47 4.3.2.1. Quy trình dài ngày Thỏ 4 Thỏ 5 Mũi nhắc lại 3 Mũi nhắc lại 4 Nồng độ OD 620 % Tế bào sống OD 620 % Tế bào sống 1/20 1,079 102,76 0,3585 75,79 1/40 1,0325 98,33 0,3975 84,04 1/80 0,8135 77,47 0,413 87,32 1/160 0,715 68,09 0,444 93,87 1/320 0,631 60,09 0,3855 81,5 1/640 0,596 56,76 0,198 41,86 1/1280 0,4865 46,33 0,16 33,83 1/2560 0,498 47,43 0,138 29,18 1/5120 0,364 35,67 0,13 27,48 1/10240 0,336 32 0,123 26,004 Đối chứng tế bào 0,9765 0,3253 Đối chứng huyết thanh 1,05 0,473 Đối chứng độc tố 0,2355 0,0818 Bảng 4.4: Kết quả đo OD 620 của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) 48 Từ những chỉ số đo OD 620 trên, ta xác định được nồng độ kháng huyết thanh ở đó 50% tế bào được bảo vệ (TCID 50 ) là - Mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) 0017.3))2/1log(( 33.4676.56 33.4650 )1280log( 50 =−× − − −=TICD Hiệu giá kháng thể trung hòa = 1004/1 10 1 0017.3 = - Mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) ))2/1log(( 005.51 050 )2048log( 50 −× − − −=TICD = 3.018 Hiệu giá kháng thể trung hòa = 1041/1 10 1 018.3 = Thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) Nồng độ OD 620nm % Tế bào sống 1/2 0,7865 100,13 1/4 0,79 100,57 1/8 0,856 108,98 1/16 0,789 100,45 1/32 0,934 118,91 1/64 0,837 106,56 1/128 0,586 74,60 1/256 0,6055 77,08 1/512 0,5035 64,1 1/1024 0,401 51,05 1/2048 0 0 Đối chứng tế bào 0,738 Đối chứng độc tố 0,34625 Đối chứng huyết thanh 0,7855 Bảng 4.5: Kết quả đo OD 620 của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) 49 - Mẫu thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) 74458.2))2/1log(( 86.46501.81 86.4650 )640log( 50 =−× − − −=TICD Hiệu giá kháng thể trung hòa = 555/1 10 1 74457.2 = 0 20 40 60 80 100 120 140 ½ ¼ 1 / 8 1 / 1 6 1 / 3 2 1 / 6 4 1 / 1 2 8 1 / 2 5 6 1 / 5 1 2 1 / 1 0 2 4 Nồng độ kháng huyết thanh pha loãng % tế bào sống 0 20 40 60 80 100 120 1 / 2 0 1 / 4 0 1 / 8 0 1 / 1 6 0 1 / 3 2 0 1 / 6 4 0 1 / 1 0 2 4 1 / 2 0 4 8 1 / 5 1 2 0 1 / 1 0 2 4 0 Nồng độ kháng huyết thanh pha loãng % tế bào sống thỏ 4 thỏ 5 Biểu đồ 4.3: Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero Biểu đồ 4.4: Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero 50 4.3.2.2. Quy trình ngắn ngày Thỏ 2 Nồng độ OD 620nm % Tế bào sống 1/2 N / 1/4 N / 1/8 N / 1/16 N / 1/32 N / 1/64 0,5325 61,43 1/128 0,445 51,33 1/256 0,438 50,53 1/512 0,235 27,11 1/1024 0,4085 47,12 Đối chứng tế bào 0,645 Đối chứng độc tố 0,2015 Đối chứng huyết thanh 0,86688 N: tế bào chết do nhiễm Từ các kết quả trên ta có thể tính được hiệu giá kháng huyết thanh bảo vệ 50% tế bào là: - 416.2))2/1log(( 109.27526.50 109.2750 )512log( 50 =−× − − −=TCID - Hiệu giá kháng thể trung hòa = 261/1 10 1 416.2 = Bảng 4.6: Kết quả đo OD 620 của mẫu thỏ 2 51 0 20 40 60 80 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Nồng độ kháng huyết thanh pha loãng % tế bào sống Về mặt lý thuyết hiệu giá kháng huyết thanh thu nhận sau mũi nhắc lại 4 cao hơn hoặc bằng hiệu giá kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 3. Nhưng trên thực tế, chúng tôi thấy hiệu giá kháng huyết thanh trung hoà độc tố VT2e ở liều 3TCID 50 của mẫu kháng huyết thanh thu nhận sau mũi nhắc lại 3 cao hơn hiệu giá kháng huyết thanh của mũi nhắc lại 4. Điều này chứng tỏ đã có những yếu tố khác ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của các thú thí nghiệm. Trong suốt quá trình nuôi, thú thí nghiệm đã nhiễm một số bệnh như - Bệnh ghẻ - Bệnh do nấm - Bệnh cầu trùng - Bệnh viêm hô hấp Các biện pháp điều trị bằng thuốc kháng viêm nhóm corticoid và các phản ứng stress do bệnh có thể đã ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của thú. Biểu đồ 4.5: Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 2 trên môi trường tế bào vero 52 • Nhận xét Các kết quả thu nhận của toàn bộ thí nghiệm cho thấy  Quy trình gây miễn dịch dài ngày tạo kháng thể có hiệu giá cao hơn quy trình gây miễn dịch ngắn ngày.  Đáp ứng miễn dịch của từng thú thí nghiệm chịu ảnh hưởng rất lớn từ  Sức khoẻ thú.  Cơ địa của từng con thú.  Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà độc tố VT2e (gây bệ nh phù đầu trên heo). Hiệu giá kháng thể trung hoà Quy trình Thỏ Mũi nhắc lại 3 Mũi nhắc lại 4 3 x 1/1041 4 1/1004 x Dài ngày 5 x 1/555 Ngắn ngày 2 x 1/261 Bảng 4.7: Kết quả phản ứng trung hoà độc tố của hai quy trình gây miễn dịch 53 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Qua toàn bộ quá trình và các kết quả thu nhận được của đề tài : “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB”, chúng tôi đưa ra kết luận và đề nghị. • Kết luận - Cả hai quy trình đều tạo kháng thể kháng MBP-VT2eB có hiệu quả. - Hiệu quả của quy trình dài ngày cao hơn quy trình ngắn ngày. - Thời gian gây miễn dịch của quy trình dài ngày khá dài, chi phí cao, khó đảm bảo sức khoẻ cho thú thí nghiệm. - Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứ ng đáp ứng miễn dịch trên thỏ tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero. • Đề nghị - Sử dụng các tá chất khác để tăng hiệu quả gây miễn dịch. - Cần có một địa điểm nuôi thú thí nghiệm tốt để đảm bảo sức khoẻ thú, tăng cường hiệu quả đáp ứng miễn dịch. 54 PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Văn Hùng, 2002.Giáo trình miễn dịch học thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, 192 trang. 2. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Miễn dịch học cơ sở. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 337 trang. 3. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Thực hành hoá sinh miễn dịch. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 316 trang. 4. Trần Ngọc Phương, 2004. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất độc tố VT2eB tái tổ hợp. Khoá luận cử nhân khoa học ngành Công nghệ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Bùi Thị Cẩm Thuý, 2002. Nghiên cứu thu nhận virus dại từ nuôi cấy tế bào vero dòng thường trực. Khoá luận cử nhân khoa học ngành Sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. TIẾNG NƯỚC NGOÀI 6. Copper, Terrance G., 1977. The tools of Biochemistry. John Willey & Sons, New York. 256 – 307, 355 – 405. 7. Gentry, Mary K., Joel M. Dalrymple, 1980. Quantitative microtiter cytotoxicity assay for Shigella toxin. Journal of Clinical Microbiology, 12, 361 – 366. 8. Harlow, Ed, David Lane, 1988. Antibodies, a laboratory manual. Coid Spring Harbor Laboratory. 92 – 137, 286 – 299, 18.1 – 18.48. 9. Konowalchuk, J., J. I. Speirs, S. Stavric, 1977. Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli. American Society for Microbiology. 18, 775 –779. 10. Mahler, Henry R., Eugene H. Cordes, 1967. Biological Chemistry. Harper & Row, New York. 36 – 69. 11. Meslin, F. X., M. M. Kaplan, H. Koprowski, 1996. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization, Geneva. 371 – 372. 55 12. Sussman, M., 1985. The virulence of Escherichia coli. Society for General Microbiology, New York, USA. 14, 345 –353. 13. Tizard, Ian R., 1984. Immunology. Saunders College Publishing, 527 trang. 14. Tyler, S. D., W. M. Johnson, H. Lior, G. Wang, K. R. Rozee, 1991. Identification of verotoxin type 2 variant B subunit genes in Escherichia coli by the Polymerase Chain Reacton and Restriction Fragment Length Polymorphism analysis. Journal of Clinical Microbiology, 29, 1339 – 1343. 15. Veir, D. M., LA. Henzenberg, Caroline Black Well, Leonone A. Henzenberg. Applications of Immunological Methods. Black well scientific publications. 1, 8.1 – 8.18. 16. Veir, D. M., LA. Henzenberg, Caroline Black Well, Leonone A. Henzenberg. Applications of Immunological Methods. Black well scientific publications. 4, 113.1 – 113.13. 56 PHỤ LỤC CÁCH CHUẨN BỊ HOÁ CHẤT  Dung dịch ammonium sulfate 100%S Pha 767 g (NH 4 ) 2 SO 4 trong 1 l nước cất, vừa khuấy vừa đun nóng cho đến khi hoà tan hoàn toàn. Lọc dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4 , bảo quản ở nhiệt độ phòng.  Dung dịch ammonium sulfate 45%S Pha 45 ml (NH 4 ) 2 SO 4 100%S trong 55 ml PBS 1X.  Dung dịch PBS 1X - Pha dung dịch PBS 10X: NaCl 84,738 g NaH 2 PO 4 .H 2 O 8,961 g Na 2 HPO 4 20,5842 g NaN 3 5 g Nước cất vừa đủ 1 l - Pha 10 ml PBS 10X với 90 ml nước cất.  Dung dịch PBS ++ - Pha dung dịch A NaCl 8 g KCl 0,2g Na 2 HPO 4 1,15 g KH 2 PO 4 0,2 g Nước cất vừa đủ 800 ml - Pha dung dịch B 0,1 g MgCl 2 .6H 2 O trong 100 ml nước cất - Pha dung dịch C 0,1 g CaCl 2 trong 100 ml nước cất - Pha từng dung dịch rồi trộn lẫn với nhau. . tài : Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB , chúng tôi đưa ra kết luận và đề nghị. • Kết luận - Cả hai quy trình đều tạo kháng thể kháng MBP-VT2eB có hiệu quả 1/256 0,6055 77 ,08 1/512 0,5035 64,1 1/1024 0,401 51,05 1/2048 0 0 Đối chứng tế bào 0 ,73 8 Đối chứng độc tố 0,34625 Đối chứng huyết thanh 0 ,78 55 Bảng 4. 5: Kết quả đo OD 620 của mẫu thỏ 3 (mũi. 1/5120 0,364 35, 67 0,13 27, 48 1/10240 0,336 32 0,123 26,004 Đối chứng tế bào 0, 976 5 0,3253 Đối chứng huyết thanh 1,05 0, 473 Đối chứng độc tố 0,2355 0,0818 Bảng 4. 4: Kết quả đo