GEN KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM TÓM TẮT Đặt vấn đề: Vi khuẩn kháng kháng sinh có thể được truyền vào người thông qua chuỗi thực phẩm. Việc tìm hiểu các nguồn gene kháng kháng sinh cũng như cơ chế kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh từ thực phẩm là yêu cầu phục vụ cho sử dụng kháng sinh hợp lý. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh và gene kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ thực phẩm. Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm được xác định bằng phương pháp Kirby-Bauer. Phát hiện nhiều gene kháng thuốc trên một số vi khuẩn bằng phương pháp PCR. Kết quả nghiên cứu: Mức độ kháng kháng sinh của 156 chủng E. coli và 40 chủng Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm: tỷ lệ kháng với ít nhất 1 kháng sinh (80,1% và 77,5%); tỷ lệ kháng từ 2 kháng sinh trở lên (61,5% và 60%). Tỷ lệ các gene kháng kháng sinh trên 18 chủng E. coli và 11 chủng Salmonella spp. có cùng kiểu hình kháng đa kháng sinh (ampicillin- sulfamethoxazole/trimethoprim- tetracycline–chloramphenicol như sau: E. coli {blaTEM (88,9%), sul2 (72,2%), tetA (77,8%), clmA (61,1%), sul1 và tetB (38,9%), bla SHV (16,7%)}; Salmonella spp. {blaTEM (90,9%); sul2 (72,7%); tetA, tetB, và sul1 cùng là 63,6%; clmA (45,5%), blaSHV (18,2%)}. 7 chủng E. coli và 6 chủng Salmonella spp. đã không phát hiện được gen mã hóa cho sự kháng chloramphenicol. 5 chủng E. coli và 2 chủng Salmonella spp. có cùng kiểu hình đa kháng (tetracycline - chloramphenicol - SMX- TMP – ampicillin) và mang cùng kiểu gen kháng (bla TEM , sul2, tetA, clmA). Kết luận: Mức độ kháng kháng sinh của E. coli và Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm là khá cao. Trên 18 chủng E. coli và 11 Salmonella spp. kháng đa kháng sinh đã phát hiện thấy có tỷ lệ cao của các gen blaTEM, sul2 và tetA hơn sul1, clmA và bla SHV . Những vi khuẩn này có thể là mối nguy với sức khoẻ cộng đồng nếu chúng lây truyền qua chuỗi thực phẩm. ABSTRACT SURVEY ON ANTIBIOTICRESISTANCE GENES OF PATHOGENOUS BACTERIA ISOLATED FROM FOOD. Hoang Hoai Phuong, Nguyen Thi Ke, Pham Hung Van, Nguyen Do Phuc, Nguyen Thi Anh Dao, Tran Thi Ngoc Phuong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 12 - Supplement of No 4 - 2008: 283 - 290 Bacground: Antibiotic resistance bacteria can be transmitted to human through food. To find out about antibiotic resistance genes as well as mechanisms of the pathogenous bacteria from food is necessary for using antibiotic. Objectives: The pathogenous bacteria isolate from food was investigated for its susceptibility to antimicrobial agents and the presence of the antibiotic resistance genes. * Viện Vệ sinh Y tế Công cộng Tp. Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh Methods: A descriptive and cross-sectional study design was applied. The isolates were examined for susceptibility to to antimicrobial agents by Kirby Bauer method. PCR assays were performed to identify the resistance genes. Results: 80.1% of E. coli isolates were resistant to at least one antibiotic and 61.,5% were resistant to two or more antibiotic. 77.5% of the Salmonella spp. were resistant to at least one antibiotic and 60% were resistant to two or more antibiotic. The incidence of resistance genes of 18 multiple-antibiotic-resistant E. coli strains were detected to blaTEM (88.9%), sul2(72.2%), tetA (77.8%), clmA (61.1%), sul1 (38.9%), tetB (38.9%) and bla SHV (16.7%). The incidence of resistance genes of 11 multiple-antibiotic-resistant Salmonella spp. strains were detected to blaTEM (90.9%), sul2 (72.7%), tetA (63.6%), tetB (63.6%), sul1(63.6%), clmA (45.5%) and blaSHV (18.2%). The clmA gene was not found in seven E. coli strains and six Salmonella spp. strains. Five E. coli strains and two Salmonella spp. strains showed both multiple-antibiotic-resistance phenotype (tetracycline-chloramphenicol-SMX- TMP-ampicillin) and genotype (bla TEM , sul2, tetA, clmA). Conclusions: The incidence of resistance was observe in food isolates in this study is high. Among multiple-antibiotic-resistant E. coli and Salmonella spp. strains, the resistance gene to blaTEM, sul2 and tetA was most often observed. These organisms may become a public health risk should they enter the food chain. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong hơn hai thập kỷ qua, sự nổi lên và lan truyền các vi sinh vật kháng kháng sinh đã và đang trở nên là mối nguy lớn với sức khoẻ cộng đồng trên toàn thế giới. Do việc sử dụng kháng sinh tràn lan cho động vật (điều trị và phòng ngừa), dùng liều thấp để kích thích tăng trưởng đã tạo một sức ép chọn lọc làm vi khuẩn kháng kháng sinh. Mặt khác, do toàn cầu hóa về cung cấp thực phẩm đã làm lan truyền các vi sinh vật kháng kháng sinh và chúng được lây truyền vào người thông qua chuỗi thực phẩm. Những nhân tố di truyền di động (mobile genetic elements) như plasmid, transposon, và integron có thể lan truyền các gen kháng kháng sinh theo chiều dọc hoặc chiều ngang giữa các vi khuẩn. Ðồng thời, các nhân tố này còn đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển và lan truyền của đề kháng đa kháng kháng sinh ở vi khuẩn. Mặt khác, những phân tích phân tử của gen kháng kháng sinh đã cho biết vi khuẩn kháng kháng sinh nhiễm trong thực phẩm không tách biệt khỏi vi khuẩn của người và sự tiếp hợp giữa các vi khuẩn đã làm lan truyền gen kháng kháng sinh (2,11) . Tỷ lệ nhiễm cao của các vi khuẩn gây bệnh trong thịt tươi, sữa và các thực phẩm khác cùng với sự lạm dụng sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp đã làm vấn đề kháng kháng sinh càng trở nên trầm trọng. Vấn đề kháng kháng sinh sẽ không được giải quyết nếu có sự lan truyền của các gen kháng kháng sinh vào hệ vi khuẩn ở người thông qua chuỗi thực phẩm. Trong suốt những năm gần đây, hầu hết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tìm hiểu tính kháng kháng sinh và các gen kháng kháng sinh ở các vi sinh gây bệnh phân lập từ các mẫu bệnh phẩm hoặc động vật. Còn những nghiên cứu tìm hiểu tính kháng kháng sinh của các vi sinh gây bệnh phân lập từ thực phẩm thì hiếm. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn từ thực phẩm nhưng chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu về gen kháng kháng sinh cũng như cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn từ thực phẩm.Vì thế, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu: “Khảo sát gen kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm”. Mục tiêu nghiên cứu Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ thực phẩm. Xác định gen kháng kháng sinh của vi khuẩn kháng kháng sinh đã phân lập. Phân tích và so sánh giữa kiểu hình với kiểu gen kháng của các vi khuẩn kháng kháng sinh. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Thời gian nghiên cứu từ 2/2007-12/2007. Ðối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm (pho mai, kem ăn, giò lụa, nem chua, chả giò, lạp xưởng, rau quả, trứng, thịt và thủy sản tươi ): 156 chủng E. coli và 40 chủng Salmonella spp Phương pháp nghiên cứu Phương pháp Kirby-Bauer dùng kiểm tra tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm (1,6) . Phương pháp xử lý và phân tích số liệu bằng phần mềm Epi-Info 6.04. Phương pháp PCR để phát hiện các gen kháng kháng sinh: Từ các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm có kiểu hình kháng kháng sinh đã được xác định, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để xác định các gen kháng kháng sinh. Việc khuếch đại các gen kháng kháng sinh mục tiêu dựa trên việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng cho từng gen kháng kháng sinh (bảng 1). Bảng 1: Trình tự mồi dùng trong khuếch đại các gen kháng thuốc Kiểu h ình kháng kháng sinh Tên mồi Gen mục tiêu Kích thư ớc sản phẩm (bp) TEM bla TEM 1,150 Ampicillin SHV bla SHV 885 TetA tetA 937 Tetracyclin TetB tetB 416 Kiểu h ình kháng kháng sinh Tên mồi Gen mục tiêu Kích thư ớc sản phẩm (bp) Chloramphenicol Cml cmlA 455 Sul sul1 789 Sulfamethoxazol Sul2 sul2 722 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Mức độ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm Mức độ kháng kháng sinh của E. coli Tỉ lệ (%) kháng kháng sinh của 156 chủng E. coli phân lập từ thực phẩm như sau: tetracycline (59,6%), chloramphenicol (50%), SMX/TMP (45,5%), ampicillin (40,4%), nalidixic acid (20,5%), ciprofloxacin (10,9%), gentamicin (9,6%), amoxicillin/clavunic acid (7,7%), cefuroxime axetil (1,9%), amikacin (0,6%), cefepime (0,6%), ceftriaxone (0,6%) và 100% các chủng E. coli cảm nhạy với imipenem, và ticarcillin. Như vậy, 156 chủng E. coli phân lập từ thực phẩm có tỉ lệ kháng cao với tetracycline, chloramphenicol, SMX/TMP và ampicillin. Kết quả này cũng giống với một số nghiên cứu khác trên thế giới (10,11,1) . Bảng 2: Tỉ lệ nhạy cảm và kháng với 16 kháng sinh của E. coli Tỉ lệ (%) Kháng Nh ạy cảm Kháng ít nhất 01 khán g sinh 80,1 (125) 19,9 (31) Kháng 2- 7 kháng sinh 61,5 (96) 38,5 (60) Kháng (Am-Te-Cl- SMX/TMP) 19,2 (30) 81,8 (126) Ở bảng 2 đã cho thấy: Tỉ lệ nhạy cảm với 16 loại kháng sinh của 156 chủng E. coli phân lập từ thực phẩm là 19,9%, kháng ít nhất 1 kháng sinh là 80,1% và kháng đa kháng sinh (kháng 2-7 kháng sinh) là 61,5%. Ở nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ kháng đa kháng sinh của E. coli cao hơn có với kết quả của nhóm Nguyễn Thị Kê (32,6%) (5) . Trong số các chủng E. coli kháng đa kháng sinh thì kiểu hình đa kháng với cả 4 kháng sinh (tetracycline - chloramphenicol - SMX./TMP - ampicillin) là phổ biến nhất có 30 chủng (19,2%). Kiểu hình kháng này giống với kiểu hình kháng của E. coli phân lập từ thịt của nhóm nghiên cứu Tô Liên Thu và nhóm Saenz (5,8) . Mức độ kháng kháng sinh của Salmonella spp. Tỉ lệ (%) kháng kháng sinh của 40 chủng Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm như sau: chloramphenicol (67,5%), tetracyclin (65,0%), sulfamethoxazole- trimethoprim (37,5%), ampicillin (37,5%), nalidixic acid (27,5%), ciprofloxacin (12,5%), gentamicin (5%) và 100% các chủng Salmonella spp. nhạy cảm với amikacin, cefeperazone, cefepime, cefuroxime axetil, ceftriaxone, ceftazidime, imipenem, ticarcillin. Như vậy, 40 chủng Salmonella spp. phân lập từ thực phẩm có tỉ lệ kháng cao với tetracycline, chloramphenicol, SMX/TMP và ampicillin. Khi so sánh với kết quả nghiên cứu của nhóm Miko, nhóm Antunes và nhóm Duffy thì thấy gần tương đồng nhau về kiểu hình kháng kháng sinh nhưng khác nhau về tỉ lệ kháng (%). Tỉ lệ Salmonella spp. kháng kháng sinh trong nghiên cứu của chúng tôi có thấp hơn so với nghiên cứu của Miko {(Salmonella enterica phân lập từ thực phẩm kháng với ampicillin (73%), sulfamethoxazole (92%), chloramphenicol (48%), trimethoprim [...]... điện di sản phẩm PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh Tỉ lệ phát hiện gen kháng kháng sinh trên các chủng E coli kháng đa kháng sinh Tỉ lệ phát hiện 7 gen kháng sinh (blaTEM, blaSHV, tetA, tetB, sul1, sul2 và clmA) trên 18 chủng E coli kháng đa kháng sinh phân lập từ thực phẩm được thể hiện ở bảng 4 Bảng 4: Kết quả PCR phát hiện 7 gen kháng kháng sinh trên 18 chủng E coli Số chủng có Số Kháng Kiểu... kiểu hình và kiểu gen kháng của các chủng E coli kháng đa kháng sinh Khi phân tích và so sánh giữa kiểu hình với kiểu gen kháng kháng sinh trên 18 chủng E coli kháng đa kháng sinh (Am SMX-TMP Te Cl) chúng tôi thấy rằng: E coli phân lập từ thực phẩm có thể mang nhiều gen kháng kháng sinh tương ứng cho kiểu hình kháng kháng sinh 7 chủng E coli có mang 2 gen mã hóa cho kháng 1 loại kháng sinh như: blaTEM... trên 11 chủng Salmonella spp Số chủng có Số Kiểu mang Kháng sinh chủng gen kháng gen kháng kháng (tỷ lệ%) 10 ampicillin 11 blaTEM (90,9%) Số chủng có Số Kiểu mang Kháng sinh chủng gen kháng gen kháng kháng (tỷ lệ%) 2 blaSHV (18,2%) 7 Sul1 (63,6%) SMX/TMP 11 8 Sul2 (72,7%) 7 tetA (63,6%) tetracyclin 11 tetB 7 Số chủng có Số Kiểu mang Kháng sinh chủng gen kháng gen kháng kháng (tỷ lệ%) (63,6%) 5 chloramphenicol... sul 2(36,9%) Khi so sánh giữa kiểu hình và kiểu gen kháng kháng sinh trên 11 chủng Salmonella spp kháng đa kháng sinh (Am SMX-TMP Te Cl) chúng tôi thấy rằng: Salmonella spp phân lập từ thực phẩm có thể mang nhiều gen kháng kháng sinh tương ứng cho một kiểu hình kháng kháng sinh 7 chủng Salmonella spp có mang 2 gen kháng mã hóa cho kháng 1 loại kháng sinh như: blaTEM và blaSHV có trong 1 chủng, sul1... kiểu gen kháng (blaTEM, sul2, tetA, clmA); 2 chủng mang cùng kiểu gen kháng (blaTEM, sul1, tetB, clmA) KẾT LUẬN Mức độ kháng kháng sinh của E coli và Salmonella spp phân lập từ thực phẩm đều khá cao: 80,1% E coli và 77,5% Salmonella spp kháng với ít nhất 1 kháng sinh Tỉ lệ kháng đa kháng sinh (từ 2 kháng sinh trở lên) của E coli, và Salmonella spp lần lượt là 61,5% và 60% Salmonella spp và E coli đều kháng. .. -lactamase cho phép vi khuẩn kháng ampiciilin, tetA và tetB mã hóa cho kháng tetracyclin, sul1 và sul2 mã hóa cho kháng sulfamethoxazol, clmA mã hóa cho kháng chloramphenicol) trên chủng E coli và Salmonella spp kháng đa kháng sinh như đã lựa chọn ở trên Kết quả PCR phát hiện gen kháng kháng sinh ở một số chủng E coli Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh trên một số chủng E coli... coli phân lập từ thực phẩm và bệnh phẩm tại thành phố Hồ Chí Minh Vì thế, rất có thể E coli kháng ampicillin phân lập từ bệnh phẩm là có nguồn gốc lây truyền từ E coli có trong thực phẩm Mặt khác, so sánh với kết quả nghiên cứu của nhóm Saenz thì thấy: có sự giống nhau kiểu gen kháng cho kiểu hình đa kháng (ampicillin-SMX/TMPtetracyclin-chloramphenicol) của các chủng E coli Ðó là với kiểu hình kháng. .. KIẾN NGHỊ Ðể đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và giảm sự lây truyền các vi sinh vật kháng kháng sinh cần tăng cường giám sát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm nhất là giám sát vi sinh Cần có những nghiên cứu tiếp theo về dịch tễ học phân tử của các gen kháng kháng kháng sinh của các vi sinh vật lây truyền bằng đường thực phẩm ... {(Salmonella phân lập từ thịt ở Ireland có 92% kháng tetracycline, 83% kháng sulfamethoxazole)} nhưng tỉ lệ có cao hơn so nhóm Antunes {(Salmonella enterica phân lập từ thực phẩm ở Bồ Ðào Nha kháng với ampicillin (17%), sulfamethoxazole (17%), tetracycline (19%)}(1,5,1) Bảng 3: Tỉ lệ nhạy cảm và kháng với 16 kháng sinh của Salmonella spp Tỉ lệ kháng (%) Kháng N hạy cảm Kháng ít 77,5% nhất 01 kháng sinh (31) Kháng. .. (31) Kháng 2-6 kháng sinh SMX/TMP) (9) 60% (24) Kháng (Am-Te-Cl- 22,5 38,5 (16) 27,5 (11) 72,5 (29) Qua bảng 3 cho thấy: 22,5% các chủng Salmonella spp nhạy cảm với tất cả các kháng sinh thử nhưng có 77,5% (31 chủng) kháng ít nhất 1 kháng sinh và 60% (24 chủng) là kháng đa kháng sinh (kháng 2-6 kháng sinh) So sánh với kết quả của một số nhóm nghiên cứu thì thấy tỉ lệ kháng đa kháng sinh của 40 chủng . cảm kháng sinh và gene kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ thực phẩm. Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh. cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ thực phẩm. Xác định gen kháng kháng sinh của vi khuẩn kháng kháng sinh đã phân lập. Phân tích và so sánh giữa kiểu hình với kiểu gen kháng. độ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ thực phẩm Mức độ kháng kháng sinh của E. coli Tỉ lệ (%) kháng kháng sinh của 156 chủng E. coli phân lập từ thực phẩm như sau: