BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: ĐOÀN BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐOÀN BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii LỜI CẢM TẠ CHÂN THÀNH CẢM ƠN: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Bộ môn Bảo vệ Thực vật Quí thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy Bùi Cách Tuyến, Thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh. Cô Trần Thị Dung, Thầy Lƣu Phúc Lợi, Thầy Nguyễn Văn Cƣờng, Anh Mai Huy Hoàng đã giúp tôi có trang thiết bị cũng nhƣ phòng thí nghiệm để hoàn thành khóa luận. Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hòan thành khóa luận. Anh Lê Viết Ngọc Viện hạt nhân Đà Lạt, anh Hoàng trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp giống nấm bào ngƣ cho tôi thực hiện khóa luận. Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iii TÓM TẮT Đoàn Bảo Quốc, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ Pleurotus spp. bằng sắc ký lỏng cao áp - high performance liqud chromatography (HPLC) thời gian từ 14/2/2005 đến 18/8/2005. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. Lê Đình Đôn Khóa luận đƣợc thực hiện trên đối tƣợng nấm bào ngƣ Pleurotus spp Đây là loại nấm rất phổ biến trên thị trƣờng Việt Nam. Vì thế, thành phần dinh dƣỡng của chúng, đặc biệt là thành phần amino acid rất đƣợc quan tâm. Để thực hiện phân tích amino acid trên nấm, chúng tôi tiến hành trồng nấm tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học và sử dụng thiết bị là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của Trung tâm Hóa Lý đều thuộc Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Những kết quả đạt đƣợc: Nuôi trồng đƣợc 4 dòng nấm Pleurotus spp. trên cơ chất là mùn cƣa có bổ sung thêm cám gạo, và một số chất khác. Phân tích và định lƣợng đƣợc 17 amino acid trong 2 loài nấm Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius. Từ đó chúng tôi tiến hành so sánh thành phần amino acid của chúng với một số rau quả khác, với một số nấm khác và so sánh giữa chúng. iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ta i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách các chữ viết tắt vi Danh sách các hình vii Danh sách các bảng viii 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Yêu cầu 1.4. Nội dung thực hiện 2 2. TỔNG QUAN 3 2.1. Nấm trồng 3 2.1.1. Khái niệm về nấm 3 2.1.2. Sinh sản và chu trình sống 5 2.1.3 Đặc điểm biến dƣỡng và sinh lý 7 2.2. Nấm bào ngƣ 8 2.2.1. Giới thiệu 8 2.2.2. Một số loài nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng ở VIệt Nam 9 2.2.2.1. Nấm bào ngƣ Pleurotus florida 10 2.2.2.2. Nấm bào ngƣ Pleurotus sajor-caju 10 2.2.2.3. Nấm bào ngƣ Pleurotus pulmonarius 11 2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus 11 2.3. Phƣơng pháp sắc ký 12 2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký 12 2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký 12 2.4. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tich amino acid 13 v 2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatography) 13 2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) 14 2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 15 2.4.3.1. Pha tĩnh 15 2.4.3.2. Pha động 16 2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC 16 2.5. Các bƣớc phân tích amino acid 17 2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis) 17 2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) 19 2.5.3. Phân tách trên HPLC 20 2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu 21 2.4.4.1. Định tính 21 2.4.4.2. Định lƣợng 21 2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ 23 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 23 3.1.1. Thời gian thực hiện 23 3.1.2 .Địa điểm 23 3.1.3.Vật liệu nghiên cứu 23 3.2. Hóa chất và dụng cụ 23 3.2.1. Hóa chất 23 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị 24 3.3. Phƣơng pháp nhân giống và trồng nấm 24 3.3.1. Môi trƣờng 24 3.3.2. Phƣơng pháp 24 3.2.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA 24 3.2.2.2. Chuẩn bị môi trƣờng hạt 24 3.3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng giá môi 25 3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng 25 3.2.2.5. Tóm tắt quy trình 26 3.3.3. Phân tích amino acid 26 3.3.3.1.Thủy phân mẫu 26 vi 3.3.3.2. Tạo dẫn xuất: 27 3.3.3.3. Phân tích HPLC 28 3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả 28 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1. Kết quả 29 4.1.1. Kết quả trồng nấm 29 4.1.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng 29 4.1.1.2. Sự hình thành quả thể 30 4.1.2. Kết quả phân tích amino acid 32 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1. Kết luận 35 5.2. Đề nghị 35 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN:Acetonitril HPLC: High performance liquid chromatography TLC: Thin layer chromatography PITC: phenylisothiocyanate PTC: phenylisocarbamyl TEA: Triethylamine. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm 3 Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm 6 Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius 11 Hình 2.4. Pleurotus abalonus 11 Hình 2.5 Pleurotus sp 11 Hình 2.6. Pleurotus floridanus 11 Hình 2.7. Mô hình sắc ký giấy 14 Hình 2.8. Mô hình sắc ký lớp mỏng 14 Hình 2.9. Bộ dụng cụ HPLC 16 Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl 18 Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC 20 Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bởi sắc ký giấy tròn 22 Hình 4.1. Sinh trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus floridanus, Pleurotus flabellatus, Pleurotus flabellatus 31 Hình 4.2. Pleurotus abalonus trên giá mô 31 Hình 4.3. Bào tử Pleurotus abalonus 31 Hình 4.4. Bào tử đảm Pleurotus floridanus 31 Hình 4 .5. Bào tử đảm Pleurotus abalonus 31 Hình 4.6. Quả thể nấm Pleurotus floridanus 32 Hình 4.7. Quả thể nấm Pleurotus abalonus 32 Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus 32 Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius 32 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngƣ 10 Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản 13 Bảng 4.1. Thời gian lan tơ đầy thiết bị của các dòng nấm 29 Bảng 4.2. Đặc tính quả thể của các dòng nấm 30 Bảng 4. 3. Thành phần amino acid trên Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus 33 . NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp. ) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Giáo. NGƢ (Pleurotus spp. ) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 200 1- 2 005 Sinh viên thực hiện:. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký 12 2.4. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tich amino acid 13 v 2.4 .1. Sắc ký giấy (Paper chromatography) 13 2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography