tích microsatellite với primer RM 207 Kết phân tích hình 4.13 cho thấy đa hình đƣợc thể điện di Các băng hình thể tính trạng axit phytic thấp band hình thứ 6; 8; 20; 21 tƣơng ứng với cá thể 166-15; 8-3; 158-18; 144-2 Các băng hình cịn lại thể tính trạng axit phytic cao phân tích kiểu gen Một số cá thể biểu tính axit phytic thấp phân tích phƣơng pháp sinh hóa nhƣng khơng ghi nhận đặc điểm phân tích marker RM207 122-1, 311-19, 328-1 43 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận Các cá thể biểu tính axit phytic thấp thƣờng khơng đồng nhất.Tuy nhiên qua so sánh số cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp tăng dần qua hệ chọn lọc M2 đến M4 Kết phân tích sinh hóa hệ M3, chúng tơi tìm đƣợc 19 cá thể thuộc quần thể đột biến OM 1490 185 cá thể đƣợc phân tích cá thể thuộc quần thể đột biến OMCS 2000 biểu tính axit phytic thấp.Tuy nhiên mức độ biểu biện tính axit phytic thấp chƣa cao chƣa đồng so với giống đối chứng ( lúa hoang, Lpa-1, Lpa-2) Đối với giống lúa mùa ghi nhận cá thể biểu tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức theo thang photpho chuẩn Nếp tóc Tám Xoan Đối với 130 giống lúa cao sản để đánh giá hàm lƣợng axit phytic Kết ghi nhận giống OM 2490, OM 4498 , OM 2718 ; OM 5731-5 ; OM 5731-7 DS 2002 tạo phức màu xanh tƣơng đƣơng với giếng chuẩn thứ Ở hệ M4 ghi nhận có cá thể biểu tính axit phytic thấp 40 cá thể phân tích Tuy nhiên Kiểm tra lại marker SSR với primer 207 ghi nhận có cá thể biểu tính axit phytic thấp Tìm đƣợc marker RM 202 liên kết nhiễm sắc thể số 11 cho đa hình tách dịng đột biến thuộc quần thể đột biến OM 1490 Đối với kiểu gen phân tích marker RM 207 nhiễm sắc thể số có ghi nhận đa hình giống có hàm lƣợng axit phytic thấp, nhiên vài giống ghi nhận phytic axit thấp bên kiểu hình nhƣng đánh giá marker chƣa cho thấy đa hình Điều nầy ghi nhận rõ ràng hạt gạo cần phải xem xét ổn định hệ dịng đột biến Dựa vào phân tích đánh dấu marker phân tử SSR, khai thác tiềm kiểu gen dòng bố mẹ Do đó, việc chọn lọc 44 cẩn thận dịng đột biến giúp có nguồn vật liệu lai phù hợp dễ khai thác, chọn lựa theo gen có hàm lƣợng axit phytic cao thấp nhƣ mong muốn 5.2.Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu chọn lọc cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp hệ để tăng số cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp tăng tính đồng Tuy nhiên quần thể đột biến đặc biệt đột biến vật lý , việc chọn lựa quần thể biến động giống khó cần phải sử dụng phƣơng pháp phân tích genome với kỹ thuật SNP để khai thác biến động allele nhỏ quần thể đột biến Đề nghị nghiên cứu tiếp tục đồ finemapping cho gen axit phytic thấp nhiều quần thể để tìm nhiều marker liên kết gen gen phụ tính trạng nầy 45 CHƢƠNG VI Tài liệu tham khảo 6.1 Tài liệu tiếng việt Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương Pháp Cơ Bản Trong Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp,TP.Hồ Chí Minh, p 63-72 Nguyễn Thị Lang, Trần Đình Giỏi Bùi Chí Bửu 2005 Nghiên Cứu Gen Lúa Có Hàm Lượng Axit Phytic Thấp Tạp chí Nơng Nghiệp (chuẩn bị đăng) Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thạch Cân, Trần Thị Lũy, Trịnh Hoàng Khải, Phạm Thị Bé Tƣ, Nguyễn Thị Tâm, Đặng Minh Tâm, Bùi Thị Dƣơng Khuyều, Nguyễn Thuần Khiết, Trần Thanh Sơn, Trần Bá Thảo 2002 Ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống lúa chất lượng cao Sở khoa học công nghệ môi trƣờng tỉnh An Giang Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu,1999 Định hướng cơng tác chọn tạo gen kháng sâu bệnh cho lúa marker phân tử Hội nghị nghiên cứu ứng dụng sinh học ĐBSCL lần thứ I tháng 5/1999 Liên hiệp hội khoa học kỹ thuật tỉnh Cần Thơ 5.Trịnh Hồng Khải, 2004 Đánh giá tính trạng nơng học tính trạng axit phytic dịng somclonal đột biến Đề cƣơng luận văn thạc sĩ chuyên nghành công nghệ sinh học Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998 Giáo Trình Sinh Hóa Hiện Đại Nhà Xuất Bản Giáo Dục Vũ Văn Vụ, 2000 Sinh lý học thực Vật Nhà xuất giáo dục, 251 trang 6.2 Tài liệu tiếng nƣớc Hill B., Hankins L., Trapp S A., Sutton A.L., and Richert B T.,2002.Effects of Low Phytic Acid Corn, Low Phytic Acid Soybean Meal and Phytase on Nutrient Excretion and Nutrient Digestibility in Pigs Purdue University Swine Research Report 46 Marie T Ruel and Howarth E Bouis, June 1997 Plant breeding: a long-term strategy for the control of zinc deficiency in vulnerable populations.The American journal of clinical nutrition volume 30 10 Drew L Kershen, 11-2002 Agricultural Biotechnology: Environmental Benefits for Identifiable Environmental Problems 11 Shi J and Beach L R.,1999 The application of Genomics to improve the nutritional value of corn 12 Lott N.A John, Ockenden I., Raboy Victor and Batten D G., 2000 Phytic acid and phosphorus in crop seeds and fruits : a global estimate Seed science research 10: pp 11-33 13 Raboy V., Gerbasi P F., Young A K., Stoneberg D Sierra, Pickett G Suewiya, Bauman T Andrew , Murthy P.N Pushpalatha, Sheridan F William, and Ertl S.David, September 2000.Origin and Seed Phenotype of Maize low phytic acid 1-1 and low phytic acid 2-1 Plant Physiol 124: 355-368 14 Raboy V., 2002 Progress in breeding low phytate crops Journal Nutrition 132 Lackey K H., Pope M P and Johnson D M., 2003 Expression of L-Myoinositol1-photphate synthase in organelles Plant Physiology 132: pp.2240-2247 Các trang web: www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm www.etd.lsu.edu/docs/available/etd-03242004154627/unrestricted/Chapters1and2.pdf www.Chemicalland21.com www.etd.lsu.edu/docs/available/etd-03242004154627/unrestricted/Chapters1and2.pdf www.ajcn.org/cgi/content/abstract/68/2/488S www.ansc.purdue.edu/swine/swineday/sday02/4.htm www.botanischergarten.ch/Benefits/KershenEnvirBenefits.pdf 47 Phụ lục 1.Thành phần dung dịch chuẩn bị phƣơng pháp sinh hoá Thành phần Hàm lƣợng Thể tích (ml) 0.4M HCl 3.5 ml 100 6N H2SO4 16.3 ml 100 2.5%(NH4)2Mo 2.5g 100 10% Vitamin C 10.00g 100 1mM K2PO4 0.013g 100 2.Thành phần TE (pH=8) Thành phần Nồng độ Thể tích 50ml Tris(PH=8) 10 mM 0.5ml EDTA (pH=8) 0.5M 0.1ml H2 O 49.6ml Thành phần loading buffer 10X Thành phần Thể tích 1M Tris (pH=8) 0,5ml Glycerol 5,0ml 0,5M EDTA (pH=8) 100,0 l Bromphenol blue 15,0mg Xylen cyanol R 15,0mg H2 O 4,5ml 4.Thành phần TAE 50X Thành phần Thể tích (1lít) Tris baz 24g Glacial acetic axit 57,1ml 0,5M EDTA (pH=8) 100ml Thành phần dung dịch ly trích Dung dịch ly trích bao gồm thành phần sau: 48 1M Tris, 5M NaCl, 0.5M EDTA Các thành phần đƣợc lấy theo thể tích tƣơng ứng 100ml 1M Tris, 100ml 5M NaCl, 40ml 0.5M EDTA thêm nƣớc cấtt lần vào cho đủ 1000ml Bảng thể số hạt có tính trạng axit phytic thấp theo mức cá thể đột biến hệ M3 thuộc quần thể đột biến OM 1490 Mức Cá thể Mức1 Mức Mức Mức Mức (hạt) (hạt) (hạt) (hạt) (hạt) Cá thể 54 0 Cá thể 77 0 Cá thể 78 0 Cá thể 80 0 Cá thể 154 0 Cá thể 165 0 Cá thể 2 0 Cá thể 2 0 Cá thể 16 0 10 Cá thể 14 4 0 11 Cá thể 0 12 Cá thể 81 0 13 Cá thể 170 0 14 Cá thể 164 0 15 Cá thể 162 0 16 Cá thể 168 0 17 Cá thể 167 3 1 18 Cá thể 11 0 19 Cá thể 0 49 Bảng thể số hạt có tính trạng axit phytic thấp theo mức cá thể đột biến hệ M3 thuộc quần thể đột biến OMCS 2000 Mức Mức Mức Mức Mức Mức Cá thể (hạt) (hạt) (hạt) (hạt) (hạt) Cá thể 210 2 0 Cá thể 202 4 0 Cá 348 0 Cá thể 341 0 Cá thể 205 0 Bảng thể số hạt có tính trạng axit phytic thấp theo mức cá thể đột biến hệ M4 thuộc quần thể đột biến OM 1490 Mức Mức1 Mức Mức Mức Mức (hạt) (hạt) (hạt) (hạt) (hạt) 20 cá thể 158-18 0 21 Cá thể 144-2 0 22 Cá thể 8-1 0 23 Cá thể 8-3 1 24 Cá thể 18-1 0 25 Cá thể 122-1 1 26 Cá thể 166-15 0 27 Cá thể 311-19 0 28 Cá thể 328-1 Cá thể ... 32 8-1 * 16 6-1 5* 20 15 8-1 8* 34 8-1 * 6 9-2 21 14 4-2 * 35 33 8-2 0 * 8-3 22 1 5-1 36 1 8-1 * 2 0-1 23 17 3-2 37 33 6-1 10 10 0-2 24 10 3-2 38 26 1-1 0 11 6 1-2 25 3 8-1 39 18 7-1 12 13 1-2 26 22 2-1 40 33 8-1 * 13 12 2-1 ... thể số nhiễm sắc thể số 11 theo thứ tự Bảng 4.1.Các cá thể đƣợc ký hiệu theo số điện di: 3 9-1 15 1-1 3 29 1 1-2 2-1 16 6 1-1 30 2 7-1 0 1 2-1 4 17 12 9-2 31 10 7-1 6 0-1 18 33 5-9 32 4 4-2 8 0-1 19 24 9-1 33... lƣợng axit phytic số giống lúa địa phƣơng giống lúa đột biến để tìm dịng có hàm lƣợng axit phytic thấp phục vụ cho công tác chọn giống lúa giàu dinh dƣỡng 1.3 yêu cầu Pha đƣợc dung dịch hóa chất
![Hình 2.7. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở trong tế bào eukaryo: (1), D-Ins(3)-P 1 (or L-Ins[1]-P1 ) synthase; (2), D-Ins 3-phosphatase (or L-Ins 1-phosphatase); (3), D-Ins 3-kinase (or L-Ins 1-kinase); (4), Ins P- or polyP kinases; - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AXIT PHYTIC Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG VÀ MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA VÀ MICROSATELLITE (Nội dung chính)](https://media.store123doc.com/figures/000/123/dong-eukaryo-synthase-phosphatase-phosphatase-kinase-kinase-kinases-123796.png)
