LY TRÍCH VÀ ĐỊNH DANH MALASSEZIA SPP. TÓM TẮT Mục tiêu: Ly trích và định danh Malassezia spp. ở vẩy da của một số người Việt Nam bệnh lang ben, gàu hoặc da người bình thường theo phân loại mới. Phương pháp: vẩy da từ bệnh lang ben, gàu và da bình thường của một số người tình nguyện được thu thập bằng tăm bông vô trùng, sau đó cấy vào môi trường SDA-S và môi trường m-Dixon trong vòng 24 giờ. Ủ ở 32 o C từ 48 giờ đến 1 tuần. Chọn những khóm nấm có các đặc điểm của nấm men là có đường kính khoảng 1 mm, màu kem, trơn bóng để định danh bằng hình ảnh vi nấm học và phản ứng sinh hóa. Kết quả: Malassezia furfur chiếm tỉ lệ vượt trội, kế đến là M. sympodialis. M. globosa và M. restricta chiếm tỉ lệ rất thấp. Đặc biệt có 6 chủng Malassezia spp. có tính chất lý hóa không phù hợp với các loài trong khóa định danh của Guillot và cs. nên có thể là những loài mới. Kết luận: Các kết quả trên chưa phản ánh được tính chất dịch tễ học của Malassezia spp. nhưng cũng cho thấy phần nào sự phân bố của chi nấm Malassezia trên da người Việt Nam và các chủng nấm đã ly trích sẽ được sử dụng để nghiên cứu về mức độ đáp ứng của chúng với các chất kháng nấm. ABSTRACT Objectives: isolating, using morphological features and physiological test to differentiate all isolations.of Malassezia species from some of Vietnamese scabs who had pityriasis versicolor, dandruff or in normal skin according to new classification. Methods: scabs were collected from pytiriasis, dandruff and normal skin of volunteers by anseptic tampons, then culture in the SDA-S and m- Dixon media in 24 hours, keep in 32 0 C from 48 hours to 1 week. Choosing the clusters which had yeast characteristics such as it had diameter about 1mm, cream color, smooth to name based on morphological features and biochimical reactons. Results: M. furfur was the most prevalent species, following by M. sympodislis, M. globosa and M. restricta. There were six isolated strains belong to the Malassezia genus but were clearly distinct from the seven Malassezia species. These strains should be considered as novel species that have to name by other methods. Conclusions: The results are not enough to represent for the distribution of Malassezia species in Vietnamese but these isolations can be used in studying their sensibility to antifungal agents ĐẶT VẤN ĐỀ Trước đây, Malassezia furfur (Pityrosporum orbiculare) được xem là vi nấm gây bệnh lang ben và các rối loạn ở da khác như gàu, viêm da tiết bã Từ năm 1996, nhóm nấm Malassezia được chia thành 7 loài, trong đó 6 loài sống lệ thuộc lipid là M. furfur, M. globosa, M. obtusa, M. restricta, M. sloofiae, M. sympodialis và một loài sống không lệ thuộc lipid là M. pachydermatis, thường sống ở thú nhưng có khả nănggây nhiễm khuẩn huyết ở người đặt ống thông và truyền dịch giàu lipid. Hiện nay vai trò gây bệnh cuả các loài Malassezia spp có thể thay đổi, một số tác giả nhận thấy M. sympodialis và M. globosa là các loài chiếm ưu thế trên da bệnh lang ben (3,5) . Sự phân bố khác nhau này có thể ảnh hưởng đến kết quả điều trị do đáp ứng với thuốc kháng nấm ở in vitro khác nhau tùy loài Malassezia. Việt Nam thuộc nước nhiệt đới nên bệnh lang ben rất thường gặp nhất là ở người dân lao động. Nấm men gây bệnh lang ben ở cơ địa người Việt Nam chưa được hiểu rõ nên có thể gặp một số khó khăn trong nghiên cứu thuốc kháng nấm dùng điều trị như không biết chính xác loài gây bệnh, không có được sự thống nhất hoặc khó so sánh các kết quả thu được từ những nghiên cứu trên các bệnh liên quan đến nhóm nấm này. Ly trích và định danh Malassezia spp. ở vẩy da của một số người Việt Nam bệnh lang ben, gàu hoặc da người bình thường theo phân loại mới, chúng tôi hy vọng giải quyết một số vấn đề liên quan đến nhóm nấm này như phương pháp ly trích và định danh, bước đầu khảo sát sự phân bố của Malassezia spp. trên da người Việt Nam, và các chủng nấm ly trích sẽ được sử dụng trong khảo sát tác dụng của các chất kháng nấm. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguồn ly trích vi nấm Vẩy da bệnh lang ben, gàu và da bình thường của một số người tình nguyện sống ở các địa phương như Bến Tre, TP. HCM, học viên trung học thuộc khoa xét nghiệm và kỹ thuật y học, y học cổ truyền, kỹ thuật hình ảnh ĐH YD TP. HCM (2004-2006). Ly trích vi nấm Malassezia spp. Lấy mẫu da: vẩy da từ các đối tượng bị bệnh lang ben, gầu, và da bình thường được lấy vô trùng bằng tăm bông. Vẩy da sau khi lấy mẫu được cấy ngay vào môi trường SDA-S và môi trường m-Dixon trong vòng 24 giờ. Ủ ở 32 o C từ 48 giờ đến 1 tuần. Chọn những khóm nấm có các đặc điểm của nấm men là có đường kính khoảng 1 mm, màu kem, trơn bóng để xác định đặc điểm của chi. Xác định chi Malassezia Vi nấm ly trích nếu thuộc chi Malassezia sẽ có những đặc điểm sau: - Thuộc nấm men ở môi trường dùng ly trích. - Không phát triển trên môi trường SDA trừ M. pachydermatis. - Quan sát ở kính hiển vi quang học: tế bào men, nẩy chồi trên một cổ rộng và nẩy chồi ở một cực. Tế bào nấm men hình cầu hay bầu dục, kích thước nhỏ khoảng 2,0- 6,0 µm x 1,5-4,5 µm. Xác định loài Malassezia dựa vào phản ứng sinh hóa Các phản ứng sinh hoá dùng định danh Malassezia spp. gồm: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng đồng hoá Tween khảo sát bằng phương pháp khuếch tán, phản ứng catalase và sự thuỷ phân esculin. Ngoài ra để phân biệt M. furfur và các loài Malassezia cần acid béo khác có thể ứng dụng khả năng sử dụng Cremophor El làm nguồn chất béo cần thiết (2) .Từ các phản ứng sinh hóa trên có thể định danh Malassezia spp. theo khoá phân loại sau: Bảng 1. Khoá định danh Malassezia spp. (4) V i nấm S DA C at. U .ase 0 oC T w.20 T w.40 w. 60 w. 80 C re. EL sc. M . furfur - + + + + + /w M . globosa - + + - - - M . obtusa - + + - - - M . pachyde rmatis + + /- + + + + /- /- M . - - + - - - V i nấm S DA C at. U .ase 0 oC T w.20 T w.40 w. 60 w. 80 C re. EL sc. restricta M . slooffiae - + + + + - M . sympodi alis - + + - + - Ghi chú: Cat.: catalase ; U.ase: urease: Tw: Tween; Cre.El: Cremophor EL; Esc: Esculin; w: phản ứng xảy ra yếu hoặc chậm. KẾT QUẢ Kết quả ly trích Malassezia spp. từ vẩy da Đã ly trích được 75 chủng nấm từ 37 mẫu da lang ben, 17 mẫu da gàu và 21 mẫu da bình thường với các đặc điểm thuộc chi Malassezia như sau: - Không phát triển ở môi trường SDA. - Cho khóm nấm màu kem với đường kính khoảng 1mm khi phát triển trên môi trường SDA bổ sung dầu oliu hoặc môi trường m- Dixon. - Quan sát ở kính hiển vi: tế bào nấm hình cầu hoặc bầu dục, nẩy chồi 1 cực, kích thước nhỏ khoảng 2,0- 6,0 µm x 1,5-4,5 µm (hình 2). Kết quả định danh các chủng Malassezia ly trích dựa vào phản ứng sinh hóa (bảng 2) Từ kết quả định danh cho thấy: - M. furfur chiếm tỉ lệ cao trên cả 3 nhóm vẩy da: 57,33% (43/75). - M. sympodialis chiếm tỉ lệ thấp hơn 26,66% (20/75) - M. globosa và M. restricta chiếm tỉ lệ rất thấp (4/75 và 2/75). - Đặc biệt có 6 chủng M2, M3, M5, M12, M13, M24 mang đặc điểm của chi Malassezia, nhưng khác với đặc điểm của các loài đã được Gueho và cs. mô tả - Chưa phát hiện được M. obtusa và M. slooffiae. BÀN LUẬN Tất cả các chủng nấm ly trích được trên toàn bộ 75 mẫu thuộc cả 3 nhóm vẩy da người tình nguyện đều không phát triển ở môi trường SDA. ở các môi trường có bổ sung chất béo cần thiết cho khóm nấm dạng nấm men, ở kính hiển vi quang học cho tế bào nấm men nẩy chồi ở 1 cực trên một cổ rộng, đây là các đặc điểm chung của chi Malassezia. Bảng 2. Đặc điểm sinh hóa và tên khoa học các chủng Malassezia spp. ly trích từ vẩy da Ch ủng Vẩy da SDA 32 o C 40 o C Tw. 20 Tw. 40 Tw. 60 80 M. A Chứng - + + + + + M1 LB - + + + + + M2 BT - + w w + + Ch ủng Vẩy da SDA 32 o C 40 o C Tw. 20 Tw. 40 Tw. 60 80 M3 BT - + w w + + M4 LB - + + + + + M5 LB - + + - + + M6 LB - + + + + + M7 LB - + + + + + M8 LB - + + + + + M9 LB - + w - + + [...]... mới nhưng với những phương tiện và kỹ thuật hiện có, chúng tôi chưa thể định danh chúng đến mức loài Nghiên cứu về sự phân bố các loài Malassezia theo phân lọai chính thức năm 1996 chưa được thực hiện nhiều Các kết quả khảo sát về sự phân bố Malassezia spp ở da người trong những năm gần đây có sự thay đổi theo quốc gia Thí dụ Bita Tarazooie và cộng sự, đã ly trích và định danh các vi nấm từ da một số... M slooffiae Malassezia 8,1 5,88 9,52 0 spp n: cỡ mẫu KẾT LUẬN Qua phân lập và định danh 75 chủng nấm ly trích từ vẩy da bệnh lang ben, gàu và da bình thường của người Việt Nam tình nguyện, bước đầu chúng tôi nhận thấy M furfur là loài trội nhất, kế đến là M sympodialis M globosa và M restricta chiếm tỉ lệ thấp Chưa phát hiện được M obtusa, M slooffiae và M pachydermatis 6 chủng chưa định danh được do... ATCC 44344 M Malassezia sp M24 globosa M sympodialis M9 M60 Hình 3: Hình thể tế bào Malassezia spp ở kính hiển vi quang học (x 100) Các đặc điểm còn lại như sinh men catalase, khả năng đồng hóa các loại Tween và Cremophore EL rất rõ rệt, giúp việc định danh dễ dàng Riêng phản ứng thủy phân esculin giúp phân biệt M furfur và M sympodialis xảy ra nhanh và rõ rệt khi các chủng nấm được ly trích mới, chưa... người sống ở Iran bị bệnh lang ben và da người bình thường, vào năm 2003, theo phương pháp sinh hóa, kết quả định danh cho thấy M globosa chiếm tỉ lệ cao nhất(2) Trong khi Kindo AJ và cộng sự, xác định được M sympodialis chiếm đa số trên da người bình thường ở miền nam Ấn Độ, kết quả này giống với các nghiên cứu khác ở Canada, Nga và Thụy Điển trên người bị viêm da dị ứng và cả trên người bình thường (5)... furfur và M sympodialis là 2 loài phổ biến hiện diện trên da người bình thường cũng như ở da người bệnh lang ben và gàu ở một số người Việt Nam tình nguyện M globosa và M restricta chiếm tỉ lệ thấp trong các đối tượng nghiên cứu Trong 75 mẫu thu thập được, không tìm thấy sự hiện diện của M obtusa, M slooffiae 8% còn lại rơi vào các loài Malassezia lạ, các chủng này tuy có đặc tính sinh hoá của chi Malassezia. .. EL, Cat: catalase, Esc: esculin Hình 1 Phân bố các loài Malassezia ở các nhóm da Hình 2 Hình dạng khóm nấm Malassezia trên môi trường m-Dixon A: M globosa ủ ở 32 oC/72 giờ B: M furfur ở 32 oC/48 giờ Tất cả các chủng nấm ly trích phát triển tốt ở 32 oC M furfur và M sympodialis phát triển được ở 37 oC đến 40 oC nhưng chậm hơn ở 32 oC M restricta và M globosa không phát triển được ở nhiệt độ từ 37 oC... thường (5) So với các công bố trên, kết quả định danh nhận được từ 3 nhóm vẩy da của một số người Việt Nam tình nguyện có khác biệt: M furfur chiếm tỉ lệ cao nhất kế đến là M sympodialis Tuy nhiên so với da bình thường, tỉ lệ M sympodialis ở da bệnh lang ben cao hơn rõ rệt Bảng 3 So sánh sự phân bố các loài Malassezia ở một số nước trên thế giới Tỉ lệ Malassezia spp ở da người (%) Việt Nam Iran (1)... loại mới, vì vậy có thể đây là những loài mới mà chúng tôi chưa đủ điều kiện để định danh Do cỡ mẫu nghiên cứu còn giới hạn, các kết quả thu được chưa phản ánh được về mặt dịch tể học, nhưng đây là những thông tin mới về sự phân bố của các loài Malassezia spp ở người Việt Nam mà cho đến nay vẫn chưa được các nhà lâm sàng và vi nấm học ở nước ta quan tâm nghiên cứu 0 0 ... không phát triển được ở nhiệt độ từ 37 oC trở lên, khi ủ ở 32 oC các chủng nấm này cũng phát triển chậm hơn M furfur, phải từ 72 giờ trở lên đường kính khóm nấm mới đạt đường kính khoảng 1 mm Hình dạng và kích thước của tế bào men ở kính hiển vi quang học của các chủng tuy có sự khác biệt nhỏ như M globosa tế bào men hình cầu, trong khi các loài còn lại có tế bào men từ bầu dục đến hình trụ M sympodialis . LY TRÍCH VÀ ĐỊNH DANH MALASSEZIA SPP. TÓM TẮT Mục tiêu: Ly trích và định danh Malassezia spp. ở vẩy da của một số người Việt Nam bệnh lang. quan đến nhóm nấm này như phương pháp ly trích và định danh, bước đầu khảo sát sự phân bố của Malassezia spp. trên da người Việt Nam, và các chủng nấm ly trích sẽ được sử dụng trong khảo sát. KẾT QUẢ Kết quả ly trích Malassezia spp. từ vẩy da Đã ly trích được 75 chủng nấm từ 37 mẫu da lang ben, 17 mẫu da gàu và 21 mẫu da bình thường với các đặc điểm thuộc chi Malassezia như sau: