7 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch - Tính lạ của kháng nguyên Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao là sự khác biệt chủng loài giữa thú được gây miễn dịch và kháng nguyên. Trong miễn dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với cơ thể thú bao nhiêu thì khả năng sinh miễn dịch càng cao bấy nhiêu. Ví dụ: Albumin gà sẽ tạo kháng thể cao hơn albumin bò khi cùng tiêm cho dê. Trong miễn d ịch qua trung gian tế bào chỉ cần sự khác biệt giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao, ví dụ như phản ứng thải bỏ mảnh ghép của chuột A khi ghép một bộ phận nào đó của chuột B. - Cấu tạo hoá học của kháng nguyên Các kháng nguyên là protein hay polysaccharide đều có tính miễn dịch cao khi chúng ở dạng hoà tan hay trong cấu trúc phức tạp, ví dụ: vỏ vi khuẩn, các loại protein trong máu. Các chất khác gồ m lipide, steroid, acid nucleic có tính sinh miễn dịch yếu hoặc không có tính sinh miễn dịch, trừ khi chúng được gắn với một protein tải để trở thành một phức hợp có tính sinh miễn dịch. Hình 2.2: Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được phản ánh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh (Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988) 8 Các kháng nguyên được tổng hợp từ một loại acid amin thì có tính sinh miễn dịch yếu. Các kháng nguyên được tổng hợp từ hai loại acid amin trở lên sẽ có tính sinh miễn dịch cao. Nếu trong mạch polypeptide có thêm acid amin mạch vòng (đặc biệt là tyrosine) sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của phân tử polypeptide đó. Các polypeptide được tổng hợp từ các acid amin dạng D có tính sinh miễn dịch thấp vì nó ít bị chuyển hoá. Sự chuyển hoá kháng nguyên trong cơ thể vật chủ là yếu tố quan trọng cho tính sinh miễn dịch, vì khi bị chuyển hoá các kháng nguyên dễ bộc lộ các quyết định kháng nguyên ra ngoài. - Kích thước của phân tử kháng nguyên Kháng nguyên càng có kích thước phân tử lớn và cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao. Một phân tử kháng nguyên càng lớn thì nó càng có cấu trúc phức tạp và có nhiều quyết định kháng nguyên, đó là một trong những yếu tố đảm bảo tính sinh miễn dịch cao. - Cách gây miễn dịch và liều lượng của kháng nguyên Ngoài các y ếu tố trên, còn có những các yếu tố khác ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch: • Đường đưa kháng nguyên vào cơ thể vật chủ: với những kháng nguyên mạnh, đưa kháng nguyên vào đường mạch máu có thể dễ dàng gây đáp ứng miễn dịch, ví dụ: virus, vi khuẩn, tế bào. Nhưng với những kháng nguyên hoà tan thì phải có quy trình gây miễn dịch thích hợp, tốt nhất là đường tiêm trong da, dưới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần. • Liề u lượng kháng nguyên: Nếu lượng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngược lại, nếu lượng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch. • Quy trình gây miễn dịch cũng ảnh hưởng lớn đến tính sinh miễn dịch của phân tử kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên, gây miễn dịch trên hai lô thú thí nghiệm thuần chủng nhưng ở hai quy trình gây miễn dịch khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. Mỗi loạ i kháng nguyên thích hợp với một loại quy trình gây miễn dịch riêng. Với những kháng nguyên yếu thường phải được gây miễn dịch bằng quy trình hết sức nghiêm ngặt và gây miễn dịch nhiều lần thì mới có đáp ứng miễn 9 dịch mạnh. Trong khi đó, với những kháng nguyên mạnh có khi chỉ cần gây miễn dịch một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch mạnh. - Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên Nếu cùng một lúc gây miễn dịch nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì kháng thể đặc hiệu được sinh ra tương ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình. Hiện tượ ng này được gọi là sự cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng nguyên. Nếu cùng một lúc cho con thú mẫn cảm với hai loại kháng nguyên: một kháng nguyên liều mạnh và một kháng nguyên liều nhẹ thì con thú có thể chỉ phản ứng với kháng nguyên liều mạnh. Hiện tượng này gọi là sự cạnh tranh kháng nguyên. Hiện tượng cạnh tranh kháng nguyên chỉ xảy ra ở hai kháng nguyên có cấu trúc hoá học gần giống nhau. - Phản ứng thứ phát (phản ứng nhớ) Nếu cho mẫn cảm kháng nguyên với một con vật đã được mẫn cảm với kháng nguyên đó một lần rồi, thì hàm lượng kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều hơn lần đầu. Phản ứng nhớ này tồn tại trong một thời gian khá dài sau mũi tiêm thứ nhất, đó là nhờ các tế bào lympho B sau khi tiếp xúc với kháng nguyên đã phân chia và biệt hoá trở thành tế bào ghi nhớ (memory cell), để khi kháng nguyên vào những lần sau sẽ lập tức tăng sinh thành dòng tế bào đã có hoạt tính miễn dịch. - Chất bổ trợ Ngày nay, tá chất được sử dụng rộng rãi để tăng hiệu quả của các loại vaccin, tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên. Ngoài ra, tá chất còn gây một phản ứng viêm không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn dịch. Qua các nghiên cứu gần đây, tá chất còn có tác dụng làm tăng t ế bào T H . Khi bổ sung tá chất vào kháng nguyên sẽ làm kháng nguyên tồn tại lâu hơn trong cơ thể túc chủ. Kháng nguyên được giải phóng dần dần, có tác dụng giống như kích thích miễn dịch nhiều lần. 10 - Khả năng đáp ứng của thú Ngày nay, người ta biết rằng với cùng một loại kháng nguyên, nếu đưa vào các cơ thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau. Tính sinh miễn dịch = tính kháng nguyên + khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ Khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ phụ thuộc vào tính di truyền. 2.4. CƠ CHẾ MIỄN D ỊCH DỊCH THỂ [13] Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể là do tế bào lympho B đảm nhận. Đầu tiên, các tế bào nguồn (trong tủy xương) biệt hoá thành tế bào lympho B khởi thuỷ (pro-B). Sau đó chúng tiếp tục biệt hoá thành tiền tế bào lympho B (pre-B), các tế bào này có đặc điểm là chưa có Immunoglobulin (Ig) bề mặt mà chỉ có IgM trong bào tương CIgM (cytoplasma IgM). Các phân tử Ig bề mặt hoạt động như các thụ thể tiếp nhận kháng nguyên, là những protein tham gia cấu tạo màng tế bào. Các tiề n tế bào lympho B được biệt hoá thành các tế bào lympho chưa chín, các tế bào này đã có IgM bề mặt. Sau đó, chúng tiếp tục biệt hoá thành các tế bào lympho B chín với sự xuất hiện của IgM, IgD bề mặt (và một số nhỏ IgA và IgG bề mặt). Tuy nhiên, các tế bào lympho B chín chưa phải là các tế bào sản xuất kháng thể. Nếu các tế bào lympho B chín không gặp đuợc kháng nguyên thì chúng sẽ bị phân huỷ. Nếu tế bào lympho B chín gặp được kháng nguyên cộng thêm sự h ợp tác hỗ trợ của các tế bào lympho T H , chúng sẽ tiếp tục biệt hoá thành các tế bào plasma (plasma cell) và tế bào ghi nhớ (memory cell). 11 Khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể Ig bề mặt của tế bào lympho B, chúng sẽ hoạt hoá phospholipase C ở màng tế bào thuỷ phân phosphotidyl inositol biphosphate thành diacylglycerol (DAG) và inositol triphosphate (IP 3 ). DAG và IP 3 có tác dụng hoạt hoá protein kinase C và gia tăng hàm lượng Ca 2+ ngoại bào. Protein kinase C được hoạt hoá sẽ thúc đẩy quá trình sao chép các gen mã hoá cho các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II (Major histocompatibility complex class II antigens – MHC class II antigens) và thụ thể transferrin CD71. Hình 2.3: Quá trình biệt hóa và phân chia của tế bào lympho B (Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988) 12 Các tế bào lympho B bắt giữ, xử lý và phân cắt để đưa lên bề mặt tế bào các nhóm quyết định kháng nguyên, sau đó gắn kết với các kháng nguyên MHC lớp II tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng nguyên MHC lớp II. Phức hợp này sẽ được phức hợp thụ thể TCR – CD3 của tế bào lympho T H nhận diện và kết hợp. Hình 2.4: Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề mặt tế bào lympho B (Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988) 13 Nhờ vậy, các tế bào lympho B có thể gửi một dấu hiệu trình diện kháng nguyên bị giới hạn bởi kháng nguyên phù hợp tổ chức chính (MHC – restricted antigen – presenting signal) cho tế bào lympho T H . Tế bào lympho T H bị hoạt hoá, chuyển từ Hình 2.5: Sự kết hợp giữa tế bào lympho T H và tế bào lympho B. (Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988) Hình 2.6: Tế bào lympho B xử lý và trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho T H . (Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988) 14 trạng thái nghỉ ngơi (resting state) sang trạng thái G 1 (G 1 state) trong chu trình tế bào (the cycle cell) và tiết ra hỗn hợp các interleukin. Tế bào lympho T H gồm hai tiểu quần thể với các chức năng khác nhau: T H1 và T H2 . T H1 là các tế bào lympho T giúp đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng trung gian tế bào, T H1 tiết interleukin 2 (IL2). T H2 là các tế bào lympho T giúp đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất kháng thể của tế bào lympho B. T H2 tiết interleukin 4 (IL4), interleukin 5 (IL5), interleukin 6 (IL6), các interleukin này có tác động giúp tế bào lympho B hoạt hoá, phân chia và biệt hoá. Tế bào lympho B phân chia và biệt hoá thành tế bào plasma (plasma cell). Chỉ có tế bào plasma mới có khả năng sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên lạ. Các tế bào plasma có khả năng sản xuất 300 phân tử kháng thể trong 1 giây. Các chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của phân tử kháng thể được tổng hợp trong các polyribosome, và được kết hợp để tạo thành các phân tử kháng thể hoàn chỉnh trong các rãnh nội bào (intracellular pool). Mặt khác, tế bào lympho B cũng biệt hoá thành tế bào ghi nh ớ (memory cell) để khi gặp kháng nguyên vào nhắc nhở, chúng có thể nhanh chóng nhớ lại và sản xuất kháng thể nhanh và nhiều hơn. Hình 2.7: Tác động của các interleukin ở các giai đoạn khác nhau trong tiến trình đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B đối với kháng nguyên (Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988) 15 2.5. PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB [4] Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB là một protein gồm hai thành phần: MBP (maltose binding protein) và VT2eB (tiểu phần B của độc tố vero), có trọng lượng phân tử vào khoảng 47 kDa. Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB được tổng hợp từ đoạn gen tái tổ hợp trong vector pMal-c2X đã được chèn vào vi khuẩn E. coli DH5α. Gen vt2eB qui định việc tổng hợp tiểu phần VT2eB của độc tố vero VT2e được tổ hợp với gen malE qui định việc tổ ng hợp nên protein MBP tạo thành đoạn gen tái tổ hợp trong vector pMal-c2X. Hoạt động của gen này bị chi phối bởi gen ptac, một gen khởi động được hoạt hoá dưới tác động của IPTG. Khi có mặt IPTG, gen ptac sẽ hoạt động kích ứng việc tổng hợp protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Dịch chứa protein MBP – VT2eB được cho qua cột sắc ký có chứa các hạt amylose. Protein này có ái lực với amylose nên sẽ được giữ lại trong cột s ắc ký, các chất khác sẽ bị rửa trôi theo dung dịch đệm. Cho dung dịch đệm có chứa maltose chạy qua cột sắc ký. Do ái lực của protein MBP – VT2eB đối với maltosse mạnh hơn đối với amylose nên các protein này gắn trên amylose sẽ chuyển sang gắn trên maltose và được rửa theo dung dịch đệm ra ngoài. 2.6. PHẢN ỨNG KẾT TỦA KHUẾCH TÁN KÉP TRÊN THẠCH (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) 2.6.1. Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể [1] Khi cho tiếp xúc giữa kháng thể đặc hiệu (dịch thể hoặc tế bào) với kháng nguyên thì phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ xảy ra một cách đặc hiệu. Kháng thể dịch thể (các loại Ig) thường tồn tại trong huyết thanh và dịch cơ thể nên phản ứng kháng nguyên – kháng thể còn gọi là phản ứng huyết thanh học. Phản ứng huyết thanh học là phản ứng xảy ra dựa trên cơ chế miễn dịch học, đó là sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể, mà cụ thể là giữa nhóm quyết định của kháng nguyên với trung tâm hoạt động của kháng thể. Phân tử IgG có hai trung tâm hoạt động nên kết hợp được với hai phân tử kháng nguyên cùng loại. Các kháng nguyên có nhiều nhóm quyết định sẽ kết hợp với nhiều phân tử kháng thể tương ứng. 16 Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ lực liên kết lý hoá và biểu hiện làm hai pha phản ứng. • Lực liên kết - Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Van der Waals. - Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau. Ví dụ: giữa nhóm amin và carboxyl (NH 2 và COOH) của hai phân tử protein. - Lực liên kết giữa các cầu nối hydro giữa các nhóm hydroxyl. • Các pha của phản ứng Khi thực hiện phản ứng kháng nguyên và kháng thể ở in vitro, kết quả của phản ứng có thể trực tiếp hoặc gián tiếp quan sát được bằng mắt thường hoặc bằng kính hiển vi. Với những phản ứng kháng nguyên – kháng thể có thể quan sát được bằng mắt thường, phản ứng thường xảy ra theo hai pha. Pha thứ nhất : Đặc trưng bởi sự hấp thụ kháng thể lên bề mặt kháng nguyên tương ứng, pha này xảy ra nhanh được gọi là pha đặc hiệu hay pha không nhìn thấy. Trong pha này, thực chất là sự tìm đến và kết hợp đặc hiệu giữa nhóm quyết định của kháng nguyên với trung tâm hoạt động của kháng thể, tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Pha thứ hai : Tiếp sau pha thứ nhất, xảy ra chậm hơn và biểu hiện ra ngoài nên có thể nhìn thấy được như ngưng kết thành mạng lưới, tạo thành hạt lổn nhổn, mịn như cát, hoặc như sợi bông, hoặc kết tủa thành cặn màu trắng lắng xuống đáy; pha này thực chất là theo nguyên lý lý hoá đơn thuần, nên còn gọi là pha không đặc hiệu hay pha nhìn thấy được. . sinh miễn dịch yếu hoặc không có tính sinh miễn dịch, trừ khi chúng được gắn với một protein tải để trở thành một phức hợp có tính sinh miễn dịch. Hình 2. 2: Đáp ứng miễn dịch của thú đối với. sinh miễn dịch = tính kháng nguyên + khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ Khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ phụ thuộc vào tính di truyền. 2.4. CƠ CHẾ MIỄN D ỊCH DỊCH THỂ [ 13] Quá. College Publishing, 1988) 15 2.5. PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB [4] Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB là một protein gồm hai thành phần: MBP (maltose binding protein) và VT2eB (tiểu phần B của