21 kể tỷ lệ sẩy thai từ 10% đến 11%. Đo hàm lƣợng progesterone trong máu hoặc sữa vào ngày thứ 21 đến ngày thứ 24 sau khi gieo tinh để có thể xác định tình trạng có hay khơng có thai ở bò cái. Cơ sở của việc ứng dụng hàm lƣợng progesterone vào ngày thứ 21 sau khi gieo tinh để xác định sớm sự mang thai của bò cái. Hình 2.4 Động thái progesterone giúp chẩn đốn sớm có thai (Chung Anh Dũng, 2002) 2.6.5 Các chỉ định và ứng dụng của xét nghiệm progesterone trong sữa 2.6.5.1 Chẩn đốn bò mang thai và khơng mang thai Việc chẩn đốn có thai sớm bằng progesterone chính xác khoảng 80%, 20% sai sót là do sự khác nhau về độ dài của chu kỳ động dục giữa các bò, các nhầm lẫn trong phát hiện động dục, bệnh tử cung nhƣ bọc mủ tử cung, hoạt động khác thƣờng của buồng trứng nhƣ u nang thể vàng hoặc nang trứng và phơi chết sớm. Việc sử dụng progesterone để chẩn đốn có thai cần phải kết hợp với khám thai 40 ngày, hoặc muộn hơn sau khi phối giống. Tuy nhiên, với một loạt các mẫu lấy vào ngày 0 (ngày phối tinh) và các ngày thứ 21 và 24, việc chẩn đốn sự khơng có thai có thể Chẩn đóan có thai dựa vào hàm lượng progestron ………… Không có thai Progesteron trong máu(ng/ml) Ngày trong chu kỳ động dục 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Có thai Chẩn đóan có thai dựa vào hàm lượng progestron ………… Không có thai Progesteron trong máu(ng/ml) Ngày trong chu kỳ động dục 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Có thai 22 đạt tới độ chính xác 95 – 100%. Do vậy, progesterone vốn đƣợc coi là công cụ để chẩn đoán có thai sớm nên đƣợc sử dụng cho mục đích chẩn đoán không có thai và từ đó có thể xác định đƣợc tình trạng có thai hay không có thai của gia súc. Việc sớm xác định không có thai này sẽ tránh đƣợc sự bỏ lỡ cơ hội phối giống tiếp theo (Chung Anh Dũng, 2002). 2.6.5.2 Xác nhận động dục Bò cái thƣờng không có dấu hiệu động dục rõ ràng dẫn đến việc quyết định phối giống sai. Vào thời điểm phối tinh có tới 15 – 20% bò sữa không động dục. Ở một số trang trại, tỷ lệ phát hiện động dục sai có thể cao tới 50% hoặc hơn. Progesterone trong sữa có thể dùng để xác định động dục ở bò. Nếu mẫu sữa kiểm tra cho thấy hàm lƣợng progesterone cao thì có thể bò không động dục và cần đƣợc theo dõi cẩn thận cũng nhƣ kiểm tra lại các mẫu lấy vào thời điểm muộn hơn. Có thể tiến hành đơn giản bằng cách giữ lại mẫu sữa vào thời điểm bò đƣợc đƣa ra để phối tinh cho đến khoảng 2 tuần hoặc một tháng sau. Nếu nhiều hơn 10% số bò đƣợc phối tinh vào thời điểm có hàm lƣợng progesterone cao thì có thể chứng minh đƣợc là việc phát hiện động dục không chính xác. Các stress với môi trƣờng có tác động rất lớn đến hiệu quả sinh sản. Đặc biệt, stress nhiệt là nguyên nhân dẫn đến việc giảm nghiêm trọng tỷ lệ có thai, tăng tỷ lệ chết phôi sớm, giảm độ dài và cƣờng độ của các biểu hiện động dục và làm giảm thể trọng bé sinh ra. Ngày nay ngƣời ta đã sử dụng progesterone trong sữa để trợ giúp cho các chƣơng trình phối giống trong điều kiện gia súc bị stress do môi trƣờng (Chung Anh Dũng, 2002). 2.7 Nguyên lý kỹ thuật ELISA (Progesterone – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Phản ứng ELISA thƣờng kết hợp kháng nguyên – kháng thể không thể phát hiện bằng mắt thƣờng, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng đặc tính hấp thụ tự nhiên của protein lên polyethylen đã gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên giá rồi cho kháng nguyên hoặc kháng thể tƣơng ứng có đánh dấu enzyme và tạo phản ứng. 23 Bỏ chất đánh dấu không kết hợp, cho thêm vào hỗn hợp chất hiện màu. Cũng nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H 2 O từ oxy hóa hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch. Nhƣ vậy, kỹ thuật ELISA gồm có 3 thành phần tham gia phản ứng (kháng nguyên, kháng thể và chất hiện diện màu) đồng thời thực hiện có 2 bƣớc: Trong phản ứng miễn dịch: là sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. Trong phản ứng hóa học:nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng [O] vì chính [O] này oxi hoá chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị thay đổi màu có nghĩa là chứng minh sự có mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể. Có 2 loại kỹ thuật ELISA chính: kỹ thuật ELISA trực tiếp và kỹ thật ELISA gián tiếp. – Kỹ thuật ELISA trực tiếp: khi kháng nguyên đƣợc gắn vào đáy giếng phản ứng sau đó phủ lên kháng thể đặc hiệu gắn enzyme, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Khi rửa để loại bỏ kháng thể gắn enzyme không kết hợp với kháng nguyên và cho vào giếng chất hiện màu. Đọc kết quả bằng phổ kế sau 10 phút. Kết quả có 2 trƣờng hợp xảy ra: Kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme không bị rửa trôi. Enzyme sẽ giải phóng [O] từ H 2 O 2 để oxy hóa chất hiện màu, kết quả làm thay đổi màu hỗn dịch trong giếng. Kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể thì không xảy ra sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể, enzyme bị rửa trôi, kết quả là hỗn dịch trong giếng phản ứng không thay đổi màu. – Kỹ thật ELISA gián tiếp: Theo nguyên tắc kỹ thuật ELISA trực tiếp và gián tiếp không khác nhau, nhƣng kỹ thuật gián tiếp có thêm một bƣớc phản ứng. Conjugate trong kỹ thuật trực tiếp là kháng thể đặc hiệu gắn với enzyme, trong khi đó, conjugate của phản ứng gián tiếp là kháng thể khác với enzyme và đọc kết quả xảy ra 2 trƣờng hợp: 24 Nếu nhƣ kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể, sẽ có sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể và sự kết hợp giữa conjugate với phức hợp kháng nguyên kháng thể, trong giếng hỗn dịch có enzyme để giải phóng [O] từ H 2 O 2 , oxy hoá chất hiện màu làm thay đổi màu hỗn dịch (phản ứng dƣơng tính). Khi kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể thì không có sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể bị rửa trôi, đồng thời, conjugate không kết hợp với kháng nguyên cũng bị rửa trôi, hỗn dịch không có sự kết hợp với kháng nguyên với kháng thể, kháng thể bị rửa trôi và conjugate không kết hợp với kháng nguyên cũng bị rửa trôi, hỗn dịch sẽ không có enzyme để giải phóng enzyme [O] từ H 2 O 2 , chất hiện màu không bị oxy hoá, hỗn dịch không thay đổi màu (phản ứng âm tính). (Ngô Phƣơng Nghị, 2003) 25 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian Từ tháng 03/2007 đến tháng 07/2007. 3.1.2 Địa điểm Đề tài thực hiện tại các hộ chăn nuôi bò sữa và Công ty Cổ Phần Bò Sữa huyện Long Thành, tỉnh Đồng Nai. Mẫu sữa xét nghiệm đƣợc phân tích tại Trung Tâm Phân Tích Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Đối tƣợng khảo sát – 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) nhóm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 sinh sản bình thƣờng. – 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) nhóm máu 50 và 75% HF sau khi sinh từ 90 ngày trở lên thuộc các lứa 1, 2, 3 và 4 không động dục hoặc phối giống nhiều lần không đậu. 3.3 Nội dung khảo sát Lấy mẫu sữa của bò đƣợc phân theo nhóm máu, lứa đẻ ở các ngày thứ nhất lúc gieo tinh; ngày thứ 7, ngày thứ 14, ngày thứ 21 và ngày thứ 24 sau khi gieo tinh để khảo sát hàm lƣợng progesterone trong sữa. 3.4 Phƣơng pháp tiến hành Khảo sát 20 con bò sữa Holstein Friesian (HF) sinh sản bình thƣờng và 20 con bò sữa chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa đẻ 1, 2, 3 và 4. 26 3.4.1 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo nhóm máu Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò sinh sản bình thƣờng theo nhóm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1 Số mẫu sữa khảo sát trên bò sinh sản bình thƣờng Nhóm máu Số bò (n) Số mẫu sữa thu thập (N) 50% 10 40 75% 10 40 Tổng cộng 20 80 Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu đƣợc trình bày ở Bảng 3.2 Bảng 3.2 Số mẫu sữa khảo sát trên bò chậm động dục Nhóm máu Số bò (n) Số mẫu sữa thu thập (N) 50% 10 40 75% 10 40 Tổng cộng 20 80 3.4.2 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo các lứa đẻ Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò sinh sản bình thƣờng theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bò sinh sản bình thƣờng Lứa đẻ Số bò (n) Số mẫu thu thập (N) 1 4 16 2 7 28 3 4 16 4 5 20 Tổng cộng 20 80 27 Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không dậu theo lứa đẻ đƣợc trình bày ở Bảng 3.4. Bảng 3.4 Số mẫu sữa khảo sát theo lứa đẻ ở bò chậm động dục Lứa đẻ Số bò (n) Số mẫu thu thập (N) 1 4 16 2 7 28 3 4 16 4 5 20 Tổng cộng 20 80 3.4.3 Lấy mẫu sữa và ly tâm 3.4.3.1 Lấy mẫu Vệ sinh lọ đựng sữa có thể tích khoảng 50 ml. Rửa sạch và lau khô bầu và núm vú của bò sữa. Vắt sữa bò bình thƣờng đƣợc khoảng vài lít, sau đó hứng sữa cho vào lọ để đạt thể tích khoảng 50 ml. Sữa đƣợc lấy vào buổi chiều đối với cả hai nhóm bò sinh sản bình thƣờng và bò chậm sinh. 3.4.3.2 Ly tâm và trữ mẫu Mẫu sữa đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút. Phần màu vàng đục và đặc ở trên là béo và phần cặn sữa ở dƣới đáy ống nghiệm phải đƣợc loại bỏ. Sử dụng kim chích đâm xuyên qua phần béo rồi hút phần sữa trong bên dƣới cho vào ống đựng mẫu ghi số hiệu và bảo quản trong tủ đông -30 0 C. 3.4.4 Kỹ thuật ELISA Chuẩn bị xét nghiệm: Bộ kít progesterone (Bovine progesterone ELISA Test. Endocrine technologies, INC. USA ) đƣợc bảo quản ở 2 đến 8 0 C nếu không sử dụng. Tuyệt đối không trữ đông, các mẫu sữa xét nghiệm đƣợc đƣa về nhiệt độ phòng để chuẩn bị pha dung dịch pha loãng và TBM theo tỷ lệ 1A/1B trong một ống nghiệm sạch trƣớc khi xét nghiệm từ 5 đến 10 phút. Những chất xét nghiệm dƣ phải đƣợc loại bỏ. 28 3.4.4.1 Thành phần bộ kít – 96 lỗ giếng đƣợc phủ sẵn kháng thể IgG của thỏ. – Nồng độ progesterone chuẩn: 0; 0,5; 3,0; 10; 25 và 50 ng/ml chất lỏng pha sẵn, mỗi chai là 0,5 ml. – Dung dịch pha loãng mẫu, 25 ml. – Thuốc thử màu TMB, 12 ml. – Dung dịch chuẩn độ (2N HCL), 6 ml. – Chất đệm rửa 20 X, 20 ml. – Stop Solution (3N HCL): 10 ml. 3.4.4.2 Dụng cụ thực hiện – Máy ly tâm 3000 vòng/phút. – Ống nghiệm bằng nhựa (5 ml). – Bông thấm nƣớc. – Thùng đá bảo quản mẫu. – Pipette chính xác hút đƣợc 25, 50, 100, 200 μl và 1 ml – Nƣớc cất. – Ống nghiệm bằng thủy tinh để pha chất nền màu A, B. – Giấy thấm. – Băng keo trong. – Máy đọc đĩa vi chuẩn độ. – Giấy vẽ đồ thị tuyến tính. – Tủ sấy 37 0 C. – Parafine để bịt kín đĩa. – Đầu hút gắn vào pipette sử dụng một lần. 29 3.4.4.3 Các bƣớc xét nghiệm – Trƣớc khi xét nghiệm lấy các mẫu sữa ra, để rã đông ở nhiệt độ phòng rồi mới tiến hành xét nghiệm. – Tất cả thuốc thử phải đạt tới nhiệt độ phòng 18 0 C đến 25 0 C trƣớc khi sử dụng. – Lấy pipette chuẩn độ 50 μl hút mẫu vật xét nghiệm và mẫu đối chứng vào các lỗ giếng thích hợp. – Lấy 100 μl dung dịch kết hợp enzyme progesterone vào mỗi lỗ giếng (ngoại trừ những lỗ giếng để trống, lắc lỗ giếng 30 giây, ủ ở 37 0 C trong 1giờ. Nên dùng parafin để che những lỗ giếng hoặc sử dụng túi thích hợp để cất giữ những đĩa trong suốt quá trình ủ ấm. – Bỏ những chất còn tồn đọng bên trong lỗ giếng và rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa (250 đến 300 μl/giếng). Lật ngƣợc đĩa, kiểm tra bằng giấy thấm để lấy đi nƣớc ẩm còn xót lại. – Thêm 100 μl dung dịch TMB vào tất cả các giếng theo thứ tự. – Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng từ 18 đến 28 0 C trong 10 phút, không đƣợc di chuyển. – Dừng phản ứng bằng cách cho thêm 50 μl chất chuẩn độ vào các giếng theo thứ tự giống nhau để cơ chất thêm vào tác động từ từ. – Đọc bƣớc sóng hấp thu ở 450 nm với máy đọc vi lƣợng. Chú ý: Ủ cơ chất phải đƣợc giữ trong nhiệt độ từ 25 đến 28 0 C. Nếu ngoài nhiệt độ giới hạn này, thời gian ủ ấm phải đƣợc tính lại cho đúng. 3.4.4.4 Tính toán kết quả – Tính độ hấp thu trung bình mỗi loại: Mẫu chuẩn, mẫu đối chứng, mẫu sữa xét nghiệm. – Vẽ đƣờng cong chuẩn trên giấy vẽ đồ thị tuyến tính. Độ hấp thu của chuẩn để ở trục tung (Y). Nồng độ chuẩn tƣơng ứng ở trục hoành (X). – Tính toán nồng độ progesterone của mẫu sữa dựa vào đƣờng cong chuẩn trên. 30 3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu – Số liệu đƣợc trình bày dƣới dạng trung bình và sai số của mẫu ( X ± SE). – Trung bình cộng: N X XX N2 1 X Trong đó: X 1 , X 2 , … X N là hàm lƣợng progesterone của mẫu sữa khảo sát N: là số mẫu sữa khảo sát – Độ lệch chuẩn: S X = 1 - N x( - i 22 ) i x . con bò sữa chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu 50 và 75% HF thuộc các lứa đẻ 1, 2, 3 và 4. 26 3 .4. 1 Bố trí số mẫu sữa khảo sát theo nhóm máu Bố trí khảo sát hàm lƣợng. thu thập (N) 50% 10 40 75% 10 40 Tổng cộng 20 80 Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không đậu theo nhóm máu đƣợc trình. thập (N) 1 4 16 2 7 28 3 4 16 4 5 20 Tổng cộng 20 80 27 Bố trí khảo sát hàm lƣợng progesterone của 80 mẫu sữa trên bò chậm động dục hoặc phối nhiều lần không dậu theo