46 Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau Chất kích thích sinh trƣởng Nồng độ (mg/l) Phản ứng màu với thuốc thử Wagner NAA 0 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) 0,1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 0,5 Vòng nhẫn đỏ nâu(++++) 1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 5 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) 10 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) IAA 0,1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+) 0,5 Vòng nhẫn đỏ nâu(+) 1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 5 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 10 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) +: nhạt màu, ++ : đậm vừa, +++ : đậm, ++++ : đậm màu nhất 1 2 3 4 5 6 Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau, 1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l, phản ứng tạo vòng nhẫn (mũi tên). 47 Kết quả ở hình 4.6 và 4.7 cho thấy tất cả các mẫu thí nghiệm đều phản ứng với thuốc thử tạo vòng nhẫn màu nâu đỏ (giống mẫu đối chứng), điều này chứng tỏ tất cả các mẫu rễ đều có chứa alkaloid. Vì alkaloid phân bố khác nhau ở thân, lá và rễ (2.3.3) nên khi nhận biết bằng thuốc thử ở các mẫu rễ ta không thấy sự xuất hiện kết tủa như ở mẫu thân lá. Khi cho cùng lượng thuốc thử vào các mẫu, quan sát thấy mẫu được nuôi trên môi trường có bổ sung NAA tạo vòng nhẫn đậm màu hơn so với các mẫu cây được nuôi trên môi trường có chứa IAA. Trong tất cả các nồng độ NAA đã thí nghiệm, mẫu cây được nuôi trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l cho kết quả tạo màu đậm nhất. Việc sử dụng NAA ở nồng độ cao (5 mg/l, 10 mg/l) tạo vòng nhẫn mờ và dễ bị hòa tan có thể là do ở nồng độ này cây thích hợp cho việc tạo mô sẹo chứ không kích thích lên sự phát triển của rễ. Ngược lại các mẫu trên môi trường có bổ sung IAA vòng nhẫn đậm màu ở mẫu 3, 4, đậm vừa ở mẫu 5 và nhạt màu ở mẫu 1 và 2, điều này có nghĩa là việc sử 1 2 3 4 5 Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau. 1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l. ường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau. Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau, 1) 0,1 mg/l, 2) 0,5 mg/l, 3) 1 mg/l, 4) 5 mg/l, 5)10 mg/l, phản ứng tạo vòng nhẫn (mũi tên). 48 dụng IAA ở nồng độ 1 mg/l và 5 mg/l có thể kích thích lên sự sản sinh alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro. Như vậy việc sử dụng auxin ở nồng độ thích hợp (NAA 0,5 mg/l; IAA 1 mg/l) có thể tác động đến sự tích lũy alkaloid ở rễ. Tóm lại khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l cây Trường xuân hoa in vitro có thể đạt được hàm lượng alkaloid cao. Trong đó lượng alkaloid tập trung nhiều ở thân lá. 4.5. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm quy trình ly trích alkaloid Trƣờng xuân hoa Tiến hành ly trích mẫu theo hai quy trình khác nhau: + Quy trình 1: ly trích alkaloid từ vật liệu tươi (trang 33) + Quy trình 2: ly trích alkaloid từ vật liệu khô (trang 34) Dịch chiết alkaloid sau khi ly trích được phân tích bằng CE Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l (A), vindoline 20 mg/l (B), Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2 và điện thế áp 10 kV; bơm 3 s ở 25 mbar; nhiệt độ 25 o C 49 Khi phân tích dịch chiết alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa tươi và khô bằng CE đều nhận thấy có sự hiện diện của catharanthine và vindoline trong mẫu. Khi tiến hành ly trích từ mẫu tươi, kết quả trên hình 4.9 cho thấy nhiều hợp chất trong cây được nhận diện (mỗi pic đại diện cho một chất) nhưng theo kết quả tính toán các dịch alkaloid ly trích từ mẫu tươi (quy trình 1) có hàm lượng cathẩnthine và vindoline thấp hơn so với các dịch alkaloid ly trích bằng mẫu khô (quy trình 2) ( xem bảng 4.9). 2 a b Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo, mẫu ly trích ở dạng tươi. a) Catharanthine, b) vindoline. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2 và điện thế áp 10. kV; nhiệt độ 25 o C 50 Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE Hàm lượng Catharanthine (mg/100mg vật liệu khô) Hàm lượng Vindoline (mg/100mg vật liệu khô) Quy trình 1 0,00348 0,02704 Quy trình 2 0,02087 0,05216 b a Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo, mẫu ly trích ở dạng khô, a) Catharanthine, b) vindoline Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25 o C 51 Kết quả phân tích ở hình 4.9 và 4.10 cho thấy sự phân tách alkaloid ở mẫu khô tốt hơn so với mẫu tươi, vì khi ly trích bằng vật liệu tươi, mẫu có độ nhớt cao hơn sẽ làm cản trở quá trình phân tách các chất dẫn đến có píc đôi. Hơn nữa, theo quy trình ly trích 1 thì mẫu phải trải qua nhiều giai đoạn tiếp xúc với dung môi nên lượng alkaloid bị hao hụt và thời gian để chuẩn bị mẫu lâu hơn so với quy trình 2, có thể lượng alkaloid đã bị ảnh hưởng một phần bởi ánh sáng do mẫu để lâu ngoài môi trường. Hàm lượng catharanthine ly trích theo quy trình 2 cao 4 lần so với lượng catharanthine thu được sau khi ly trích theo quy trình 1, còn lượng vindoline thì cao gấp 2 lần (Biểu đồ 4.1). Như vậy việc sử dụng quy trình ly trích từ mẫu khô cho kết quả tốt hơn. 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 QT1 QT 2 Quy trình ly trích indol alkaloid (%chất khô) Catharanthine vindoline Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích mẫu cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2. Qua thí nghiệm này cho thấy quy trình ly trích bằng mẫu khô cho kết quả phân tích alkaloid tốt hơn, vì quy trình ly trích mẫu tươi khá phức tạp và tốn nhiều thời gian, mẫu phải được ly trích ngay khi thu hoạch, không bảo quản được lâu như 52 mẫu khô nên không thuận lợi khi thực hiện nghiên cứu. Trong khi đó, mẫu vật liệu được bảo quản dễ dàng, chỉ cần trữ mẫu nơi khô ráo, tránh hút ẩm. 4.6. Thí nghiệm 4: Định lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây Trƣờng xuân hoa in vivo Trước khi tiến hành phân tích một mẫu, máy CE được luyện cột với dung dịch đệm và chạy chuẩn alkaloid của Trường xuân hoa. Ly trích mẫu cây Trường xuân hoa in vivo và cây in vitro theo quy trình 2, sau đó đem phân tích alkaloid bằng CE, kết quả thu được như sau: Catharanthin e Catharanthine Vindolin e Vindolin e Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25 o C Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi, cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25 o C. 53 Kết quả trình bày ở hình 4.11 và 4.12 cho thấy trong mẫu Trường xuân hoa in vitro và in vivo đều có chứa catharanthine và vindoline khi so với catharanthine và vindolin chuẩn. Nhưng hàm lượng các chất này trong cây in vitro cao hơn so với cây in vivo (Bảng 4.10). Bảng 4.10. Hàm lượng Catharanthine và Vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo Quan sát biểu đồ 4.2 nhận thấy ở cùng một thời điểm thu hoạch nhưng các cây Trường xuân hoa in vitro có thể sản xuất lượng catharanthine và vindoline cao Hàm lượng Catharanthine (mg/100mg vật liệu khô) Hàm lượng Vindoline (mg/100mg vật liệu khô) Cây in vitro 0,02149 0,03642 Cây in vivo 0,01969 0,01744 54 hơn so với cây in vi vo, như vậy việc sử dụng các cây Trường xuân hoa in vitro làm nguồn sản xuất các indol alkaloid là có thể thực hiện được. Điều này rất có ích cho việc sản xuất các indol alkaloid trên quy mô công nghiệp vì có thể kiểm soát được quá trình nuôi cấy và kích thích cây sản xuất các hợp chất mong muốn. Hơn nữa ngoài việc nhân nhanh các cây Trường xuân hoa có khả năng sản xuất alkaloid với hàm lượng cao, nuôi cấy in vitro còn có lợi điểm là giảm không gian sử dụng và giảm chi phí so với nhân giống in vivo. Việc này có thể góp phần làm giảm giá thành các alkaloid. 4.2.4 Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng hệ thống điện di mao quản Xác định hàm lượng của catharanthine và vindoline trong mẫu cây Trường xuân hoa ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày tuổi trên môi trường có NAA 0,5 mg/l thu được kết quả như sau: Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy Trong các mẫu phân tích, hàm lượng catharanthine cao nhất thu được từ cây nuôi cấy mô ở giai đoạn 28 ngày (0,0394 %). Điều này có thể giải thích là do catharanthine được sản xuất ở rễ và khi so sánh với kết quả nuôi cấy mô nhận thấy cây có khả năng phát triển rễ mạnh nhất sau 28 ngày trên môi trường bổ sung NAA. Trong khi đó, hàm lượng vindoline cao nhất là ở 7 ngày tuổi và giảm dần sau 35 Ngày Hàm lượng catharanthine (mg/100mg vật liệu khô) Hàm lượng vindoline (mg/100mg vật liệu khô) 7 0,0326 0,0371 14 0,0342 0,0112 21 0,0141 0 28 0,0394 0,0274 35 0,0291 0,0224 55 ngày tuổi. Riêng ở giai đoạn 21 ngày không phát hiện được vindoline trong cây, có thể vì ở giai đoạn này vindoline không cần thiết cho cây nên không được tổng hợp hoặc được tổng hợp với hàm lượng thấp và bị loại bỏ trong bớt trong quá trình ly trích nên không phát hiện được khi phân tích bằng CE. Điều này chứng tỏ mỗi loại alkaloid đạt được hàm lượng cao ở những giai đoạn khác nhau. Do đó việc xác định được thời điểm cây sản xuất các hợp chất quan tâm là rất quan trọng. Thí nghiệm này xác định được giai đoạn nuôi cấy thích hợp của cây Trường xuân hoa, trên môi trường bổ sung NAA để thu nhận vindoline là 7 ngày tuổi và catharanthine là 28 ngày tuổi . lượng catharanthine và vindoline giữa cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo Quan sát biểu đồ 4.2 nhận thấy ở cùng một thời điểm thu hoạch nhưng các cây Trường xuân hoa in vitro có thể. và 4.12 cho thấy trong mẫu Trường xuân hoa in vitro và in vivo đều có chứa catharanthine và vindoline khi so với catharanthine và vindolin chuẩn. Nhưng hàm lượng các chất này trong cây in vitro. mg/l và 5 mg/l có thể kích thích lên sự sản sinh alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro. Như vậy việc sử dụng auxin ở nồng độ thích hợp (NAA 0,5 mg/l; IAA 1 mg/l) có thể tác động đến sự tích