27 3.5. Đánh giá 3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony)  Mục đích Tìm hiểu khả năng sử dụng phản ứng khuếch tán trên thạch để xác định kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.  Chuẩn bị thạch 1,5 g agarose được làm tan trong 100 ml đệm PBS 1X, đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6,5 cm x 6 cm, dày 3 mm trên tấm phim trong, tạo các giếng trên thạch.  Chuẩn bị mẫu - M ẫu huyết thanh đối chứng thu trước khi tiêm kháng nguyên. - Mẫu kháng huyết thanh chưa pha loãng. - Mẫu protein tái tổ hợp MBP-VT2eB nồng độ 1,588 mg/ml được pha loãng theo tỉ lệ ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32. - Mẫu kháng huyết thanh được pha loãng theo tỉ lệ ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32.  Thực hiện – đánh giá Hút kháng nguyên và kháng thể vào các giếng tương ứng, đặt thạch vào buồng ẩm ở 4 o C. Khoảng 24 – 48g sau quan sát đường tủa, ép khô thạch và nhuộm với thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%. Sau đó rửa nước và để khô tự nhiên. Hình 3.2: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) Phản ứng (+): xuất hiện đường tủa ở một trong hai trường hợp (a hoặc b). Phản ứng (-): không xuất hiện đường tủa ở cả hai trường hợp a và b. ( a ) ( b ) Đường tủa 28 3.5.2. Định lượng: Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 3.5.2.1. Xác định liều TCID 50 (Tissue Culture Infectious Dose 50)  Chuẩn bị độc tố VT2e Vi khuẩn E. coli 0139 K82 (H28) có gen quy định độc tố VT2e được nuôi cấy trong môi trường LB, ở 37 o C, lắc 150 vòng/phút trong 24g. Dịch nuôi cấy đem ly tâm 10.000 vòng trong 30 phút. Thu dịch trong để thử độc tố trên tế bào vero.  Chuẩn bị tế bào vero Tế bào vero được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FBS), 2 mM gentamycin trong các chai nuôi cấy 25 cm 2 , ở 37 o C, 5%CO 2 . Các tế bào được chuyển vào phiến 96 giếng theo các bước sau - Đổ bỏ môi trường trong chai. - Hút 3,5 ml versene 0,2% cho vào chai, tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2, trong versene có EDTA sẽ làm phân tách tế bào. - Hút 2,5 ml trypsin 0,5% cho vào chai, tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2, trypsin sẽ loại bỏ protein có trong môi trường cũ. - Sau đó cho huyết thanh bào thai bê (FBS) và môi trường DMEM vào, hút 0,2 ml đem đếm nồng độ tế bào. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ tế bào là 300.000 tế bào/ml và nồ ng độ huyết thanh là 10%. - Hút 100 µl tế bào vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng, ủ ở 37 o C, 5% CO 2 trong 24g.  Xác định liều TCID 50 - Đối chứng (-)1: giếng chỉ chứa môi trường nuôi cấy tế bào DMEM. - Đối chứng (-)2: giếng chứa dịch lọc canh khuẩn E. coli DH5α. 29 - Đánh giá kết quả: Nồng độ TCID 50 là nồng độ gây chết 50% tế bào vero trong giếng nuôi cấy tế bào. Quan sát sự huỷ hoại tế bào do độc tố verotoxin tại các thời điểm 24g và 48g. Sau 48g, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm và xác định kết quả bằng phương pháp Reed – Muench. Những giếng có kết quả dương tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào trên 50% so với giếng đối chứng (-)2. Những gi ếng có kết quả âm tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào dưới 50% so với giếng đối chứng (-)2. Dịch thu từ huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn E. coli 0139 K82 được pha loãng theo tỉ lệ ½,1/20, 1/200, 1/2000, Hút 100 µl dịch lọc canh khuẩn ở mỗi nồng độ pha loãng trên vào mỗi giếng từ cột 1 đến cột 11 trên phiến 96 giếng chứa tế bào vero. Hút 100 µl dịch lọc canh cấy vi khuẩn E. coli DH5α vào 4 giếng ở cột 12 trên phiến 96 giếng làm đối chứng (-)2, 4 giếng còn lại là đối chứng (-)1 Ủ ở 37 o C, 5% CO 2 trong 24 – 48g Quan sát dưới kính hiển vi soi ngược vào những thời điểm 24 –48g. Những giếng dương tính là những giếng có sự phân tách tế bào. Quan sát dưới kính hiển vi, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả và xác định liều TCID 50 Sơ đồ 3.2: Quy trình xác định liều TCID 50 30  Nhuộm tế bào Đổ bỏ môi trường, tráng một lần bằng dung dịch đệm PBS ++ Cho vào mỗi giếng 200 µl formol 3,7%, giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 1g Đổ bỏ formol. Tráng hai lần các giếng bằng dung dịch đệm borat 0,01 M, pH 8,5. Cho vào mỗi giếng 100 µl thuốc nhuộm blue methylene 1% được pha loãng trong dung dịch đệm borat 0,01 M, giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 1g Đổ bỏ thuốc nhuộm. Tráng 5 lần bằng nước khử ion. Để phiến khô ở 37 o C trong 1g Đọc độ hấp thu bằng máy spectrophotomer ở bước sóng 620 nm Sơ đồ 3.3: Quy trình nhuộm tế bào vero và đọc kết quả ở bước sóng 620 nm Phiến 96 giếng đã nuôi cấy tế bào. 31  Công thức tính liều TCID 50 Liều TCID 50 được tính dựa trên phương pháp Reed – Muench [11] . o )log( %50 t xy x A −× − − = o aAbTCID = − = log 50 o Hiệu giá kháng thể trung hoà = a 10 1 Trong đó: - x: % tế bào chết dưới 50% - y: % tế bào chết trên 50% - t: Bậc pha loãng. - a: TCID 50 (Tissue Culture Infectious Dose 50). - b: Độ pha loãng có % tế bào chết dưới 50%. 3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố  Nguyên tắc Độc tố VT2e mất khả năng gây độc trên tế bào vero do bị trung hoà bởi kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.  Tiến hành Kháng huyết thanh pha loãng bậc hai được ủ với một liều độc tố xác định VT2e+ ở 37 o C trong một giờ và ở 4 o C qua đêm. Cấy hỗn hợp kháng huyết thanh - độc tố đã ủ vào phiến 96 giếng chứa tế bào vero đã nuôi cấy 24g. Tiếp tục nuôi tế bào vero ở 37 o C thêm 2 ngày. Quan sát sự huỷ hoại tế bào do verotoxin không bị trung hoà hàng ngày và ghi nhận kết quả trong 2 ngày.  Phản ứng trung hoà độc tố - Đối chứng (+): là những giếng chỉ có tế bào vero. - Đối chứng (-): là những giếng được ủ với 100 µl dịch lọc vi khuẩn có nồng độ TCID 50 đã xác định ở trên. - Đối chứng tế bào: là những giếng được ủ với 100 µl kháng huyết thanh chưa pha loãng. 32 - Đánh giá kết quả: Quan sát sự huỷ hoại tế bào do verotoxin không bị trung hoà hàng ngày tại các thời điểm 24g và 48g. Sau 48g, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm và xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp Reed – Muench. Những giếng có kết quả dương tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào dưới 50% so với giếng đối chứng huyết thanh. Những giếng có kết quả âm tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào trên 50% so với giếng đối chứng huyết thanh. Hút 100 µl môi trường DMEM vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng Hút 100 µl kháng huyết thanh vào cột 1 trên phiến 96 giếng. Tiếp tục pha loãng kháng huyết thanh từ nồng độ ½ đến nồng độ 1/2048 Thêm 100 µl dịch lọc vi khuẩn ở liều 3TCID 50 vào mỗi giếng Ủ ở 37 o C trong 1giờ, 4 o C qua đêm Hút 100 µl hỗn hợp trên cho vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng chứa tế bào vero đã nuôi cấy 24g Ủ ở 37 o C, 5% CO 2 trong 24 – 48g Quan sát dưới kính hiển vi, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả và xác định hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố VT2e Sơ đồ 3.4: Quy trình trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 33 3.6. CHỈ TIÊU THEO DÕI  Hiệu giá kháng thể cho kết quả dương tính trong phản ứng kết tủa khuếch tán kép trong thạch.  Xác định liều TCID 50 của dịch lọc vi khuẩn E. coli.  Xác định hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố VT2e ở liều 3TCID 50. 3.7. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU Xử lý số liệu bằng Excel và đánh giá kết quả dựa trên các kết quả thu nhận trong suốt quá trình thí nghiệm. 34 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP- VT2eB BẰNG KỸ THUẬT OUCHTERLONY 4.1.1. Xác định quy trình thực hiện phản ứng Kháng huyết thanh được thu nhận sau mũi nhắc lại 1, 2, 3, 4 để đánh giá khả năng gây miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB thông qua phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch. Đầu tiên, chúng tôi thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch với mẫu kháng huy ết thanh thu sau mũi nhắc lại 1 của thỏ 4 (quy trình dài ngày) với protein MBP-VT2eB có nồng độ 1,588 mg/ml theo 2 cách sau: - Cách 1: pha loãng kháng nguyên (protein MBP-VT2eB), kết quả được minh hoạ qua hình 4.1(A). - Cách 2: pha loãng kháng thể (kháng huyết thanh), kết quả được minh hoạ qua hình 4.1(B). Sau 2 ngày, quan sát đường tủa, ép khô thạch và nhuộm với thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%. Sau đó rửa nước và để khô tự nhiên. Hình 4.1: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc l ạ i 1 ) Đường tủa (A)  Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6 chứa 10 µl protein MBP-VT2eB pha loãng từ nồng độ ban đầu đến nồng độ 1/32.  Giếng 7 chứa 10 µl kháng huyết thanh. (B)  Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6 chứa 10 µl kháng huyết thanh pha loãng từ nồng độ ban đầu đến nồng độ 1/32.  Giếng 7 chứa 10 µl protein MBP- VT2eB. (B) (A) 35 Nhận xét: Chỉ xuất hiện đường kết tủa ở hình A (sơ đồ pha loãng protein MBP-VT2eB), vị trí đường kết tủa xuất hiện nằm gần về phía giếng chứa kháng huyết thanh và không có đường tủa trong hình B (sơ đồ pha loãng kháng huyết thanh). Quan sát sự xuất hiện đường tủa, chúng tôi nhận thấy đường tủa xuất hiện ở vị trí lệch về phía giếng chứa kháng thể, kháng thể yếu hơn kháng nguyên. Trong hình B đường tủa không xuất hiện chứng tỏ rằng không có sự tương đồng tỉ lệ giữa kháng nguyên và kháng thể. Từ đó, chúng tôi quyết định thực hiện phản ứng khuếch tán kép trên thạch theo cách 1 (pha loãng kháng nguyên) với các mẫu huyết thanh thu được từ hai quy trình dài ngày và ngắn ngày để theo dõi khả năng gây miễn dịch của protein MBP-VT2eB trong hai quy trình trên đối tượng thí nghiệm là thỏ. 4.1.2. Đánh giá kết quả gây miễn dịch theo các quy trình ngắn ngày và dài ngày 4.1.2.1. Quy trình ngắn ngày Nghiên cứu được thực hiện trên hai thỏ: thỏ 10 và thỏ 11. Kháng huyết thanh thu được sau mũi nhắc lại 1 của thỏ 1 và thỏ 2 được dùng để thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch với protein MBP-VT2eB. Kết quả cho thấy có đường kết tủa xuất hiện ở mẫu kháng huyết thanh của thỏ 2 (hình 4.2), nhưng ở mẫu của thỏ 1 không thấy xuất hiện đường kết tủa. Kết quả: mũi nhắc lại 1 của thỏ 2 dương tính, mũi nhắc lại 1 của thỏ 1 âm tính. Tuy nhiên mẫu kháng huyết thanh thu được sau mũi nhắc lại 2 của thỏ 1 lại cho kết quả dương tính (hình 4.3). Hình 4.2: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (mũi nhắc lại 1) Đường tủa 36 Tiến hành phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch với mẫu huyết thanh đối chứng (thu nhận trước khi gây miễn dịch) và mẫu kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 2 của thỏ 1 và thỏ 2 để kiểm tra độ tin cậy của kết quả trong hai xét nghiệm trên (hình 4.2 và 4.3), kết quả được minh hoạ qua hình 4.4 và 4.5. Kết quả cho thấy chỉ xuất hiện đường tủa ở giếng chứa kháng huyế t thanh, kết quả dương tính, nhưng ở giếng chứa huyết thanh đối chứng không xuất hiện đường tủa, kết quả âm tính. Với các kết quả đạt được ở trên, chúng tôi có thể kết luận rằng quy trình gây miễn dịch ngắn ngày có hiệu quả. 4.1.2.2. Quy trình dài ngày Trong quy trình gây miễn dịch dài ngày có ba thỏ được sử dụng trong thí nghiệm: thỏ 3, 4, 5. Các mẫu kháng huyết thanh thu nhận sau mũi nhắc lại 1 của những thỏ này được xét nghiệm kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng phương pháp kết tủa khuếch tán kép trên thạch. Sau 2 ngày, đường kế t tủa xuất hiện ở Hình 4.3: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (mũi nhắc lại 2) Đường tủa Hình 4.4: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (đối chứn g + kháng huyết thanh) Hình 4.5: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (đối chứng + kháng huyết thanh) Đường tủa • Giếng 1 chứa 50 µl kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 2. • Giếng 2 chứa 50 µl huyết thanh đối chứng. • Giếng 3 chứa 10 µl protein MBP-VT2eB ở nồng độ pha loãng 1/8. . chết dưới 50 % - y: % tế bào chết trên 50 % - t: Bậc pha loãng. - a: TCID 50 (Tissue Culture Infectious Dose 50 ). - b: Độ pha loãng có % tế bào chết dưới 50 %. 3 .5. 2.2. Thử phản ứng trung. Phản ứng trung hoà độc tố - Đối chứng (+ ): là những giếng chỉ có tế bào vero. - Đối chứng (- ): là những giếng được ủ với 100 µl dịch lọc vi khuẩn có nồng độ TCID 50 đã xác định ở trên. - Đối. Hình 4. 4: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (đối chứn g + kháng huyết thanh) Hình 4. 5: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (đối chứng + kháng