xi Hình 4.7: Hình 4.8: Hình 4.9: Hình 4.10: Hình 4.11: Hình 4.12: PHỤ LỤC Hình 1: Hình 2: Hình 3: Hình 4: Hình 5: Hình 6: lại 1) 37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (mũi nhắc lại 1) 37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 2) 37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (đối chứng + kháng huyết thanh) 37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (đối chứng + kháng huyết thanh) 37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (đối chứng + kháng huyết thanh) 38 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây miễn dịch 40 Tế bào vero 60 Tế bào vero chịu tác động của độc tố VT2e 60 Thú thí nghiệm 61 Tiêm protein MBP-VT2eB cho thỏ 61 Lấy máu tĩnh mạch tai thỏ 62 Tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S 62 xii DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 4.1: Bảng 4.2: Bảng 4.3: Bảng 4.4: Bảng 4.5: Bảng 4.6: Bảng 4.7: Kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây miễn dịch 39 Kết quả đo OD 620 mẫu nuôi cấy tế bào với dịch độc tố VT2e 41 Kết quả đo OD 620 của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) 45 Kết quả đo OD 620 của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) 47 Kết quả đo OD 620 của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) 48 Kết quả đo OD 620 của mẫu thỏ 2 50 Kết quả phản ứng trung hoà độc tố của hai quy trình gây miễn dịch 52 xiii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1: Sơ đồ 3.2: Sơ đồ 3.3: Sơ đồ 3.4: Quy trình tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S 25 Quy trình xác định liều TCID 50 29 Quy trình nhuộm tế bào vero và đọc kết quả ở bước sóng 620 nm 30 Quy trình trung hòa độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 32 xiv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1: Biểu đồ 4.2: Biểu đồ 4.3: Biểu đồ 4.4: Biểu đồ 4.5: Đồ thị chuẩn độ độc tố VT2e 42 Đồ thị trung hòa độc tố VT2e của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) trên môi trường tế bào vero 46 Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero 49 Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero 49 Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 2 trên môi trường tế bào vero .51 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. MỞ ĐẦU Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta. Vì vậy, các nghiên cứu giúp phòng bệnh, phát hiện, giám sát các tác nhân gây bệnh là vấn đề đang nhận được sự quan tâm hàng đầu. Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh tiêu chảy và phù đầu ở heo con tuy có hiệu quả nhưng gây nhiều triệu chứng phụ, như rối loạn tiêu hoá, không có chức nă ng phòng bệnh và tạo ra những chủng vi sinh vật kháng kháng sinh (gây khó khăn cho việc trị bệnh lâu dài). Để khắc phục những khó khăn trên, phương pháp dùng vaccin để phòng ngừa bệnh cho heo hứa hẹn mang lại hiệu quả hơn. Tuy nhiên, hầu hết các loại vaccin hiện nay được sản xuất theo phương pháp cổ điển bằng cách sử dụng vi khuẩn chết hay vi khuẩn nhược độc nên tính đặc hiệu không cao và gây một số phả n ứng phụ có hại. Phương pháp này gặp một số bất lợi như hiện tượng phục hồi một số tính độc ban đầu hay sự phân huỷ không hoàn toàn các độc tố, dễ dẫn đến các hiệu ứng không mong muốn ở các con thú được tiêm chủng. Hơn nữa, việc sử dụng vi khuẩn chết lại đòi hỏi phải tiêm lập lại nhiều lần, vì tính gây đáp ứng miễ n dịch không cao. Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được protein này. Từ thực tế đó, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, với sự hướng dẫn của TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ”. 1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1. Mục tiêu Đánh giá hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ nhằm xác định khả năng ứng dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù do E. coli gây ra trên heo. 2 1.2.2. Yêu cầu  Thu nhận kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.  Xác định sự hiện diện của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.  Thử khả năng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁNG NGUYÊN [2] Kháng nguyên (Antigen, Ag) là một chất có khả năng gây đáp ứng miễn dịch khi được đưa vào cơ thể của một động vật thích hợp hoặc một chất có khả năng phản ứng với một kháng thể hoặc một tế bào của hệ thống miễn dịch. Tính phản ứng của kháng nguyên hoặc khả năng nhận biết, khả năng liên kết đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể hoặc với thụ thể của tế bào phụ thuộc vào một phần cấu trúc giới hạn của kháng nguyên được gọi là quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) hay epitop. Các epitop có hai đặc tính: tính kháng nguyên (antigenicity) và tính sinh miễn dịch (immunogenicity). Tính kháng nguyên là đặc tính của một epitop có cấu trúc ba chiều liên kết bổ sung với phần cấu trúc ba chiều của phân tử kháng thể. Phần cấu trúc này của phân tử kháng thể hoặc của thụ thể được g ọi là paratop. Tính miễn dịch của một epitop là đặc tính gây ra một đáp ứng miễn dịch trong một cơ thể. Sự nhận biết giữa kháng nguyên và kháng thể của nó hoặc giữa kháng nguyên với các thụ thể của tế bào có thẩm quyền miễn dịch mang tính đặc hiệu rất cao. Điều đó có nghĩa là một kháng nguyên A chỉ có thể được nhận biết bởi một kháng thể anti-A hoặc chỉ có thể được nhận biết bởi một loại tế bào lympho có thụ thể liên kết đặc hiệu với kháng nguyên A. 2.2. KHÁNG THỂ [1] Kháng thể được gọi là globulin miễn dịch (Immunoglobulin, Ig), ở động vật hữu nhũ có 5 lớp Ig: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, các Ig đều là protein hình cầu. Mỗi phân tử Ig đều có hai cặp chuỗi polypeptide nặng ký hiệu là chuỗi H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ ký hiệu là L (light chain). Sự khác biệt chủ yếu giữa hai lớp Ig với nhau là ở chuỗi nặng. Các chuỗi H hoặc L trên cùng một phân tử kháng thể bao giờ cũng giống nhau hoàn toàn từng đôi một. 4 2.2.1. Chuỗi nhẹ (L) Chuỗi nhẹ có trọng lượng khoảng 22.000, có thể phân biệt hai type chuỗi nhẹ khác nhau, đó là type kappa (κ) và type lambda (λ). Hai chuỗi này có tính kháng nguyên khác nhau hoàn toàn. Mỗi chuỗi nhẹ có 214 acid amin. Thứ tự các acid amin từ 108 – 214 là hoàn toàn không thay đổi. Còn các acid amin từ số 1 – 107 có thể thay đổi về thứ tự. Đoạn này được gọi là vùng thay đổi VL (variable light), trong vùng thay đổi có đoạn thay đổi mạnh nhất gọi là vùng siêu biến (hypervariable regions). Những đoạn siêu biến trong chuỗ i lambda là các đoạn từ vị trí acid amin 24 – 34, 50 – 56 và 89 – 97. 2.2.2. Chuỗi nặng (H) Chuỗi nặng có trọng lượng phân tử khoảng 50.000, gồm 446 acid amin được chia làm hai phần: vùng thay đổi VH (variable heavy) và vùng hằng định CH (constant heavy). Người ta phân biệt 5 lớp Ig chủ yếu dựa vào sự khác nhau của các mạch polypeptide trong chuỗi nặng. Nếu trong chuỗi nặng của Ig có các chuỗi: - Gamma (γ) thì Ig đó được gọi là IgG. - Muy (µ) thì Ig đó được gọi là IgM. - Alpha (α) thì Ig đó được gọ i là IgA. - Delta (δ) thì Ig đó được gọi là IgD. - Epsilon (ε) thì Ig đó được gọi là IgE. Vùng thay đổi (VH): cũng giống như vùng thay đổi của chuỗi nhẹ, vùng này có 116 acid amin. Những vùng thay đổi mạnh nhất được gọi là vùng siêu biến chuỗi nặng. Vùng hằng định (CH): ngoài các phần bất biến và siêu biến, chuỗi nặng còn có một nhóm glucide gọi là oligosaccharide được ký hiệu là CHO. CHO được gắn vào phần CH 2 của phân tử kháng thể, đây là phần glucide của phân tử kháng thể có nhiệm vụ cố định bổ thể, giúp cho kháng thể dễ dàng bám vào bề mặt của tế bào thực bào và quyết định tính kháng nguyên của phân tử kháng thể. Theo quan điểm ngày nay thì vùng siêu biến chuỗi nặng và siêu biến chuỗi nhẹ tham gia vào sự hình thành tính đặc hiệu trong sự kết hợp của kháng nguyên với kháng thể. 5 2.3. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH [1] Khi vào cơ thể, kháng nguyên được đại thực bào bắt giữ, xử lý và phân cắt để đưa lên bề mặt tế bào các nhóm quyết định kháng nguyên, sau đó trình diện những thông tin của các nhóm quyết định kháng nguyên này cho các loại tế bào lympho T để khởi động đáp ứng miễn dịch, phát triển tạo tính miễn dịch cho cơ thể. Trong số các tế bào lympho T đến nhận diện các quyết định kháng nguyên thì tế bào lympho T cảm ứng (inducer T cell, T I ) đóng vai trò quan trọng đặc biệt. Khi nhận diện được các quyết định kháng nguyên đặc hiệu, tế bào lympho T I bị kích thích và tiết ra các yếu tố có tác dụng hoạt hoá đại thực bào MAF (macrophage activating factor), đến lượt đại thực bào được hoạt hoá và tiết ra interleukin 1. Interleukin 1 sẽ tác động trở lại lympho T I . Lúc này, lympho T I có đủ hai tín hiệu kích thích: một là quyết định kháng nguyên đặc hiệu, hai là interleukin 1, đó là hai tín hiệu cần và đủ để hoạt hoá lympho T I . Lympho T I sau khi được hoạt hoá sẽ tăng sinh và tiết ra interleukin 2, interleukin 2 sẽ tác động lên một loạt các tế bào khác, trước hết là một loạt các tế bào cùng đến nhận diện các quyết định kháng nguyên được trình diện trên bề mặt đại thực bào như tế bào lympho T giúp (helper T cell, T H ), lympho T gây quá mẫn muộn (delayed type hypersensitivity T cell, T DTH ). Các tế bào này sau khi nhận được các quyết định kháng nguyên thì sẽ xuất hiện các thụ thể để tiếp nhận kích thích của interleukin 2. Hai tín hiệu cần và đủ giúp chúng hoạt hoá và phát huy tác dụng. Hình 2.1: Cấu trúc kháng thể 6 Các lympho T DTH sẽ tăng sinh và tiết ra các lymphokin có ảnh hưởng đến hoạt động của các tế bào khác để chiêu mộ, hoạt hoá và kìm chân chúng tại nơi có mặt kháng nguyên, dẫn đến hình thành phản ứng viêm kiểu quá mẫn muộn. Các lympho T H sẽ tăng sinh và tiết ra các yếu tố hoà tan, yếu tố này cùng với kháng nguyên là hai tín hiệu để kích thích lympho B biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất kháng thể. Các tiền tế bào lympho T gây độc sau khi nhận diện được phức hợp kháng nguyên – kháng nguyên phù hợp tổ chứa chính trên bề mặt tế bào đích thì xuất hiện các thụ thể để tiếp nhận tín hiệu từ interleukin 2. Khi đã có đủ hai tín hiệu, tiền tế bào lympho T gây độc biệt hoá thành lympho T gây độc (cytotoxic T cell, T C ), có khả năng gây độc trực tiếp lên tế bào đích. 2.3.1. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu Khi kháng nguyên vào cơ thể lần đầu, chúng được đại thực bào xử lý và làm nhiệm vụ trình diện cho lympho T I . Khi đó, đại thực bào đã được kích thích bởi kháng nguyên và tiết ra interleukin 1; interleukin 1 lại kích thích tế bào lympho T I , làm chúng tiết ra lymphokin gọi là interleukin 2, mở màn cho một loạt hoạt động của các tế bào lympho khác. Tế bào lympho T tiết ra các lymphokin MIF (macrophage inhibition factor), MAF tác động trở lại đại thực bào làm chúng hoạt động mạnh mẽ hơn. Trong đáp ứng lần thứ nhất, hoạt động của các tế bào đã tạo nên một vòng kín khuếch đại tín hiệu ban đầu nhưng còn yếu vì số tế bào đã được mẫn cảm lúc đầu còn ít, phải mấ t thời gian cho sự mẫn cảm cũng như cho sự sinh sôi nảy nở của dòng tế bào đã được mẫn cảm. 2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo Khi kháng nguyên vào cơ thể lần hai, kháng nguyên gặp ngay tế bào lympho T đã mẫn cảm, tức là đã có những thụ thể (receptor) kiểu kháng thể ở trên bề mặt và sự kết hợp như kháng nguyên – kháng thể tạ o nên kích thích để chúng tiết ra các lymphokin trong đó có MIF, MAF làm tế bào đại thực bào đứng tại chỗ, tăng cường hoạt động nuốt và tiêu hoá kháng nguyên. Mặt khác, các đại thực bào lại tiết ra interleukin 1 để kích thích lympho T I tăng tiết interleukin 2, cơ chế hoạt động cũng tương tự lần 1, nhưng có hai điểm khác biệt: - Mức độ phản ứng do có nhiều tế bào đã mẫn cảm nên mạnh mẽ hơn nhiều. - Phản ứng khởi phát là sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể. . tài: Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ . 1 .2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1 .2. 1. Mục tiêu Đánh giá hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. MBP-VT2eB trên thỏ nhằm xác định khả năng ứng dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù do E. coli gây ra trên heo. 2 1 .2. 2. Yêu cầu  Thu nhận kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. . Hình 4. 7: Hình 4. 8: Hình 4. 9: Hình 4.1 0: Hình 4.1 1: Hình 4.1 2: PHỤ LỤC Hình 1: Hình 2: Hình 3: Hình 4: Hình 5: Hình 6: lại 1) 37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch